Summary
Dans ce protocole, w e identifié une nouvelle population de cellules mélanocytes comme (également connu sous le nom mélanocytes cardiaques) dans le cœur des souris et des humains qui contribuent à une arythmie auriculaire déclenche chez la souris.
Abstract
Nous avons identifié une nouvelle population de cellules mélanocytes comme (également connu sous le nom mélanocytes cardiaques) dans le cœur des souris et des humains qui contribuent aux déclencheurs de l'arythmie auriculaire chez la souris. Pour étudier les propriétés électriques et biologiques des mélanocytes cardiaques, nous avons développé une procédure pour les isoler de coeurs de souris que nous avons tirés de celles qui visent à isoler les cardiomyocytes murins néonataux. Afin d'obtenir des mélanocytes cardiaques saines appropriés pour plus vaste patch clamp ou des études biochimiques, nous avons développé une procédure raffinée pour isoler et placage mélanocytes cardiaques basés sur ceux à l'origine conçu pour isoler les mélanocytes cutanés. La procédure est mise en évidence raffiné dans cette revue et produit un plus grand nombre de cellules saines comme des mélanocytes, qui peuvent être étalées en une population pure ou avec des cardiomyocytes.
Introduction
Nous avons récemment identifié une nouvelle population de cellules dans le cœur de souris et les humains qui expriment des enzymes mélanine synthèse et ressemblent morphologiquement mélanocytes cutanés. Nous avons appelé de mélanocytes cardiaques »ces cellules et avons découvert qu'ils sont présents dans des endroits anatomiques dont arythmie auriculaire déclenche proviennent souvent chez l'homme. Nous avons également constaté mélanocytes cardiaques contribuent à des arythmies auriculaires chez la souris avec la suppression de la lignée germinale DCT. Mélanocytes cardiaques sont peu distribués dans l'atrium de la souris où elles contiennent moins de 0,1% de toutes les cellules auriculaires. Pour étudier les propriétés électriques et biologiques des mélanocytes cardiaques, nous avons développé une procédure pour les isoler du cœur de la souris en utilisant des marqueurs spécifiques mélanocytes Cre inductible. Notre procédure initiale a été développé à partir de ceux utilisés pour isoler les cardiomyocytes murins néonataux et donné de très petits nombres de cellules appropriées pour les enregistrements de patch-clamp ou analyse par PCR. Cependant, pour améliorer la guérisone et la viabilité des mélanocytes cardiaques, pour plus d'une analyse en profondeur électrophysiologique ou des études biochimiques, nous avons développé une procédure raffinée de celles qui visent à isoler les mélanocytes cutanés. Le procédé décrit et démontré dans la présente étude a pour avantage de produire des mélanocytes sains cardiaques qui peuvent être étalées en une population pure ou avec des cardiomyocytes.
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Protocol
1 Préparation des solutions et des équipements nécessaires
- Tout d'abord, stériliser les instruments chirurgicaux (pinces droites de forme, pinces de forme incurvée, ciseaux de forme droite et ciseaux de forme incurvée) par les autoclavage pendant 15 min. à 121 ° C. Préparez 2 ensembles d'instruments, où un jeu est utilisé pour disséquer les cœurs et l'autre ensemble sera utilisé pour hacher le tissu.
- Dissoudre 1 sachet de MCDB153 milieux de culture dans 900 ml d'stérilisé, l'eau filtrée et remuer doucement jusqu'à ce que la poudre soit dissoute. Ajouter du bicarbonate de sodium 1,2 g, soit 15,7 ml d'une solution de bicarbonate de sodium [7,5% p / v], pour chaque litre de volume final du milieu en cours de préparation et agiter jusqu'à dissolution. Ajuster le pH à 7,2 en ajoutant soit du HCl 1 N ou NaOH 1 N, puis versez les médias à travers un filtre de 0,2 um haut de la bouteille dans des conditions stériles dans une hotte de culture tissulaire (enceinte de sécurité biologique). Ramassez ensuite les médias et le stocker à 4 ° C.
- Préparer les supplémentsajouter au milieu de culture (liste des matières). Les suppléments devraient être ajoutées au milieu juste avant les médias est nécessaire pour l'étalement des cellules.
- Préparer DPBS avec 10% de FBS, plus des antibiotiques (pénicilline et streptomycine).
- Ensuite, préparer une solution de trypsine à 0,25% par addition de 0,25 g de trypsine (de pancréas de bovin, l'activité> 2500 unités USP / mg, ultrapure, USB) à 100 ml de DPBS, plus des antibiotiques (pénicilline et streptomycine).
- Autre équipement requis nécessaire pour effectuer cette procédure comprend une loupe binoculaire, des boîtes de Pétri (10 cm), tubes coniques de 50 ml, crépines de cellules de 40 um, DPBS ainsi que des antibiotiques, des boîtes de culture de 60 mm et des boîtes de culture de 35 mm.
2 Isoler coeurs de néonatalogie chiots de souris
- Tout d'abord, obtenir P0 à P2 souriceaux nouveau-nés (n = 6 à 8). Il est recommandé d'utiliser les petits générés par l'élevage DCT-Cre femelles homozygotes avec des hommes qui sont hétérozygotes pour soit la R26R: EYFP allèle ou le Z / EG allèle pour marquer lecellules mélanocytes-comme. Les deux R26R: souris EYFP et Z / EG sont disponibles auprès de Jackson Laboratories (nombre d'actions 006 148 003 920 et, respectivement).
- Ensuite, euthanasier les souriceaux nouveau-nés, essuyer leurs coffres avec un tampon imbibé d'alcool, puis placer les chiots dans une boîte de Pétri 10 cm avec du DPBS.
- Couper la peau sur la poitrine et le sternum avec une pince et des ciseaux stérilisés puis ouvrir avec précaution la poitrine sous une loupe binoculaire. Les cœurs des souriceaux nouveau-nés sont très petites soyez donc prudent de s'assurer d'enlever le cœur entier avec les oreillettes attachés.
- Laver les coeurs dans DPBS et de les transférer à une nouvelle boîte de Pétri de 10 cm.
3 Digestion enzymatique
- Apportez la boîte de Petri avec les coeurs excisés à une hotte de culture tissulaire (enceinte de sécurité biologique) et puis suivez les étapes ci-dessous en utilisant des techniques stériles dans la hotte.
- D'abord, lavez les cœurs trois fois dans du DPBS stériles ainsi que des antibiotiques.
- Placez les coeurs (n = 6-8) dans un60 mm boîte de culture et ajouter 8.6 ml de solution de trypsine à 0,5% dans le plat.
- Ensuite, coupez le cœur en petits morceaux (moins de 1 mm de diamètre) et incuber à 37 ° C pendant 30 min dans une atmosphère de CO 2 de 5%.
- Après la période d'incubation est terminée, verser la solution résultante du tissu cardiaque et de la trypsine à partir de la cuvette dans un tube conique de 50 ml stérile.
- Ensuite, en utilisant une pipette stérile de 10 ml, rapidement, mais doucement, triturer la solution dans le tube conique de 50 ml 30 à 50 heures.
- Filtrer la solution résultante à travers un tamis cellulaire de 40 um sur un nouveau tube conique propre, de 50 ml à recueillir le filtrat.
- Ensuite, centrifuger le tube de 50 ml à 240 x g dans une centrifugeuse de table pendant 5 minutes à température ambiante. Ensuite, aspirer délicatement le surnageant et remettre le culot restant dans 6-8 ml de DPBS stériles. Répétez cette étape deux fois plus. Cette étape Granulés les myocytes auriculaires et les mélanocytes cardiaques mais n'apporte pas en bas de la fifibroblastes depuis les fibroblastes sont plus petits et restent dans le surnageant.
Les cellules 4 Placage cardiaque mélanocytes semblables
- Après la troisième centrifugation, après rinçage, ou bien drainer Aspirer la solution de lavage (DPBS) et remettre en suspension le culot dans 6 ml de milieu de culture MCDB à laquelle les suppléments ont été ajoutés.
- Maintenant, aspirer la solution concentré en suspension dans une pipette de transfert stérile et placer les cellules dans une boîte de 35 mm, ou dans un puits d'une plaque à 6 puits, et mettre en commun les cellules cardiaques isolées à partir de 3 souriceaux nouveau-nés dans un plat de 35 mm ou bien.
- Incuber les boîtes de nuit à 37 ° C dans une atmosphère de CO 2 de 5%, aspirer hors du milieu de culture avec des cellules seules, puis rincer les plaques une fois avec DPBS. Puis ajouter du milieu frais pour les plaques et remplacer les médias tous les 2 jours. Des cellules isolées à partir de cœurs néonataux ou embryonnaires peuvent être maintenues en culture pendant 3 semaines, alors que les cellules isolées à partir entendre adultets peuvent être maintenues en culture pendant 10 jours.
Les cellules 5 isolation cardiaque Melanocyte-comme de Coeur Adulte souris
- D'abord, enlever le cœur de souris matures (âgés de 3-4 semaines-, n = 3) par une sternotomie ligne médiane après l'administration d'héparine de 100 U par voie intrapéritonéale à des souris, puis de les euthanasier. Il est recommandé d'utiliser du pentobarbital pour euthanasier les souris de cette procédure, mais ce médicament n'est pas disponible dans tous les lieux.
- Ensuite, laver les cœurs excisés dans DPBS stériles contenant des antibiotiques dans une hotte de culture tissulaire (enceinte de sécurité biologique). Pincez les coeurs légèrement avec une pince de dissection courbes pour retirer toute trace de sang restant d'eux, puis rincez les cœurs dans DPBS une fois de plus.
- Retirer les oreillettes et anneau auriculo-ventriculaire du cœur (ces structures contiennent les cellules mélanocytes-like) et placer les échantillons de tissus excisés dans un plat de 35 mm.
- Couper les cœurs en petits morceaux avec des ciseaux courbes et vigueurps, puis ajouter 8.6 ml de solution de trypsine à 0,5% dans le plat. Ensuite, incuber les boîtes à 37 ° C pendant 45 à 60 min.
- Maintenant, suivez les étapes de la procédure ci-dessus à partir de l'étape 3.6 partir.
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Representative Results
Le protocole décrit dans cet article est une technique améliorée par rapport à celle que nous avons déjà publié pour isoler les mélanocytes cardiaques du cœur murin. Ce procédé emploie l'utilisation de marqueurs fluorescents entraînés par la synthèse de mélanine spécifique de l'enzyme Cre-recombinase pour marquer les cellules de mélanocytes analogue cardiaques. Il est important d'utiliser un marqueur pour marquer les mélanocytes cardiaques lorsque vous travaillez avec des cellules embryonnaires ou néonatales fraîchement isolés, car les différences morphologiques qui distinguent les mélanocytes cardiaques de myocytes auriculaires n'ont pas encore développé (figure 1A). Comme le montre la figure 1A lorsque l'étape d'isolement s'est bien passé, un assez grand nombre de myocytes auriculaires et les mélanocytes cardiaques adhère à la boîte de laminine recouvert de quelques cellules non-adhérentes. Dans ce cas, les cellules adhérentes apparaîtront à plat sur le fond du plat (flèches jaunes Figure 1A, pointes de flèche). D'autre part, lorsque le procédure ne fonctionne pas bien la plupart des cellules sera non-adhérent et regarde souvent sphérique et arrondie (pointes de flèches bleu clair, figure 1A).
Lorsque les cellules isolées sont visualisés en utilisant l'imagerie de fluorescence verte, il est clair que les cellules mélanocytes sont cardiaques et qui sont les cellules myocytes auriculaires (Figure 1). Comme mentionné ci-dessus dans le protocole (étape 3.9), les fibroblastes sont éliminés de l'ensemble de cellules isolées à l'aide auriculaires à faible force de centrifugation que les granulés les plus gros et les myocytes auriculaires cardiaques mélanocytes, mais n'apporte pas vers le bas les fibroblastes cardiaques plus petites. Les cellules fraîchement isolées peuvent maintenant être utilisés pour les enregistrements électrophysiologiques de la cellule unique (figure 2), seule l'analyse de l'ARN de la cellule ou des dosages biochimiques.
Nous avons aussi cultivé et maintenu cellules auriculaires néonatales ou embryonnaires isolées en utilisant ce protocole pour un maximum de 21 jours. En utilisant les conditions de culture décrites dans le présentprotocole, les cellules mélanocytes comme cardiaques vont encore se différencier et de proliférer, alors que les myocytes auriculaires tendance à se détacher de l'antenne et mourir dans les 2-3 jours après ils sont isolés. Présentés dans la figure 3A sont mélanocytes cardiaques saines 5 jours après qu'ils ont été isolés à partir d'un cœur de souris néonatale. Noter l'absence de myocytes auriculaires autour de ces cellules (par opposition aux cellules fraîchement isolées représentées sur la figure 1). En outre, ces mélanocytes cardiaques ont élaboré un vaste processus dendritiques et ressemblent étroitement mélanocytes cutanés qui ont également été dans la culture pour le même nombre de jours (figure 3B).
Figure 1 représentant (A) et DIC (B) des images de la GFP fraîchement icellules auriculaires solated à partir d'un embryon (E19.5) DCT-Z / EG chiot de la souris. La flèche blanche indique le mélanocytes cardiaque dans les deux panneaux. A noter que, sans l'aide du marqueur fluorescent, le mélanocyte cardiaque est difficile d'identifier et de distinguer des myocytes auriculaires (pointes de flèche jaune) fixés au plat. Les pointes de flèches bleu clair indiquent les cellules auriculaires qui ne sont pas bien attachés à l'antenne.
Figure 2 Dct - / - mélanocytes cardiaques démontrer action prolongée la durée du potentiel. Enregistrements de courant avec les pinces de (A) Dct cardiaque +/- et (B) Dct cardiaque - / - cellules démontrent augmenté durée potentielle d'action en l'absence de Dct. Potentiel de repos de la cellule +/- DCT -62 mV, tandis que le Dct - / - cellule a un potentiel de repos de-60 MV. Reproduit avec permission, de Levin et al. J. Clin. Investir. 119, 2920-2936 (2009).
Figure 3 images représentatives de isolé (A) cellules mélanocytes comme cardiaques et (B) mélanocytes cutanés. Les mélanocytes ont été isolés à partir des coeurs et la peau de souris néonatale (P1), respectivement, et ensuite mises en culture pendant 5 jours.
Figure 4: cellules du TCD exprimant peuplent le cœur. (A) L'hybridation in situ d'un coeur E13.5 de la souris montre l'expression Dct(flèches pleines) autour de l'orifice de la veine pulmonaire (flèche ouverte). (B) La coloration par immunofluorescence de cellules Dct-positifs (pointes de flèches) dans les veines pulmonaires. (C) la coloration X-gal des cellules DCT-positifs dans l'oreillette postérieure d'une souris E16,5 DCT-LacZ cœur (flèches). (D) la coloration X-gal dans une E17.5 DCT-LacZ cœur de la souris sur le septum RA dans les régions du foramen ovale, de sinus coronaire os et la veine cave inférieure; échelle encart = 500 um. (E) de la souris adulte (p60) résultant du croisement d'un DctCre +/- et R26R souris montre les cellules positives LacZ (flèches) dans les veines pulmonaires et l'oreillette gauche. les cellules (F) DCT-positifs détectés par coloration immunofluorescente (flèches) sur l'endothélium de la veine pulmonaire humain enlevée chirurgicalement. Échelle = 500 um dans tous les panneaux sauf panneaux (B et D; échelle = 100 pm) et le panneau (F; échelle = 50 pm). Abréviations: PV, la veine pulmonaire; LA, oreillette gauche; Ao, aorte; PA, pulmoartère naire; RA, l'oreillette droite; IVC, la veine cave inférieure; FO, le foramen ovale; CS, sinus coronaire. Reproduit avec permission, de Levin et al. J. Clin. Investir. 119, 2920-2936 (2009).
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Discussion
Mélanocytes cardiaques sont présents dans des endroits anatomiques dans le cœur qui donnent souvent lieu à des déclencheurs d'arythmie auriculaire. Ces régions comprennent les veines pulmonaires, l'anneau auriculo-ventriculaire, l'oreillette gauche postérieure et le foramen ovale (figure 4). Pour comprendre le rôle de ces cellules jouent dans arythmogénèse, nous développons des techniques de les isoler et d'étudier leur physiologie. Cependant, nous avons constaté que l'amélioration de cette technique pour obtenir des quantités plus sains et plus grandes de mélanocytes cardiaques permettraient de nouvelles études pour étudier la réponse des mélanocytes cardiaques à des stimuli exogènes. Par ailleurs, l'amélioration des techniques d'isolement peuvent aussi permettre des études pour étudier l'interaction des mélanocytes cardiaques avec les myocytes auriculaires en physiologie normale et la maladie.
Cet article décrit une procédure pour isoler des cellules mélanocytes comme viables au coeur de la souris que nous avons développé des protocoles visant à Isolmangé les mélanocytes de la peau. L'étape critique dans ce protocole est d'extraire les cellules mélanocytes comme du cœur. Tout en isolant les mélanocytes cardiaques de coeurs néonatale est relativement simple, l'extraction de mélanocytes cardiaques du cœur maturité est beaucoup plus difficile en raison de l'augmentation du montant de la fibrose interstitielle. Dans ce protocole, nous avons utilisé digestion par la trypsine à extraire des cellules mélanocytes comme du cœur mature. Pour développer ce protocole, nous avons testé plusieurs combinaisons différentes enzymatiques qui se composait de diverses concentrations de trypsine, la collagénase, et dispase.
Nous avons constaté que le traitement oreillettes néonatale avec une combinaison de la collagénase (pour les 30 premières minutes), suivie par la trypsine (pour les 15 prochaines minutes) initialement produit des rendements plus élevés de cellules mélanocytes-like, mais les cellules isolées étions en moins bonne santé avec une diminution de la viabilité. D'autre part, la digestion par la trypsine seule a produit un nombre moyen de cellules mélanocytes, comme sains de mature coeurs de souris. Par conséquent, nous recommandons simplement en utilisant la trypsine pour isoler des cellules mélanocytes comme de coeurs de souris adultes. En outre, nous avons constaté que la trituration vigoureusement la suspension produite après digestion à la trypsine de cœurs de souris adultes a amélioré le rendement de cellules mélanocytes analogue viables. Il convient de mentionner que la trypsine a le potentiel pour digérer partiellement canaux membranaires ou des porteurs de charge, ce qui peut affecter la densité de la chaîne lorsque la réalisation d'études de patch clamp. Alors que nous n'avons pas procédé à une analyse rigoureuse afin de déterminer si digestion par la trypsine affecte la densité de courant des cellules mélanocytes comme isolés, matures, nous n'avons pas remarqué d'effets significatifs sur les courants ou potentiels d'action dans les études que nous avons effectuées en utilisant ce protocole.
Cellules mélanocytes analogue cardiaques sont une population de cellules très faible dans le cœur (moins de 0,1% de toutes les cellules auriculaires) qui ressemble morphologiquement mélanocytes cutanés (Figure 1 et Figure 3 </ Strong>). En raison du fait qu'il ya relativement peu de mélanocytes cardiaques présents dans le cœur; jusqu'à récemment, nous avons seulement été en mesure de les utiliser pour les essais mono-cellulaires (c.-à-correctif enregistrement de serrage ou une seule cellule PCR). Cependant, nous avons obtenu de grandes quantités de mélanocytes cardiaques en mettant en commun 20-30 néonatale, ou 5-8 coeurs matures, et j'ai trouvé cette approche produit une quantité suffisante de tissu pour effectuer immunoblot ou dosages biochimiques. En outre, étant donné le faible nombre de cellules mélanocytes comme dans le cœur de souris, d'améliorer le rendement de ces cellules après qu'ils ont été isolés nous placent souvent 15-20 mm circulaire, Teflon insère sur les boîtes de 35 mm à l'aide de graisse à vide stérilisé . Les cellules peuvent alors être placés à l'intérieur des inserts pour réduire la zone de placage et augmente leur densité. Utilisation Teflon insère également d'améliorer la viabilité des cellules mélanocytes, comme suite à leur isolement, et au cours de la période de placage ainsi.
Certains mélano cardiaquecellules Cyte comme ont une isolation morphologie suivante bipolaire, qui nous croyons représente un état moins différencié de ces cellules. En outre, nous avons constaté que la culture de mélanocytes cardiaques pendant 3 jours après l'isolement semble induire une différenciation supplémentaire du phénotype des mélanocytes comme lorsque les cellules commencent à former des dendrites. Nous avons également constaté ce protocole donne cellules mélanocytes comme des cœurs matures qui peuvent être maintenues pendant 10 jours de culture. Cependant, au-delà de 10 jours en culture des cellules mélanocytes comme isolés de coeurs matures vont arrêter de proliférer et devenir sénescentes. Mélanocytes cardiaques isolés et plaqués peuvent être utilisés pour l'analyse électrophysiologique cellulaire ou autre analyse de biologie moléculaire / cellulaire telles que le profilage ou études ARN pour évaluer leurs réactions physiologiques à des facteurs exogènes.
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Disclosures
Nous n'avons rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par les Instituts nationaux de la Santé récompense R01 HL105734 à VVPMDL est pris en charge, en partie, par les instituts nationaux de recherche en santé Career Award K08 HL094748. VVP est une chercheuse novatrice de l'American Heart Association soutien d'une subvention 11IRG900384.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCDB 153 | Sigma-Aldrich | M7403 | Dissolve in water |
| DPBS, no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190136 | Stock conc.: 1x Working conc.: 1x |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140163 | Stock conc.: 100x Working conc.: 1x |
| Fetal Bovine Serum | Life Technology | Certified | Working conc.: 4% |
| TPA | Sigma-Aldrich | P1585 | Dissolve in DMSO Stock conc.: 3.2 μM Working conc.: 32 nM |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | Dissolve in DPBS Stock conc.: 0.1 mg/ml Working conc.: 1 μg/ml |
| Dibutyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | Dissolve in DPBS Stock conc.: 0.5 mM Working conc.: 5 μM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | Dissolve in 10 mM acetic acid Stock conc.: 1 mg/ml Working conc.: 5 μg/ml |
| Basic FGF | BD Biosciences | 354060 | Dissolve in water Stock conc.: 4 ng/μl Working conc.: 4 ng/ml |
References
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