Summary
En este protocolo, w e identificado una nueva población de células melanocitos como (también conocido como melanocitos cardíacos) en los corazones de los ratones y los seres humanos que contribuyen a la arritmia auricular provoca en ratones.
Abstract
Identificamos una nueva población de células melanocitos como (también conocido como melanocitos cardíacos) en los corazones de los ratones y los seres humanos que contribuyen a los factores desencadenantes de arritmia auricular en ratones. Para investigar las propiedades eléctricas y biológicas de los melanocitos cardíacos se desarrolló un procedimiento para aislarlos de los corazones del ratón que deriva de los diseñados para aislar los cardiomiocitos murinos neonatales. A fin de obtener los melanocitos cardíacos saludables adecuados para más extensa de patch clamp o estudios bioquímicos, hemos desarrollado un procedimiento de refinado para aislar y chapado melanocitos cardíacos basados en los diseñado originalmente para aislar los melanocitos cutáneos. El procedimiento de refinado se demuestra en esta revisión y produce un mayor número de células melanocitos como saludables que pueden sembrarse como una población pura o con cardiomiocitos.
Introduction
Recientemente hemos identificado una población de células novela en el corazón de los ratones y los seres humanos que expresan enzimas melanina-síntesis y se asemejan morfológicamente a los melanocitos cutáneos. Llamamos 'melanocitos cardíacos' estas células y encontramos que están presentes en localizaciones anatómicas de la que la arritmia auricular desencadena a menudo se originan en los seres humanos. También encontramos melanocitos cardiacos contribuyen a las arritmias auriculares en ratones con deleción de la línea germinal de Dct. Melanocitos cardíacos se distribuyen escasamente lo largo de la aurícula del ratón donde se comprenden menos del 0,1% de todas las células auriculares. Para investigar las propiedades eléctricas y biológicas de los melanocitos cardíacos hemos desarrollado un procedimiento para aislarlos del corazón de ratón utilizando marcadores específicos de melanocitos Cre-inducible. Nuestro procedimiento inicial se desarrolló a partir de los que se usan para aislar los cardiomiocitos murinos neonatales y dado muy pequeños números de células adecuados para las grabaciones de patch clamp o análisis de PCR. Sin embargo, para mejorar la curarª y la viabilidad de los melanocitos cardíacos, por más profundo análisis electrofisiológico o estudios bioquímicos, se desarrolló un procedimiento de refinado de los diseñados para aislar los melanocitos cutáneos. El procedimiento descrito y demostrado en esta revisión tiene la ventaja de producir melanocitos cardíacos saludables que pueden sembrarse como una población pura o con cardiomiocitos.
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Protocol
1. Preparar las soluciones y equipos necesarios
- En primer lugar, esterilizar los instrumentos quirúrgicos (pinzas rectas forma, fórceps forma curvada, tijeras de formas rectas y tijeras de formas curvas) en autoclave durante 15 min. a 121 ° C. Prepare 2 juegos de instrumentos, donde se utiliza un conjunto para la disección de los corazones y el otro conjunto se utilizarán para picar el tejido.
- Disuelva 1 paquete de MCDB153 medios de cultivo en 900 ml de esterilizado, agua filtrada y revuelva lentamente hasta que el polvo se haya disuelto. Añadir 1,2 g de bicarbonato de sodio, o 15,7 ml de solución de bicarbonato de sodio [7,5% w / v], por cada litro de volumen final de medio que se preparó y se agita hasta que se disuelva. Ajustar el pH a 7,2 mediante la adición de cualquiera de 1 N HCl o NaOH 1 N, y luego verter los medios de comunicación a través de un filtro de 0,2 micras superior botella en condiciones estériles en una campana de cultivo de tejidos (gabinete de bioseguridad). Luego recoger los medios de comunicación y almacenarla a 4 ° C.
- Preparar los suplementosañadir al medio de cultivo (Lista de Materiales). Los suplementos deben añadirse a los medios de comunicación justo antes de los medios de comunicación es necesaria para el recubrimiento de las células.
- Preparar DPBS con 10% de FBS más antibióticos (penicilina y estreptomicina).
- A continuación, preparar una solución de tripsina al 0,25% mediante la adición de 0,25 g de tripsina (páncreas bovino, actividad> 2500 unidades USP / mg, ultrapura; USB) a 100 ml de DPBS más antibióticos (penicilina y estreptomicina).
- Otro equipo requerido necesario para completar este procedimiento incluyen un microscopio estereoscópico, placas Petri (10 cm), tubos cónicos de 50 ml, coladores de células de 40 micras, DPBS más antibióticos, placas de cultivo de 60 mm y placas de cultivo de 35 mm.
2. Aislar Corazones de Neonatología mouse Pups
- En primer lugar, obtener P0 a P2 crías de ratón neonatal (n = 6 a 8). Se recomienda utilizar los cachorros generados por la cría de DCT-Cre hembras con los machos homocigotos que son heterocigotos para ya sea el alelo R26R: EYFP o la Z / EG alelo para etiquetar elcélulas melanocitos similares. Tanto R26R: ratones EYFP y Z / EG están disponibles de Jackson Laboratories (números de existencias 006.148 y 003.920, respectivamente).
- A continuación, la eutanasia a las crías de ratón neonatales, limpie el pecho con un algodón con alcohol y luego colocar los cachorros en una placa de 10 cm de Petri con DPBS.
- Cortar la piel sobre el pecho y el esternón con pinzas y tijeras esterilizadas y luego abrir el pecho cuidadosamente bajo un microscopio estereoscópico. Los corazones de crías de ratón neonatales son muy pequeñas, así que tenga cuidado para asegurarse de extirpar todo el corazón con las aurículas adjuntos.
- Lavar los corazones en DPBS y transferirlos a una nueva placa de 10 cm Petri.
3. digestión enzimática
- Llevar la placa de Petri con los corazones extirpados a una campana de cultivo de tejidos (gabinete de bioseguridad) y siga los pasos a continuación utilizando técnicas estériles en la campana.
- En primer lugar, lavar el corazón tres veces en DPBS estériles más antibióticos.
- Coloca los corazones (n = 6-8) en un60-mm placa de cultivo y añadir 6-8 ml de solución de tripsina al 0,5% al plato.
- A continuación, cortar los corazones en trozos pequeños (menos de 1 mm de tamaño) y los incuban a 37 ° C durante 30 min en una atmósfera de CO2 al 5%.
- Después del período de incubación es completa, se vierte la solución resultante del tejido cardíaco y la tripsina de la placa en un tubo cónico de 50 ml estéril.
- Luego, utilizando una pipeta estéril de 10 ml, rápidamente, pero suavemente, se tritura la solución en el tubo cónico de 50 ml 30-50 veces.
- Se filtra la solución resultante a través de un filtro de células de 40 m en la parte superior de un nuevo tubo cónico de 50 ml limpio, para recoger el filtrado.
- A continuación, se centrifuga el tubo de 50 ml a 240 x g en una centrífuga de mesa durante 5 min a temperatura ambiente. Luego, aspirar suavemente el sobrenadante y resuspender el sedimento restante en 6-8 ml de DPBS estériles. Repita este paso 2 veces más. Este paso Bolitas de los miocitos auriculares y melanocitos cardíacos, pero no bajar la fifibroblastos desde los fibroblastos son más pequeños y permanecerán en el sobrenadante.
Las células 4. Plating cardíaca melanocitos como
- Tras el tercer enjuague después de la centrifugación, cuidadosamente drenar o aspirar fuera de la solución de lavado (DPBS) y resuspender el precipitado en 6 ml de medios de cultivo MCDB al que se han añadido los suplementos.
- Ahora, dibuja la solución resuspendido en una pipeta de transferencia estéril y colocar las células en una placa de 35 mm, o en un pocillo de una placa de 6 pocillos, y poner en común las células cardíacas aisladas de 3 ratones recién nacidos en una placa de 35 mm o así.
- Incubar los platos durante la noche a 37 ° C en una atmósfera de CO2 al 5%, aspirar fuera de los medios de cultivo junto con las células no unidas y luego enjuague las placas una vez con DPBS. A continuación, añadir medio fresco a las placas y vuelva a colocar los medios de comunicación cada 2 días. Células aisladas de corazones neonatales o embrionarias se pueden mantener en cultivo durante un máximo de 3 semanas, mientras que las células aisladas de oír adultosts se pueden mantener en cultivo durante un máximo de 10 días.
Las células 5. Isolating cardíaca melanocitos como de corazón de ratón adulto
- En primer lugar, eliminar los corazones de ratones maduros (3-4 semanas de antigüedad, n = 3) a través de una esternotomía de línea media después de la administración de heparina 100 U intraperitoneal a los ratones y luego la eutanasia de ellos. Se recomienda el uso de pentobarbital para practicar la eutanasia a los ratones para este procedimiento, pero este fármaco no está disponible en todas las ubicaciones.
- A continuación, lavar los corazones extirpados en DPBS estériles que contienen antibióticos en una campana de cultivo de tejidos (gabinete de bioseguridad). Apriete los corazones ligeramente con unas pinzas de disección curvas para eliminar la sangre que queda de ellos y luego enjuague los corazones en DPBS una vez más.
- Retire las aurículas y el anillo atrioventricular de los corazones (estas estructuras contienen las células melanocitos similares) y colocar las muestras de tejidos extirpados en una placa de 35 mm.
- Cortar los corazones en trozos pequeños con unas tijeras curvas y fuerzaps y luego añadir 6-8 ml de solución de tripsina al 0,5% al plato. Incubar los platos a 37 ° C durante 45-60 min.
- Ahora, siga los pasos del procedimiento anterior desde el paso 3.6 en adelante.
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Representative Results
El protocolo descrito en este artículo es una técnica mejorada en comparación con la que previamente publicados para el aislamiento de melanocitos cardíacos del corazón murino. Este procedimiento emplea el uso de marcadores fluorescentes impulsados por la síntesis de melanina-enzima Cre-recombinasa específica para marcar las células melanocitos como cardíacas. Es importante usar un marcador para etiquetar melanocitos cardíacos cuando se trabaja con células embrionarias o neonatales recién aislados, puesto que las diferencias morfológicas que distinguen melanocitos cardíacos de miocitos auriculares aún no han desarrollado (Figura 1A). Como se muestra en la Figura 1A cuando la etapa de aislamiento ha ido bien, un número bastante grande de los miocitos auriculares y melanocitos cardíacos se adherirá al plato laminina recubierto con sólo unas pocas células no adherentes. En este caso aparecerá plana en la parte inferior del plato (puntas de flecha de color amarillo Figura 1A, punta de flecha) las células adherentes. Por otra parte, cuando el procedure no funciona bien la mayoría de las células será no adherente y con frecuencia parezca esférico y redondeado (puntas de flecha de color azul claro, Figura 1A).
Cuando las células aisladas se visualizaron utilizando imágenes de fluorescencia verde, está claro que las células son melanocitos cardíacas y el que las células son miocitos auriculares (Figura 1). Como se mencionó anteriormente en el protocolo (etapa 3.9), los fibroblastos se eliminan de la piscina de las células aisladas utilizando auriculares de baja fuerza de centrifugación que Bolitas de los miocitos auriculares más grandes y melanocitos cardíacos, pero no reducir los fibroblastos cardíacos más pequeños. Las células recién aisladas ahora pueden ser utilizados para una sola célula de registros electrofisiológicos (Figura 2), análisis de ARN sola célula o ensayos bioquímicos.
También tenemos culta y mantuvimos células auriculares neonatales o embrionarias aisladas usando este protocolo para un máximo de 21 días. Usando las condiciones de cultivo descritas en esteprotocolo, las células melanocitos como cardíacas serán más diferenciarse y proliferar, mientras que los miocitos auriculares tienden a separarse del plato y mueren dentro de 2-3 días después de que se aíslan. Se muestra en la Figura 3A son melanocitos cardíacos saludables 5 días después de que se aislaron de un corazón neonatal ratón. Tenga en cuenta la falta de cualquier miocitos auriculares alrededor de estas células (en comparación con las células recién aisladas que se muestran en la Figura 1). Además, estos melanocitos cardíacos han desarrollado amplios procesos dendríticas y se parecen mucho a los melanocitos cutáneos que también han estado en la cultura para el mismo número de días (Figura 3B).
Figura 1. Representante (A) DIC y (B) de imágenes GFP recién icélulas auriculares Solated de un embrionario (E19.5) Dct-Z / EG crías de ratón. La flecha blanca identifica el melanocito cardíaca en ambos paneles. Tenga en cuenta que sin la ayuda del marcador fluorescente, el melanocito cardíaco es difícil de identificar y distinguir de los miocitos auriculares (puntas de flecha amarillo) unidas a la placa. Las puntas de flecha de color azul claro apuntan a células auriculares que no están bien conectados a la placa.
Figura 2. Dct - / - melanocitos cardíacos demostrar una acción prolongada duración del potencial. Clamp grabaciones actuales de (A) Dct cardiaca +/- y (B) cardiaca Dct - / - células muestran una mayor duración potencial de acción en ausencia de Dct. Potencial de reposo de la célula Dct +/- es -62 mV, mientras que el Dct - / - célula tiene un potencial de reposo de-60 MV. Reproducido, con autorización, de Levin et al. J. Clin. . Invertir 119, 2920-2936 (2009).
Figura 3. Imágenes representativas de aislados (A) las células melanocitos como cardíacas y (B) los melanocitos cutáneos. Los melanocitos se aislaron de los corazones y de la piel de ratones recién nacidos (P1), respectivamente, y después se cultivaron durante 5 días.
Figura 4. células que expresan DCT-pueblan el corazón. (A) La hibridación in situ de un corazón de ratón E13.5 muestra la expresión Dct(flechas negras) alrededor del orificio de la vena pulmonar (punta de flecha abierta). (B) tinción de inmunofluorescencia de las células DCT-positivos (puntas de flecha) dentro de las venas pulmonares. (C) la tinción con X-gal de las células DCT-positivos en la aurícula posterior de un ratón E16.5 DCT-LacZ corazón (flechas). (D) la tinción con X-gal en una E17.5 DCT-LacZ corazón de ratón a lo largo del tabique RA en las regiones del foramen oval, OS seno coronario y la vena cava inferior; escala de inserción = 500 m. (E) de ratón adulto (p60) como resultado de cruzar un DctCre +/- y R26R ratón demuestra células positivas LacZ (flechas) dentro de las venas pulmonares y la aurícula izquierda. células (F) Dct-positivos detectados por tinción de inmunofluorescencia (flechas) en el endotelio de la vena pulmonar humano extirpado quirúrgicamente. Escala = 500 micras en todos los paneles excepto paneles (B y D; escala = 100 m) y el panel (F; escala = 50 micras). Abreviaturas: PV, vena pulmonar; LA, la aurícula izquierda; Ao, aorta; PA, pulmoarteria nario; RA, aurícula derecha; VCI, vena cava inferior; FO, foramen oval; CS, seno coronario. Reproducido, con autorización, de Levin et al. J. Clin. . Invertir 119, 2920-2936 (2009).
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Discussion
Melanocitos cardíacos están presentes en localizaciones anatómicas dentro del corazón que normalmente dan lugar a los factores desencadenantes de arritmia auricular. Estas regiones incluyen las venas pulmonares, el anillo atrioventricular, la aurícula izquierda posterior y el foramen oval (Figura 4). Para entender el papel que estas células juegan en arritmogénesis, desarrollamos técnicas para aislar a ellos y estudiar su fisiología. Sin embargo, nos dimos cuenta de que la mejora de esta técnica para producir cantidades más saludables y de mayor tamaño de los melanocitos cardíacos permitirían realizar más estudios para investigar la respuesta de los melanocitos cardíacos a los estímulos exógenos. Además, la mejora de las técnicas de aislamiento también pueden permitir estudios para investigar la interacción de los melanocitos cardiacas con miocitos auriculares durante la fisiología normal y la enfermedad.
En este trabajo se describe un procedimiento para aislar las células melanocitos como viables desde el corazón de ratón que hemos desarrollado desde protocolos diseñados para Isolcomieron los melanocitos de la piel. El paso crítico en este protocolo es la extracción de las células melanocitos como desde el corazón. Mientras que el aislamiento de melanocitos cardiacos de los corazones neonatales es relativamente sencillo, la extracción de los melanocitos cardíacos del corazón maduro es mucho más difícil debido a la mayor cantidad de fibrosis intersticial. En este protocolo se utilizó digestión con tripsina para extraer las células melanocitos como desde el corazón maduro. Para desarrollar este protocolo hemos probado varios diferentes combinaciones enzimáticas que consistían en varias concentraciones de tripsina, colagenasa y dispasa.
Hemos encontrado que el tratamiento de las aurículas neonatales con una combinación de colagenasa (para los primeros 30 minutos), seguido de la tripsina (para el próximo 15 min) produce inicialmente un mayor rendimiento de las células melanocitos similar, pero las células aisladas eran menos saludable con disminución de la viabilidad. Por otra parte, la digestión con tripsina produce solo un número moderado de células melanocitos como sanos de mcorazones ratura ratón. Por lo tanto, se recomienda sólo usar tripsina para aislar las células melanocitos maduros como de corazones murinos. Además, encontramos que la trituración vigorosamente la suspensión producida después de la digestión con tripsina de corazones de ratones maduros mejoró el rendimiento de las células melanocitos como viables. Hay que mencionar que la tripsina tiene el potencial para digerir parcialmente los canales de membrana o portadores de carga, y esto puede afectar la densidad de canal cuando se realizan estudios de patch clamp. Si bien no hemos llevado a cabo un análisis riguroso para determinar si la digestión de tripsina afecta la densidad de corriente de las células melanocitos como aisladas, maduras no hemos notado ningún efecto significativo en las corrientes o potenciales de acción en los estudios que hemos realizado utilizando este protocolo.
Células melanocitos como cardiacas son una población celular muy escaso en el corazón (menos de 0,1% de todas las células auriculares) que se asemeja morfológicamente melanocitos cutáneos (Figura 1 y Figura 3 </ Strong>). Debido al hecho de que hay relativamente pocos melanocitos cardiacos presentes en el corazón; hasta hace poco tiempo sólo hemos sido capaces de utilizarlos para los ensayos de una sola célula (es decir, la grabación de patch clamp o de una sola célula PCR). Sin embargo, hemos obtenido grandes cantidades de melanocitos cardíacas mediante la agrupación de 20-30 neonatal, o 5-8 corazones maduros, y se encontró este enfoque produce una cantidad suficiente de tejido para la realización de inmunotransferencia o ensayos bioquímicos. Por otra parte, dado el bajo número de células melanocitos como en el corazón murino, para mejorar el rendimiento de estas células después de que hayan sido aislados vamos a menudo colocar 15-20 mm circular, Teflon inserta en los platos de 35 mm utilizando grasa de vacío esterilizada . Las células pueden entonces ser colocados dentro de los insertos para reducir el área de chapado y aumenta su densidad. Uso de teflón inserta también mejora la viabilidad de las células melanocitos como después de su aislamiento y durante el período de chapado también.
Algunos melano cardiacacélulas-cyte como tienen una morfología bipolar después del aislamiento, que creemos que representa un estado menos diferenciado de estas células. Además, se encontró que el cultivo de melanocitos cardíacos durante 3 días después del aislamiento parece inducir una mayor diferenciación del fenotipo de los melanocitos como donde las células comienzan a formar dendritas. También hemos encontrado este protocolo produce células melanocitos como de corazones maduros que se pueden mantener hasta por 10 días en cultivo. Sin embargo, más allá de 10 días en las células melanocitos como cultura aisladas de corazones maduros se dejan de proliferar y pueden llegar a ser senescentes. Melanocitos cardiacas aisladas y chapados se pueden utilizar para el análisis electrofisiológico celular u otro análisis biológico molecular / celular, tales como perfiles de ARN o estudios para evaluar sus respuestas fisiológicas a factores exógenos.
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Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Esta labor fue apoyada por los Institutos Nacionales de Salud premio R01 HL105734 a VVPMDL se apoya, en parte, por los Institutos Nacionales de la Salud Carrera de Investigación Premio K08 HL094748. VVP es un investigador innovador de la Asociación Americana del Corazón con el apoyo de subvención 11IRG900384.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCDB 153 | Sigma-Aldrich | M7403 | Dissolve in water |
| DPBS, no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190136 | Stock conc.: 1x Working conc.: 1x |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140163 | Stock conc.: 100x Working conc.: 1x |
| Fetal Bovine Serum | Life Technology | Certified | Working conc.: 4% |
| TPA | Sigma-Aldrich | P1585 | Dissolve in DMSO Stock conc.: 3.2 μM Working conc.: 32 nM |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | Dissolve in DPBS Stock conc.: 0.1 mg/ml Working conc.: 1 μg/ml |
| Dibutyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | Dissolve in DPBS Stock conc.: 0.5 mM Working conc.: 5 μM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | Dissolve in 10 mM acetic acid Stock conc.: 1 mg/ml Working conc.: 5 μg/ml |
| Basic FGF | BD Biosciences | 354060 | Dissolve in water Stock conc.: 4 ng/μl Working conc.: 4 ng/ml |
References
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