Summary
离子导入过程中细胞外的神经激动剂和拮抗剂
Abstract
从单个神经元在体内的录音，让调查员审查的神经元发射性能，例如，在对感官刺激的反应。神经元通常会收到多个传入和/或传出兴奋性和抑制性输入，相互融合，并最终测得的响应特性的神经元的神经整合这些投入驱动。为了研究在神经系统中的信息处理，它是必要理解的一个神经细胞或神经系统的各种输入，这些输入的特定属性。一个强大的和技术上相对简单的方法来评估一个给定的神经元接收的职能作用，一定的投入是动态的和可逆的抑制或消除这些投入，并测量这种操作所造成的神经元的输出的变化。这可以通过药理学改变神经元的直接环境与背叠多管ELECTR赞歌。这些电极由一个单一的筒记录电极和多管可携带多达4个不同的突触的激动剂或拮抗剂的药物电极。药物可以用于离子电渗疗法在所希望的时间，在实验过程中，允许时间控制送货和可逆的重新配置的突触输入。因此，药物的微环境是一个功能强大，无与伦比的操作方法来测试特定的假设有关的神经回路的功能。
在这里，我们描述，如何背驮式电极的制造，以及它们是如何在体内实验过程中使用的。背驮式系统允许研究者结合了单管的任意属性（电阻，针尖大小，形状等）的记录电极与多管药物电极。这是一个标准的多电极，所有的桶都或多或少类似的形状和性能的主要优势。多管Ë首次推出了超过lectrodes 40年前的1-3，经历了一些设计上的改进2,3，直到背驮式在20世纪80年代4,5。在这里，我们提出了一系列重要的改进，使脑深部渗透在动物体内制剂由于比较薄电极轴，使损害最小的完整的背驮式电极在实验室中生产。此外，这些电极，其特征在于由低噪声录音，并具有低电阻桶所需的药物非常有效的离子电渗疗法的药物。
Protocol
拉玻璃电极
拉玻璃电极- 拉出单桶电极使用单管玻璃毛细管用灯丝和拉小费测得的直径为约1-2微米，轴的长度为10-12毫米，和相应的约12兆欧姆（范围5-20兆欧姆）的电极电阻。在0.9％NaCl溶液。下电极的电阻会导致更多的背景活动从单个神经元中分离单一的活动，从而更加困难。对于拉动该电极，使用水平或垂直牵拉与任一加热丝或加热线圈。
- 拉出多管电极。由于更大的直径的多管玻璃和围绕整个多管受热均匀分布的需要，一个强大的牵拉与较大直径的加热线圈，不加热灯丝，是必要的。阿多管吸移管具有被插入在所述加热灯丝的中心与nO触点加热线圈。请注意，除了5桶移液器这里描述，3 - 的桶或7镜筒移液器是市售的替代品。拉出的玻璃吸移管前端的总直径约10微米，或更小。在下一步骤中的正确的直径的前端将被打破，因此，其准确的笔尖的大小比的整体形状的电极头中，这应该是长期的和相对薄的，在提拉过程中不太重要。请参阅图1C中的图像所需的电极头的形状。短而粗的电极形状（ 图1B），将导致大量的组织损伤非常长而细的电极形状（ 图1A）时提前进入大脑，而会弯曲，从而将难以打破的电极尖端到正确的直径（见步骤2）。
修改电极尖端
修改电极秘诀。之前的两个电极可以粘在一起，它们必须被修改。该轴的单电极需要被弯曲之前，它可以连接到多管，使确保成品的小猪背面电极的结合轴是尽可能地薄。此外，的多管电极的前端具有用于离子电渗疗法，以确保低电阻的被折断。- 弯曲轴约20度的一个单一的筒电极。使用最小本生灯火焰可能。典型的“小”标准的实验室供应商创建本生灯火焰的大小，此应用程序是过于庞大。为了规避此问题，使用最小的商业本生灯和固定的注射器针（〜18号）的燃烧器的顶部，并使用牙科用粘固剂的密封连接。当操作时，火焰应该是很难看到的，约5毫米或更小的直径，约8毫米高。任何在房间内的空气流动将熄灭火焰，因此它是一个好主意，在操作的燃烧器封闭的房间，或使用风盾。通过火焰移动单桶电极弯曲约20度。目的有燃烧器的火焰熔化玻璃的过渡区，在远离电极尖端大约10毫米。为了避免熔化我们建议，该电极被保持在约45度的电极的前端，前端朝下，并通过火焰移动电极相对较快。
- 折断的多管电极的前端，为了确保视觉打破了电极尖端的控制，同时，使用显微镜的最低10x物镜和10倍目镜。插在眼的测量规模也将需要测量头的大小。将一块有机玻璃的显微镜这样的结束，可以看出，在大约三分之一的有机玻璃鉴于在显微镜领域的二分之一。有机玻璃片在我们的例子中，大约是25×70毫米和5毫米厚的和连接的，通过螺钉可固定到一个自定义在显微镜载物台的线程。重要的是，有一个设计，它允许为有机玻璃独立的滑动移动。将多管电极在一张床上的橡皮泥在玻片上，并插入幻灯片，包含电极显微镜载物台的幻灯片夹。使用显微镜载物台的XY机械手，轻轻地移动电极尖端对有机玻璃片，并通过显微镜目镜观察破的尖端。尝试干净突破多管的尖端直径约25-35微米的累积。丢弃移液管尖直径不均匀的休息断绝过大，或提示。我们放弃我们的多管电极由于不良尖形状的约30％。
组装背驮式电极
装配背驮式电极。- 位置电极。删除步骤2.2从显微镜载物台的有机玻璃片。固定完成多管电极插入橡皮泥在玻片上，尖端指向略有上升。朝上将是重要的步骤3.2中，在两个电极的胶合。点上去的提示，导致胶水远离尖端，避免胶电极尖端。将弯曲单管电极，电极持有人定制的显微操纵器（ 图2）。使用可视化的指导意见，然后再微观指导，降低了单管的多管电极的电极上。直接进入的槽，其形成由5桶的布置的，其前端突出的多管尖端的前端由约5-10微米的单电极，应该降低。当降低单桶，密切观察]是在两电极之间形成的角度。对于最好的结果，在其中的提示点彼此分开，而是试图降低单电极到避免任何角度多完全平行或即使与它的端部第一次接触的多管，形成一个很轻微的“楔”的安排。由于单一的套筒尖端是非常灵活的，它会弯曲时，单个电极被降低一点进一步后的前端已达到多桶电极的顶表面，形成一个干净的复合尖端有少量的内置弹簧作用帮助的提示。但是，如果单管和多管电极之间的角度太陡（太多的楔形），弹簧的作用将是太高和向下弯曲的电极布置。
- 胶电极轴在一起。胶轴的两个电极一起使用氰基丙烯酸酯（强力胶）。将一个扁平的牙签和触摸电极组件用胶水下降到旁边的小滴一小滴胶水。在最远端的位置的提示开始，慢慢地将牙签用胶水降沿电极轴对电极尖端。使用太多胶水，或施胶吨的oo与接近的电极尖端将导致胶合电极开口，使所述电极的至少部分非功能。
- 用牙科水泥稳定关节。少量的牙科水泥和牙科丙烯酸混合在一个小的一次性塑料盘或权衡船，采用扁平的牙签。等待，直到水泥成为可模制的，并在两个电极之间的接头涂上少量稳定的联合（粉红色的图3中的材料）。允许约15分钟至干。
- 电极取出并妥善保管。小心地取出背驮式电极的微操作机器人的持有人，然后从载玻片上分离，并存储在防尘的容器中。
准备电极填充解决方案
准备电极填充的解决方案。由于离子电渗疗法需要带电的分子，无论是在酸性或碱性的环境（通常是一个要溶解大多数代理商た约3-4的pH值，或约8-10的pH值，分别）。一些经常使用的化学物质，是在离子电渗疗法的列于表1。对于代理商而言，该表中未列出的，确定的pKa值，是否会更容易在酸性或碱性环境中使用的分子，使分子带电，并解散相应。为了达到最佳效果，混合所有的解决方案鲜的每日。填写并准备电极
填写，并准备电极。使用电极前，请填写每个桶各自的药物，使用碳纤维28 - 34号针头的注射器针头式过滤器。填写4个外桶5桶配置的首选药物，该中心作为一个平衡的桶桶3M氯化钠。填写单每桶记录电极以及与3M氯化钠。添加染料的NaCl溶液中，如快速绿色或酚红将使它更容易看到的电极头在放置过程中的脑表面上的电极。将电极插入电极持有人的记录设置，所有的电线插入到合适的玻璃桶。使用从约1厘米的绝缘已被移除的尖端处的绝缘银线。应该有5根为多管电极（4药物桶和一个平衡的桶），再加上需要被插入到记录单管电极的放大器导线。打开电离子透入泵模块
打开离子电渗泵模块和测试所有的酒桶。每一个泵模块的电极测试功能，将有助于确定如果电极筒功能。从桶的药物，以防止泄漏，在不使用时，保持在作为分子的电荷相反的极性的电压，需要施加。
Representative Results
在这个实验中，甘氨酸受体拮抗剂士的宁盐酸盐离子电渗疗法的应用。阻断甘氨酸抑制发射的神经元通常会增加。 图4显示了样本数据从他们的反应正弦声音刺激强度的增加，传递到动物的耳朵的听觉神经元。这种类型的一个实验被称为为神经元的放电率与强度函数。大声导致穗率较高（黑线）的声音。在本实验中使用的的初始离子导入电流为15 nA的。排出电流后，电流接通和稳定在新的水平（深蓝色曲线）的变化率强度功能，逐步增加至30，45，和60 NA（橙色，绿色和淡蓝色的曲线，分别）。在每一种情况下，在相同的范围内的声音强度中的神经元的响应后，记录的变化在dischaRGE率强度的功能，新的喷射电流的稳定。最合适的电流，在这个例子中使用的喷射是45 nA至60 nA的，因为这些水平的电流不再改变不同的神经元的反应。这一结果表明，在45 nA电流，该神经元的所有甘氨酸受体已被封锁士的宁盐酸盐。喷射电流和释放甚至更多的马钱子碱没有任何进一步的增加导致的神经元的放电速率级别的功能的进一步的变化。的协议完成后，关闭喷射电流。回到基线恢复的神经反应实现了约25分钟后（红线）。这可能需要，这取决于药物的类型和量的喷出，几秒钟和几十分钟之间。
| 药物 | 浓度 | 的溶液的pH值 | 溶剂 | 公司 | 猫。 ＃ | 典型的保持电流 | 典型的顶出电流 |
| GABA | 500毫米 | 3.5-4.0 | DH 2 O | 西格玛 | A-2129 | -15 nA的 | +5 nA到100 nA的 |
| 甘氨酸 | 100毫米 | 3.5-4.0 | DH 2 O | 西格玛 | G-7126 | -15 nA的 | +5 nA到100 nA的 |
| 荷包牡丹碱甲碘化物 | 10毫 | 3.0 | 在卫生署2 O 0.165 M氯化钠 | 西格玛 | B-6889 | -15 nA的 | +5 nA至60 nA的 |
| 盐酸士的宁 | 10毫 | 3.0 | 在卫生署2 O 0.165 M氯化钠 | 西格玛 | S-8753 | -15 nA的 | +5 nA至80 nA的 |
| L-谷氨酸 | 500毫米 | 8 | DH 2 O | 西格玛 | G-1251 | 30 nA的 | -10 nA至-150 nA的 |
| L-天冬氨酸 | 500毫米 | 8 | DH 2 O | 西格玛 | A-8949 | 30 nA的 | -10 nA至-150 nA的 |
| 红藻氨酸 | 1毫米 | 9 | DH 2 O | 西格玛 | K-0250 | 30 nA的 | 10nA至-100 nA的 |
表1。常用药物溶解和浓度的pH值。该表列出了最常用的突触使用的离子电渗疗法的激动剂和拮抗剂。上市的pH值环境需要分化吨的账户灰褐色剂，和在不同药物之间的有效性的可变性在所建议的浓度占。
图1。三个多管移液管尖的长度不同。答：这5桶电极的尖端已经拉得长而薄的。需要注意的是秘诀是弯曲的，而且很软。这种类型的前端很难突破到所需的直径。 B：该电极的前端是太短和粗短。当推进到更深的脑区中，该电极将导致不必要的脑损伤，由于这样的事实，所述电极相对变后的前端只有几毫米厚的。 C：与正确的拉小费的电极的一个例子。虽然是长而细，尖端是坚定的，可以很容易出问题所需的尖端直径。
gure 2“SRC =”/ files/ftp_upload/4358/4358fig2.jpg“/>
图2。制图电极操纵器组件操纵器组件一起使用，用显微镜来组装的背叠电极。资料标记为灰色的是市售的产品，并在表2中列出。标记为蓝色的定制在我们的机构的机加工车间加工。它们是1）1/4英寸的钢板尺寸43x26厘米有孔纽波特阶段423根据提供的纽波特孔图案钻了进去; 2），允许装配在任意角度倾斜的倾斜阶段3）连接器，安装电极支架顶端的翻译阶段。
图3。照片的样本背驮式电极 。完成后的5桶单桶的记录EL电极组装在一起ectrode。注意长轴约7mm允许的脑深部的记录。
图4。弹射电流滴定。该图显示了速度记录从一个单一的听觉神经元的功能，而动物的耳朵色调不同强度的刺激强度。大声的声音往往引起点火率较高。前神经元的速度，强度功能药物的应用，显示出穗率最低（黑线）。更高的喷射电流的阻碍日益甘氨酸受体的神经元，导致点火率逐步提高。在此神经元的最佳喷射电流为45〜60 nA的。这些喷射电流，实现了完全堵塞的所有神经元的甘氨酸受体。实验协议完成后，终止的离子电渗疗法是与神经元被允许恢复。完全恢复时的恢复率 - 强度函数实现与初始预药物恢复功能匹配。转载许可克鲁格等人 ，1995年从美国生理学会，。
Discussion
我们描述了一种技术，它允许一个单一的神经元的微电路体内操纵，而在相同的时间，从而可以用于记录的实验操作过程中的神经元的响应。神经电路操纵通过突触的激动剂和拮抗剂的iontophoretical应用。过压喷射离子电渗疗法的主要优点是，离子电渗疗法不要求流体从所述电极到神经组织的物理运动，并因而不存在关注，通过所施加的压力或流体体积引起组织损伤。这种技术的主要限制是缺乏有关下列内容的信息的绝对药物在组织中的浓度，与受影响的组织体积。然而，由于喷射离子电渗疗法的药物制剂的量更小的和更精确的可控性比与压力喷射，从药物的应用的恢复通常是快得多的ð更完整的。在神经系统的感觉和其他一些微电泳已成功地被使用，并且很少或没有内在处理的脑区中最成功的应用。其原因是，喷出的药理活性剂中的一些内容可能从应用程序站点扩散到相邻的神经元，并也可以操纵的相邻神经元的响应特性。
单和多桶电极的单独制造的允许的组合，电极具有任意和无关的特性。拉出电极桶在一起并使用一些用于记录和一些用于离子电渗疗法的目的，会产生非常相似的性质与电极尖端，使得电极尖端是过大的单细胞记录，或过小的药物的应用。另外，有单管尖超出约20微米的多管电极尖端大大降低了噪音的录音，ð消除可能的干扰电流的影响，从保留或喷射电流的神经元发射3。
背驮式多管电极的第一个超过30年的前4-6，已经非常成功地用于解剖的神经回路7-18 19-29。因此，该方法本身并不新颖或独特的。然而，电极的制备和使用的特定细节已经被修改多年来，这里描述的指令集已被证明是特别容易和成功的，并没有被详细发表在其他文献中。特别地，弯曲的单管电极尖端允许最终小费的小猪背面电极相对苗条（ 图3），因此，允许以最小的损伤到大脑从深核录音;单筒突出在多管电极的电极删除几乎所有的CURREN吨的影响，这通常被认为是该技术的缺点3。这里提出的新的细节，如具有制造背叠电极时，电极尖端朝上在涂胶过程中和休息的多管电极的槽的单桶将确保高的成功率。该技术是相对容易的，通常可以在几天之内所掌握的新手。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是支持R01 DC 011582（AK）和RO1 DC011555（DJT）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bunsen burner | 17928-027 | Available from: VWR | |
| Two-component dental cement: "Cold cure" dental material | Co-oral-ite Dental Mfg. Co | 525000 | Available from: A-M Systems, Inc |
| Two-component dental cement: Denture material crosslinking Liquid Compound | Co-oral-ite Dental Mfg. Co | 525000 | Available from: A-M Systems, Inc |
| Liquid glue | Henkel | 01-06849 | Available from: Loctite Super Glue |
| Micro-Iontophoresis Unit: Neurophore BH-2 | Harvard Apparatus | 65-0200 & 65-0203 | Available from: Harvard Apparatus |
| Insulated silver wire | AM-Systems | 785500 | Available from: AM-Systems |
| Horizontal puller | Zeitz DMZ-Universal Puller | NA | Available from: AutoMate Scientific |
| Micro-manipulator pieces: electrode holder | WPI | M3301EH | Available from: WPI |
| Micro-manipulator pieces: linear stage | Newport 423 Series | 423 | Available from: Newport |
| Micro-manipulator pieces: rotation stage | Newport RSP-2 | RSP-2 | Available from: Newport |
| Micro-manipulator pieces: z translation | Newport 433 Series | 433 | Available from: Newport |
| Micro-manipulator pieces: angle bracket 90 ° to assemble z and xy axis | Newport 360-90 | 360-90 | Available from: Newport |
| Micro-manipulator pieces: x translation / linear stage | Newport 423 Series | 423 | Available from: Newport |
| Micro-manipulator pieces: y translation / linear stage | Newport 423 | 423 | Available from: Series Newport |
| Microscope | Leitz Laborlux 11 | ||
| Microscope: objective | Leitz Wetzlar 10x, NA 0.25 | 519760 | |
| Microscope: eypieces | Leitz Wetzlar, Periplan 10x/18 | 519748 | |
| Microscope: stage | Leitz Wetzlar | 513544 | |
| Multibarrel capillary | N/A | 612000 | Available from: A-M systems, Inc |
| Sinlge barrel capillary (GC 150F-10) | Harvard Apparatus | 30-0057 | Available from: Harvard Apparatus |
| Vertical puller | Narishige model PE-2 | ||
| Custom made elements of the Micro-manipulator (marked light blue in Figure 1) | |||
| steel plate | |||
| tilting base | |||
| attachment for electrode holder | |||
| Table 2. Manufacturers and item numbers of all equipment and supplies used in the procedure. |
|||
References
- Curtis, D. R. A method for assembly of "parallel" micro-pipettes. Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 24, 587-589 (1968).
- Carette, B. A new method of manufacturing multi-barrelled micropipettes with projecting recording barrel. Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 44, 248-250 (1978).
- Crossman, A. R., Walker, R. J., Woodruff, G. N. Problems associated with iontophoretic studies in the caudate nucleus and substantia nigra. Neuropharmacology. 13, 547-552 (1974).
- Havey, D. C., Caspary, D. M. A simple technique for constructing "piggy-back" multibarrel microelectrodes. Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 48, 249-251 (1980).
- Verberne, A. J., Owens, N. C., Jackman, G. P. A simple and reliable method for construction of parallel multibarrel microelectrodes. Brain Res. Bull. 36, 107-108 (1995).
- Oliver, A. P. Technical contribution. A simple rapid method for preparing parallel micropipette electrodes. Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 31, 284-286 (1971).
- Oswald, J. P., Klug, A., Park, T. J. Interaural intensity difference processing in auditory midbrain neurons: effects of a transient early inhibitory input. J. Neurosci. 19, 1149-1163 (1999).
- Park, T. J., Pollak, G. D. GABA shapes a topographic organization of response latency in the mustache bat's inferior colliculus. J. Neurosci. 13, 5172-5187 (1993).
- Park, T. J., Pollak, G. D. GABA shapes sensitivity to interaural intensity disparities in the mustache bat's inferior colliculus: implications for encoding sound location. J. Neurosci. 13, 2050-2067 (1993).
- Peterson, D. C., Nataraj, K., Wenstrup, J. Glycinergic inhibition creates a form of auditory spectral integration in nuclei of the lateral lemniscus. J. Neurophysiol. 102, 1004-1016 (2009).
- Ramsey, L. C. B., Sinha, S. R., Hurley, L. M. 5-HT1A and 5-HT1B receptors differentially modulate rate and timing of auditory responses in the mouse inferior colliculus. Eur. J. Neurosci. 32, 368-379 (2010).
- Wenstrup, J. J., Leroy, S. Spectral Integration in the Inferior Colliculus: Role of Glycinergic Inhibition in Response Facilitation. J. Neurosci. 21, RC124 (2001).
- Yang, L., Pollak, G. D. Features of ipsilaterally evoked inhibition in the dorsal nucleus of the lateral lemniscus. Hear. Res. 122, 125-141 (1998).
- Yang, L., Pollak, G. D. GABA and glycine have different effects on monaural response properties in the dorsal nucleus of the lateral lemniscus of the mustache bat. J. Neurophysiol. 71, 2014-2024 (1994).
- Yang, L., Pollak, G. D. The roles of GABAergic and glycinergic inhibition on binaural processing in the dorsal nucleus of the lateral lemniscus of the mustache bat. J. Neurophysiol. 71, 1999-2013 (1994).
- Yang, L., Pollak, G. D., Resler, C. GABAergic circuits sharpen tuning curves and modify response properties in the mustache bat inferior colliculus. J. Neurophysiol. 68, 1760-1774 (1992).
- Faingold, C. L., Gehlbach, G., Caspary, D. M. On the role of GABA as an inhibitory neurotransmitter in inferior colliculus neurons: iontophoretic studies. Brain Res. 500, 302-312 (1989).
- Faingold, C. L., Hoffmann, W. E., Caspary, D. M. Effects of excitant amino acids on acoustic responses of inferior colliculus neurons. Hear. Res. 40, 127-136 (1989).
- Hurley, L., Pollak, G. D. Serotonin shifts first-spike latencies of inferior colliculus neurons. J. Neurosci. 25, 7876-7886 (2005).
- Hurley, L., Pollak, G. D. Serotonin effects on frequency tuning of inferior colliculus neurons. J. Neurophysiol. 85, 828-842 (2001).
- Hurley, L. M., Pollak, G. D. Serotonin differentially modulates responses to tones and frequency-modulated sweeps in the inferior colliculus. J. Neurosci. 19, 8071-8082 (1999).
- Klug, A., Bauer, E. E., Pollak, G. D. Multiple components of ipsilaterally evoked inhibition in the inferior colliculus. J. Neurophysiol. 82, 593-610 (1999).
- Klug, A., Park, T. J., Pollak, G. D. Glycine and GABA influence binaural processing in the inferior colliculus of the mustache bat. J. Neurophysiol. 74, 1701-1713 (1995).
- Moore, M. J., Caspary, D. M. Strychnine blocks binaural inhibition in lateral superior olivary neurons. J. Neurosci. 3, 237-242 (1983).
- Nataraj, K., Wenstrup, J. J. Roles of inhibition in creating complex auditory responses in the inferior colliculus: facilitated combination-sensitive neurons. J. Neurophysiol. 93, 3294-3312 (2005).
- Fukui, I., Burger, R. M., Ohmori, H., Rubel, E. W. GABAergic inhibition sharpens the frequency tuning and enhances phase locking in chicken nucleus magnocellularis neurons. J. Neurosci. 30, 12075-12083 (2010).
- Burger, R., Pollak, G. D. Reversible inactivation of the dorsal nucleus of the lateral lemniscus reveals its role in the processing of multiple sound sources in the inferior colliculus of bats. J. Neurosci. 21, 4830-4843 (2001).
- Burger, R. M., Pollak, G. D. Analysis of the role of inhibition in shaping responses to sinusoidally amplitude-modulated signals in the inferior colliculus. J. Neurophysiol. 80, 1686-1701 (1998).
- Coleman, W. L., Fischl, M. J., Weimann, S. R., Burger, R. M. GABAergic and glycinergic inhibition modulate monaural auditory response properties in the avian superior olivary nucleus. J. Neurophysiol. 105, 2405-2420 (2011).
