Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

تصنيع واستخدام الخنزير ظهر أقطاب لMultibarrel doi: 10.3791/4358 Published: January 18, 2013

Summary

الرحلان الشاردي من منبهات عصبية والخصوم خلال خارج الخلية

Abstract

في الجسم الحي من التسجيلات الخلايا العصبية واحدة تسمح للمحقق لدراسة خصائص إطلاق الخلايا العصبية، على سبيل المثال في الاستجابة للمثيرات الحسية. الخلايا العصبية تلقي عادة متعددة مثير والمثبطة المدخلات وارد و / أو صادر التي تتكامل مع بعضها البعض، ويدفعهم في نهاية المطاف خصائص استجابة الخلايا العصبية لقياس من التكامل العصبي لهذه المدخلات. لدراسة معالجة المعلومات في الأنظمة العصبية، فمن الضروري أن نفهم المدخلات المختلفة إلى الخلايا العصبية أو نظام العصبي، وخصائص محددة من هذه المدخلات. وهناك طريقة بسيطة من الناحية الفنية قوية ونسبيا لتقييم دور وظيفي من المدخلات على يقين من أن الخلية العصبية نظرا يتلقى هو حيوي وقمع عكسية أو القضاء على هذه المدخلات، وقياس التغيرات في الناتج الخلايا العصبية في الناجمة عن هذا التلاعب. ويمكن تحقيق هذا عن طريق تغيير البيئة عقاقيري الخلايا العصبية المباشرة مع إلكترونيات multibarrel أصبع الظهيرقصائد. هذه الأقطاب الكهربائية تتكون من القطب برميل تسجيل واحد وقطب المخدرات multibarrel التي يمكن أن تحمل ما يصل إلى 4 منبهات مختلفة أو متشابك الخصوم. يمكن تطبيقها وكلاء الدوائية iontophoretically في أوقات المطلوب أثناء التجربة، مما يسمح لمرة والتسليم المراقب وإعادة تشكيل عكس المدخلات متشابك. على هذا النحو، والتلاعب الدوائية من المكروية يمثل وسيلة قوية وغير مسبوقة لاختبار فرضيات محددة حول وظيفة الدوائر العصبية.

نحن هنا تصف كيف يتم تصنيع أصبع إعادة الأقطاب، وكيف يتم استخدامها خلال التجارب المجراة في. نظام يسمح لإعادة أصبع محقق للجمع بين تسجيل برميل واحد من القطب أي ممتلكات التعسفي (المقاومة، الخ حجم تلميح الشكل،) مع القطب multibarrel المخدرات. هذا هو ميزة كبيرة على أقطاب متعددة القياسية، حيث كل برميل لها أشكال مشابهة بشكل أو بآخر والممتلكات. Multibarrel هلأول مرة lectrodes أكثر من 40 عاما مضت 1-3، وخضعت لعدد من التحسينات تصميم 2،3 حتى تم إدخال نوع أصبع ظهر في 1980s 4،5. هنا نقدم مجموعة من التحسينات الهامة في إنتاج مختبر أصبع إعادة الأقطاب التي تسمح لاختراق العميق للمخ في الاستعدادات سليمة في الجسم الحي الحيوان بسبب رمح القطب رقيقة نسبيا التي تسبب أضرار طفيفة. وعلاوة على ذلك تتميز هذه الأقطاب الكهربائية من التسجيلات انخفاض مستوى الضجيج، وتعاني من انخفاض المقاومة للبرميل المخدرات الرحلان الشاردي فعالة جدا من وكلاء الدوائية المطلوب.

Protocol

  1. سحب أسلاك الزجاج

    سحب أسلاك الزجاج
    1. سحب واحدة القطب برميل. استخدام مرة واحدة الزجاج الشعرية برميل مع خيوط وسحب تلميح ليبلغ قطرها حوالي 1-2 ميكرومتر، وطول رمح من 10-12 مم، والمقابلة المقاومة الكهربائي على Mohm من حوالي 12 (المدى 5-20 MOhms) مقاسا في محلول كلوريد الصوديوم 0.9٪. والمقاومة أقل الكهربائي يؤدي إلى المزيد من النشاط وصعوبة خلفية بالتالي المزيد من النشاط في عزل الخلايا العصبية الفردية من الوحدوي. لسحب هذا القطب، استخدم إما أفقي أو عمودي مجتذب مع خيوط التدفئة أو لفائف التدفئة.
    2. سحب القطب multibarrel. نظرا لقطرها أكبر من ذلك بكثير من الزجاج multibarrel وضرورة التوزيع حتى الحرارة في جميع أنحاء multibarrel بأكمله، هناك حاجة إلى مجتذب قوية مع لفائف قطرها أكبر التدفئة، وليس خيوط التدفئة. ماصة multibarrel لابد من إدراجها في وسط خيوط التدفئة مع nس الاتصال إلى ملف التسخين. ملاحظة أنه إلى جانب ماصات 5-برميل وصفها هنا، ماصات 3-برميل أو 7 برميل من البدائل المتاحة تجاريا. سحب الزجاج لتلميح ماصة من حوالي 10 ميكرومتر قطرها الكلي، أو أقل من ذلك. وسيتم تقسيم الطرف إلى القطر الصحيح في الخطوة التالية، وبالتالي فإن حجم تلميح بالضبط هو أقل أهمية أثناء عملية سحب من الشكل العام للتلميح الكهربائي، والتي ينبغي أن تكون طويلة ورقيقة نسبيا. الرجوع إلى الصورة في الشكل 1C للشكل القطب تلميح المطلوب. سوف الأشكال القطب قصيرة وقصير (1B الشكل) يمكن أن يسبب قدرا كبيرا من تلف الأنسجة عند تقدم في الدماغ، في حين أن الأشكال القطب طويلة جدا ورقيقة (الشكل 1A) سوف ينحني وبالتالي سيجعل من الصعب كسر غيض الكهربائي إلى الصحيح قطر (انظر الخطوة 2).
  2. تعديل نصائح الكهربائي

    تعديل نصائح القطب. يمكن لصقها قبل الأقطاب اثنين معا، لديهم إلى تعديل. رمح من القطب واحد يحتاج إلى أن تكون عازمة قبل أن تعلق على multibarrel للتأكد من رمح المشترك لإعادة أصبع القطب النهائي رقيقة قدر الإمكان. بالإضافة إلى ذلك، غيض من القطب multibarrel يجب أن توقفت لضمان مقاومة منخفضة لالرحلان الشاردي.
    1. ينحني رمح قطب برميل واحد من نحو 20 درجة. استخدام الموقد بنسن لهب أصغر ممكن. "صغيرة" نموذجية الشعلات بنسن من مستوى شركات توريد مختبر إنشاء أحجام اللهب التي هي كبير جدا لهذا التطبيق. للتحايل على هذه المشكلة استخدام أصغر الموقد بنسن التجارية وتأمين إبرة حقنة (~ 18 مقياس) إلى أعلى الموقد، وختم اتصال باستخدام الاسمنت الأسنان. عندما تعمل، يجب أن تكون الشعلة من الصعب أن نرى، حوالي 5 ملم أو أقل في القطر، ونحو 8 مم طويل القامة. أي حركة الهواء في الغرفة التي سوف اخماد الشعلة، لذلك هو فكرة جيدة لتشغيل الموقد فيغرفة مغلقة، أو لاستخدام الدروع الرياح. نقل القطب برميل واحد من خلال لهب لثني من قبل عن 20 درجة. تهدف لجعل لهب الموقد إذابة الزجاج في المنطقة الانتقالية في حوالي 10 ملليمتر بعيدا عن تلميح القطب. لتجنب ذوبان غيض من القطب نقترح أن تعقد الكهربائي في حوالي 45 درجة، لافتا غيض الهبوط، ونقل القطب من خلال اللهب بسرعة نسبيا.
    2. قطع غيض من القطب multibarrel. لضمان المراقبة البصرية في حين كسر غيض الكهربائي، واستخدام المجهر مع هدف 10X 10X كحد أدنى وoculars. كما مقياس قياس يدخل في العين تكون هناك حاجة لقياس أحجام الإكراميات. نعلق على قطعة من زجاج شبكي لهذه المجهر والتي يمكن مشاهدتها في نهاية شبكي في حوالي ثلث إلى نصف واحد من مجال الرؤية من المجهر. في حالتنا، وزجاج شبكي قطعة حوالي 25 مم 70 × 5 مم والمرفق وعبر لولب التي يمكن ضمانها في العرفجعل الموضوع في المرحلة المجهر. فمن المهم أن يكون التصميم الذي يسمح للزجاج شبكي مستقل الانتقال من الشريحة. وضع القطب الكهربائي multibarrel في سرير من الطين النمذجة على شريحة زجاجية، وإدراج الشريحة التي تحتوي على قطب كهربائي في حامل الشرائح المجهر في المرحلة. باستخدام المتلاعبين XY المرحلة المجهر، ونقل بلطف غيض الكهربائي ضد قطعة زجاج شبكي، ومراقبة كسر غيض من خلال oculars المجهر. محاولة لكسر نظيفة في تلميح multibarrel ليبلغ قطرها حوالي 25-35 التراكمي للميكرومتر. تجاهل ماصات بأقطار طرف أن قطعت كبيرة جدا، أو مع فواصل نصائح متفاوتة. نحن تجاهل ما يقرب من 30٪ من الأقطاب الكهربائية multibarrel لدينا بسبب الأشكال تلميح غير مرغوب فيها.
  3. تجميع الخنزير ظهر الكهربائي

    تجميع أصبع إعادة القطب.
    1. أقطاب الموقف. إزالة قطعة زجاج شبكي يستخدم في الخطوة 2.2 من المرحلة المجهر. تأمين الانتهاءmultibarrel الكهربائي في الطين النمذجة على شريحة زجاجية، مشيرا تلميح إلى أعلى قليلا. لافتا إلى أعلى خطوة هامة لتكون 3.2، لصق الأقطاب اثنين. النصائح التي تشير يصل يسبب الغراء الهرب من طرف، وتجنب الإلتصاق النصائح القطب. إدراج القطب عازمة برميل واحد في القطب حامل من مياداة مجهرية العرف (الشكل 2). باستخدام التوجيه البصرية أولا ثم توجيه المجهرية، وانخفاض القطب برميل واحد على القطب multibarrel. ينبغي تخفيض القطب واحدة مباشرة في الأخدود التي يتم تشكيلها من قبل ترتيب برميل 5، مع طرفها جاحظ غيض من غيض multibarrel بنحو ميكرومتر 5-10. عندما خفض برميل واحد، ومراقبة عن كثب الزاوية التي تتشكل بين القطبين. للحصول على أفضل نتائج في تجنب أي الزوايا التي تشير النصائح بعيدا عن بعضها البعض، وإنما محاولة لخفض القطب واحد على ومتعددة موازية تماما أو حتى مع طرفهالمس multibarrel الأولى، تشكيل ترتيب طفيفة جدا "إسفين". منذ غيض برميل واحد مرنة جدا، وسوف ينحني عندما يخفض القطب واحدة أبعد قليلا بعد تلميح قد وصل إلى السطح العلوي للبرميل القطب متعددة، وتشكيل الحافة نظيفة مركب يحتوي على كمية صغيرة من العمل بنيت في الربيع التي تساعد على عقد نصائح معا. ومع ذلك، إذا كانت الزاوية بين برميل واحد والقطب multibarrel حاد جدا (الكثير من إسفين)، وسوف يكون العمل الربيع مرتفعة جدا وثني أسفل الترتيب الكهربائي.
    2. مهاوي القطب الغراء معا. الغراء مهاوي من الأقطاب الكهربائية باستخدام اثنين معا CYANOACRYLATE (superglue). وضع قطرة صغيرة من الغراء على الجانب صغيرة من مسواك مسطحة واتصال الجمعية الكهربائي مع انخفاض الغراء. تبدأ في الموضع الأكثر البعيدة من النصائح والتحرك ببطء مع المسواك الغراء على طول قطرة مهاوي القطب نحو نصائح القطب. استخدام الغراء أكثر من اللازم، أو تطبيق الغراء رسوف OO بالقرب من القطب نصائح يؤدي إلى الإلتصاق فتحات القطب، وجعلها القطب على الأقل لا يعمل بشكل جزئي.
    3. استقرار مشتركة مع الاسمنت الأسنان. المزيج كمية صغيرة من الاسمنت الاكريليك الأسنان والأسنان في طبق صغير البلاستيكية أو وزن القارب، وذلك باستخدام مسواك المسطحة. الانتظار حتى يصبح قابل للتشكيل الأسمنت وتطبيق كمية صغيرة إلى المشترك بين القطبين لتحقيق الاستقرار في المشترك (وردي المادة في الشكل 3). السماح حوالي 15 دقيقة حتى يجف.
    4. إزالة وتخزين القطب. إزالة بعناية الانتهاء أصبع إعادة القطب الأول من حامل مياداة مجهرية، ومن ثم فصل من شريحة زجاجية، وتخزينها في وعاء الغبار.
  4. إعداد حلول التعبئة الكهربائي

    إعداد حلول القطب التعبئة. منذ الرحلان الشاردي يتطلب جزيئات مشحونة، معظم وكلاء لا بد من حل سواء في بيئة حمضية أو قلوية (عادةتا الرقم الهيدروجيني من 3-4 عنه، أو الرقم الهيدروجيني من حوالي 8-10، على التوالي). يتم سرد عدد من المواد الكيميائية التي غالبا ما تستخدم في الرحلان الشاردي في الجدول 1. عن وكلاء التي لم يتم سردها في الجدول، تحديد قيمة من الباكاف الحمضية، فيما إذا كان من الأسهل استخدام جزيء في الحمضية أو القلوية بيئة للحفاظ على جزيء مشحون، وحل فقا لذلك. للحصول على أفضل النتائج، وخلط جميع الحلول الطازجة يوميا.
  5. ملء وإعداد أقطاب

    ملء وإعداد الأقطاب الكهربائية. فقط قبل استخدام القطب الكهربائي، والعودة ملء كل برميل مع المخدرات التابعة لها، وذلك باستخدام ألياف الكربون 28 - الإبر قياس 34 المرفقة المحاقن مع مرشحات حقنة. ملء برميل 4 الخارجي للتكوين 5-برميل مع المخدرات في الاختيار، وكلوريد الصوديوم مع مركز برميل 3M وللبرميل موازنة. ملء برميل واحد تسجيل القطب الكهربائي مع كلوريد الصوديوم 3M أيضا. وإضافة إلى صبغ محلول كلوريد الصوديوم، مثل الأخضر أو ​​الأحمر سريع الفينول تجعل من السهل أن نرى الطرف الكهربائيخلال وضع القطب الكهربائي على سطح الدماغ. إدراج القطب الكهربائي في ماسك من الإعداد تسجيل وإدراج كافة الأسلاك في برميل الزجاج المناسب. استخدام الأسلاك المعزولة من الفضة التي تمت إزالة حوالي 1 سم من العزل على الحافة. ينبغي أن يكون هناك 5 أسلاك لالكهربائي multibarrel (برميل المخدرات (4) واحد للبرميل موازنة)، بالإضافة إلى سلك مكبر للصوت لا بد من إدراجها في برميل القطب تسجيل واحد.
  6. تشغيل وحدات مضخة الرحلان الشاردي

    تشغيل وحدات ضخ واختبار الرحلان الشاردي كل برميل. فإن اختبار وظيفة كل وحدة من القطب مضخة مساعدة تحديد ما إذا كان القطب برميل وظيفية. لمنع تسرب الأدوية من برميل عندما لا تكون قيد الاستعمال، والجهد في الاحتفاظ القطبية العكس كما جزيء التهمة يحتاج إلى أن يطبق.

Representative Results

في هذه التجربة، تم تطبيق iontophoretically على مستقبلات جليكاين الاستريشينين هيدروكلوريد. منع تثبيط glycinergic عادة اطلاق يزيد في الخلايا العصبية. ويبين الشكل 4 بيانات عينة من الخلايا العصبية السمعية التي الاستجابات للمثيرات الصوت جيبية من شدة زيادة تسليمها الى آذان الحيوان سجلت. يشار إلى هذا النوع من تجربة لوظيفة الخلايا العصبية في معدل الكثافة التفريغ مباراة. بصوت أعلى الأصوات أدى إلى ارتفاع معدلات ارتفاع (المنحنى الأسود). وكان التيار الرحلان الشاردي الأولية المستخدمة خلال هذه التجربة 15 غ. بعد توصيل التيار والتغيرات في معدل كثافة وظيفة قد استقرت عند مستواها الجديد (منحنى الأزرق الداكن)، وزادت تدريجيا إلى 45 الحالي طرد، 30، و 60 NA (البرتقالي والأخضر والأزرق الفاتح والمنحنيات، ) على التوالي. في كل حالة، وسجلت ردود الخلايا العصبية على نفس النطاق من شدة الصوت بعد التغيرات التي طرأت على dischaوكان معدل الكثافة RGE ظائف ردا على طرد جديدة استقرت الحالي. وكان طرد أنسب الحالية لاستخدامها في هذا المثال 45 إلى 60 NA NA لأن هذه المستويات الحالية لم يعد تغيير الاستجابات بشكل مختلف الخلايا العصبية في. هذه النتيجة تشير إلى أن نا في 45 الحالي، وقد تم بالفعل جميع مستقبلات الخلايا العصبية التي جليكاين من حظره من قبل هيدروكلوريد الاستريشينين. لم أي زيادة أخرى من الاستريشينين الحالية والإفراج عن طرد أكثر من ذلك لا يؤدي إلى المزيد من التغييرات في وظيفة الخلايا العصبية في معدل المستوى التفريغ. بعد الانتهاء من البروتوكول، وتحول التيار من طرد. وقد تحقق الانتعاش من الردود العصبية مرة أخرى إلى خط الأساس بعد حوالي 25 دقيقة (الخط الأحمر). وهذا قد يستغرق، تبعا لنوع وكمية من المخدرات طرد، بين عدة ثوان وعدة عشرات من الدقائق.

دواء تركيز الرقم الهيدروجيني من الحل مذيب شركة القط. # نموذجية الاحتفاظ الحالية التيارات الطرد نموذجية
GABA 500 ملي 3،5-4،0 DH 2 O سيجما A-2129 -15 NA نا نا ل+5 +100
جليكاين 100 ملي مول 3،5-4،0 DH 2 O سيجما G-7126 -15 NA نا نا ل+5 +100
Bicuculline Methiodide 10 ملي 3.0 0،165 درهم M كلوريد الصوديوم في 2 O سيجما B-6889 -15 NA نا +5 إلى +60 NA
الاستريشينين هيدروكلوريد 10 ملي 3.0 0،165 درهم M كلوريد الصوديوم في 2 O سيجما S-8753 -15 NA نا +5 إلى +80 NA
حمض الجلوتاميك L- 500 ملي ثمانية DH 2 O سيجما G-1251 +30 NA -10 -150 نا نا إلى
حمض الأسبارتيك L- 500 ملي ثمانية DH 2 O سيجما A-8949 +30 NA -10 -150 نا نا إلى
حمض الكايينيك 1 ملم تسعة DH 2 O سيجما K-0250 +30 NA 10nA-NA ل-100

الجدول 1. العقاقير شائعة الاستخدام، مع درجة الحموضة لتذويب والتركيز. الجدول يسرد ناهضات الأكثر شيوعا متشابك ومضادات استخدامها مع الرحلان الشاردي. البيئة درجة الحموضة المدرجة حسابات للضرورة استقطاب ر ذات المناظر وكلاء، وحسابات التركيز المقترحة للتقلب في فعالية بين الأدوية المختلفة.

الشكل 1
الشكل 1. ثلاثة multibarrel ماصات بأطوال مختلفة تلميح A: تم سحب هذا غيض من القطب 5-برميل طويلة جدا ورقيقة. نلاحظ أن الطرف عازمة وميسرة للغاية. هذا النوع من غيض من الصعب جدا لكسر في قطر المطلوب. B: وهذا غيض من القطب قصيرة جدا وقصير. عندما تقدمت إلى مناطق أعمق في الدماغ، وهذا القطب يسبب تلف في الدماغ لا لزوم لها يرجع ذلك إلى حقيقة أن يصبح القطب سميكة نسبيا فقط بضعة ملليمترات بعد تلميح. C: مثال على إلكترود مع طرف سحبت بشكل صحيح. في حين يجري طويلة ورقيقة، والطرف لا تزال ثابتة ويمكن كسر بسهولة إلى القطر تلميح المطلوب.

جوري 2 "SRC =" / files/ftp_upload/4358/4358fig2.jpg "/>
الشكل 2. رسم التجمع تتلاعب القطب. ويستخدم جنبا إلى جنب مع الجمعية تتلاعب المجهر لتجميع الأقطاب أصبع الظهير. العناصر باللون الرمادي من المنتجات المتاحة تجاريا والمدرجة في الجدول 2. والبنود المخصصة ملحوظ في الزرقاء تشكيله في ورشة ميكانيكا في مؤسستنا. أنها هي 1) 1/4 بوصة مسطحات الصلب سم 43x26 الحجم مع فتحات للمرحلة نيوبورت 423 حفر فيه وفقا للنمط ثقب المقدمة من نيوبورت، 2) مرحلة إمالة تسمح يميل للجمعية في زوايا التعسفي؛ 3) أ الرابط الذي يتصاعد حامل قطب كهربائي متعدية إلى المرحلة الأعلى.

الشكل 3
الشكل 3. صورة لأصبع القطب الخلفي العينة. A 5-منتهية برميل القطب تجميعها معا مع أ ش تسجيل واحد للبرميلectrode. ملاحظة رمح طويل من 7MM بشأن السماح لتسجيلات العميق للمخ.

الشكل 4
الشكل 4. المعايرة من التيارات طرد. ويبين الرسم البياني معدل الكثافة وظائف الخلايا العصبية سجلت من السمع واحد بينما حفزت آذان الحيوان مع طن من كثافات مختلفة. تميل بصوت أعلى الأصوات للحصول على أسعار أعلى اطلاق النار. قبل تطبيق المخدرات، أظهرت الخلايا العصبية في معدل الكثافة وظيفة أقل المعدلات سنبلة (المنحنى الأسود). منعت التيارات طرد أعلى تدريجيا تدريجيا أكثر المستقبلات جليكاين في الخلايا العصبية، مما يؤدي إلى معدلات أعلى اطلاق تدريجيا. وكان طرد الأمثل الحالية في هذا العصبون 45-60 غ. مع هذه التيارات طرد، وقد تحقق انسداد كامل لجميع مستقبلات الخلايا العصبية في جليكاين. بعد الانتهاء من البروتوكول التجريبي، تم إنهاء الرحلان الشاردي وسمح للعصبون إلىالتعافي. وقد تحقق الشفاء الكامل عند انتعاش معدل الكثافة وظيفة مطابقة الأولية الدالة الانتعاش قبل المخدرات. مستنسخة، بإذن من جمعية الفسيولوجية الأمريكية، من كلوغ وآخرون، 1995.

Discussion

وصفنا وهي تقنية تسمح للتلاعب من الخلايا العصبيه واحدة الدقيقة في الجسم الحي، بينما في الوقت نفسه يسمح لتسجيل استجابات الخلايا العصبية خلال التلاعب التجريبية. يتم التلاعب الدوائر العصبية عن طريق تطبيق iontophoretical من ناهضات متشابك والخصوم. والميزة الرئيسية لأكثر من الرحلان الشاردي هو أن طرد ضغط الرحلان الشاردي لا تتطلب الحركة المادية من السوائل من القطب إلى الأنسجة العصبية، وبالتالي لا يوجد أي قلق من تسبب تلف الأنسجة من خلال الضغوط التي مورست أو حجم السائل. فإن القيود الرئيسية من هذه التقنية هو عدم وجود معلومات عن تركيز الدواء المطلقة في الأنسجة، وحجم الأنسجة المتضررة. ومع ذلك، منذ المبالغ من وكلاء الدوائية طرد الرحلان الشاردي مع أصغر بكثير وأكثر دقة من التحكم مع طرد الضغط، والشفاء من تطبيق الدواء هو عادة أسرع بكثير مند أكثر من ذلك بكثير كاملة. وقد تم بنجاح Microiontophoresis المستخدمة في عدد من النظم العصبية والحسية وغيرها، ويتم تطبيقها بنجاح في معظم مناطق الدماغ مع تجهيز الجوهرية ضئيلة أو معدومة. والسبب هو أن بعض وكيل الدوائية قد طرد من موقع نشر التطبيق إلى الخلايا العصبية المجاورة وأيضا التحكم في خصائص استجابة الخلايا العصبية المجاورة.

تصنيع منفصلة من الأقطاب الكهربائية برميل واحد ومتعدد يسمح لمجموعة من الأقطاب الكهربائية مع خصائص التعسفي وغير ذات صلة. وسحب برميل الكهربائي معا واستخدام بعض لتسجيل وبعض لأغراض إنتاج الرحلان الشاردي نصائح الكهربائي مع خصائص مشابهة جدا، لدرجة أن نصائح القطب سيكون إما كبيرة جدا لتسجيل خلية واحدة، أو صغيرة جدا للتطبيق المخدرات. أيضا، وجود طرف واحد للبرميل تتجاوز نصائح القطب multibarrel بنحو 20 ميكرومتر يقلل إلى حد كبير من الضوضاء في التسجيلات، وهود يزيل الآثار المحتملة الحالية التباس من التيارات أو الاحتفاظ طرد على إطلاق الخلايا العصبية 3.

وأول مرة منذ إعادة أصبع multibarrel أقطاب وصف أكثر من 30 عاما 4-6 و استخدمت بنجاح كبير لتشريح الدارات العصبية 19-29 7-18. وهكذا، فإن الأسلوب في حد ذاته ليس رواية أو فريدة من نوعها. ومع ذلك، فقد تم تعديل تفاصيل معينة من إعداد واستخدام القطب الكهربائي على مر السنين، ومجموعة من التعليمات الموضحة هنا وقد ثبت أن من السهل خاصة وناجحة، ولم تنشر بالتفصيل في مكان آخر في الأدب. خاصة، والانحناء من طرف واحد برميل الكهربائي يسمح للطرف النهائي من القطب أصبع العودة إلى تكون ضئيلة نسبيا (الشكل 3)، وبالتالي، يسمح للتسجيلات من نوى العميق بأقل ضرر في الدماغ، وجاحظ من برميل واحد القطب الكهربائي على مدى عدة برميل يزيل تقريبا جميع currenر الآثار، والتي كثيرا ما يستشهد كما وضع غير مؤات للتقنية 3. قدم تفاصيل جديدة هنا مثل وجود طرف القطب مشيرا التصاعدي خلال عملية الإلتصاق ويستريح على برميل واحد في أخدود من القطب multibarrel يضمن نسبة نجاح عالية عند إنتاج أصبع إعادة الأقطاب الكهربائية. هذه التقنية سهلة نسبيا ويمكن عادة أن يلم بها مبتدئا في غضون أيام قليلة.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل R01 DC 011582 (AK) وDC011555 RO1 (DJT).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bunsen burner 17928-027 Available from: VWR
Two-component dental cement: "Cold cure" dental material Co-oral-ite Dental Mfg. Co 525000 Available from: A-M Systems, Inc
Two-component dental cement: Denture material crosslinking Liquid Compound Co-oral-ite Dental Mfg. Co 525000 Available from: A-M Systems, Inc
Liquid glue Henkel 01-06849 Available from: Loctite Super Glue
Micro-Iontophoresis Unit: Neurophore BH-2 Harvard Apparatus 65-0200 & 65-0203 Available from: Harvard Apparatus
Insulated silver wire AM-Systems 785500 Available from: AM-Systems
Horizontal puller Zeitz DMZ-Universal Puller NA Available from: AutoMate Scientific
Micro-manipulator pieces: electrode holder WPI M3301EH Available from: WPI
Micro-manipulator pieces: linear stage Newport 423 Series 423 Available from: Newport
Micro-manipulator pieces: rotation stage Newport RSP-2 RSP-2 Available from: Newport
Micro-manipulator pieces: z translation Newport 433 Series 433 Available from: Newport
Micro-manipulator pieces: angle bracket 90 ° to assemble z and xy axis Newport 360-90 360-90 Available from: Newport
Micro-manipulator pieces: x translation / linear stage Newport 423 Series 423 Available from: Newport
Micro-manipulator pieces: y translation / linear stage Newport 423 423 Available from: Series Newport
Microscope Leitz Laborlux 11
Microscope: objective Leitz Wetzlar 10x, NA 0.25 519760
Microscope: eypieces Leitz Wetzlar, Periplan 10x/18 519748
Microscope: stage Leitz Wetzlar 513544
Multibarrel capillary N/A 612000 Available from: A-M systems, Inc
Sinlge barrel capillary (GC 150F-10) Harvard Apparatus 30-0057 Available from: Harvard Apparatus
Vertical puller Narishige model PE-2
Custom made elements of the Micro-manipulator (marked light blue in Figure 1)
steel plate
tilting base
attachment for electrode holder

Table 2. Manufacturers and item numbers of all equipment and supplies used in the procedure.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Curtis, D. R. A method for assembly of "parallel" micro-pipettes. Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 24, 587-589 (1968).
  2. Carette, B. A new method of manufacturing multi-barrelled micropipettes with projecting recording barrel. Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 44, 248-250 (1978).
  3. Crossman, A. R., Walker, R. J., Woodruff, G. N. Problems associated with iontophoretic studies in the caudate nucleus and substantia nigra. Neuropharmacology. 13, 547-552 (1974).
  4. Havey, D. C., Caspary, D. M. A simple technique for constructing "piggy-back" multibarrel microelectrodes. Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 48, 249-251 (1980).
  5. Verberne, A. J., Owens, N. C., Jackman, G. P. A simple and reliable method for construction of parallel multibarrel microelectrodes. Brain Res. Bull. 36, 107-108 (1995).
  6. Oliver, A. P. Technical contribution. A simple rapid method for preparing parallel micropipette electrodes. Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 31, 284-286 (1971).
  7. Oswald, J. P., Klug, A., Park, T. J. Interaural intensity difference processing in auditory midbrain neurons: effects of a transient early inhibitory input. J. Neurosci. 19, 1149-1163 (1999).
  8. Park, T. J., Pollak, G. D. GABA shapes a topographic organization of response latency in the mustache bat's inferior colliculus. J. Neurosci. 13, 5172-5187 (1993).
  9. Park, T. J., Pollak, G. D. GABA shapes sensitivity to interaural intensity disparities in the mustache bat's inferior colliculus: implications for encoding sound location. J. Neurosci. 13, 2050-2067 (1993).
  10. Peterson, D. C., Nataraj, K., Wenstrup, J. Glycinergic inhibition creates a form of auditory spectral integration in nuclei of the lateral lemniscus. J. Neurophysiol. 102, 1004-1016 (2009).
  11. Ramsey, L. C. B., Sinha, S. R., Hurley, L. M. 5-HT1A and 5-HT1B receptors differentially modulate rate and timing of auditory responses in the mouse inferior colliculus. Eur. J. Neurosci. 32, 368-379 (2010).
  12. Wenstrup, J. J., Leroy, S. Spectral Integration in the Inferior Colliculus: Role of Glycinergic Inhibition in Response Facilitation. J. Neurosci. 21, RC124 (2001).
  13. Yang, L., Pollak, G. D. Features of ipsilaterally evoked inhibition in the dorsal nucleus of the lateral lemniscus. Hear. Res. 122, 125-141 (1998).
  14. Yang, L., Pollak, G. D. GABA and glycine have different effects on monaural response properties in the dorsal nucleus of the lateral lemniscus of the mustache bat. J. Neurophysiol. 71, 2014-2024 (1994).
  15. Yang, L., Pollak, G. D. The roles of GABAergic and glycinergic inhibition on binaural processing in the dorsal nucleus of the lateral lemniscus of the mustache bat. J. Neurophysiol. 71, 1999-2013 (1994).
  16. Yang, L., Pollak, G. D., Resler, C. GABAergic circuits sharpen tuning curves and modify response properties in the mustache bat inferior colliculus. J. Neurophysiol. 68, 1760-1774 (1992).
  17. Faingold, C. L., Gehlbach, G., Caspary, D. M. On the role of GABA as an inhibitory neurotransmitter in inferior colliculus neurons: iontophoretic studies. Brain Res. 500, 302-312 (1989).
  18. Faingold, C. L., Hoffmann, W. E., Caspary, D. M. Effects of excitant amino acids on acoustic responses of inferior colliculus neurons. Hear. Res. 40, 127-136 (1989).
  19. Hurley, L., Pollak, G. D. Serotonin shifts first-spike latencies of inferior colliculus neurons. J. Neurosci. 25, 7876-7886 (2005).
  20. Hurley, L., Pollak, G. D. Serotonin effects on frequency tuning of inferior colliculus neurons. J. Neurophysiol. 85, 828-842 (2001).
  21. Hurley, L. M., Pollak, G. D. Serotonin differentially modulates responses to tones and frequency-modulated sweeps in the inferior colliculus. J. Neurosci. 19, 8071-8082 (1999).
  22. Klug, A., Bauer, E. E., Pollak, G. D. Multiple components of ipsilaterally evoked inhibition in the inferior colliculus. J. Neurophysiol. 82, 593-610 (1999).
  23. Klug, A., Park, T. J., Pollak, G. D. Glycine and GABA influence binaural processing in the inferior colliculus of the mustache bat. J. Neurophysiol. 74, 1701-1713 (1995).
  24. Moore, M. J., Caspary, D. M. Strychnine blocks binaural inhibition in lateral superior olivary neurons. J. Neurosci. 3, 237-242 (1983).
  25. Nataraj, K., Wenstrup, J. J. Roles of inhibition in creating complex auditory responses in the inferior colliculus: facilitated combination-sensitive neurons. J. Neurophysiol. 93, 3294-3312 (2005).
  26. Fukui, I., Burger, R. M., Ohmori, H., Rubel, E. W. GABAergic inhibition sharpens the frequency tuning and enhances phase locking in chicken nucleus magnocellularis neurons. J. Neurosci. 30, 12075-12083 (2010).
  27. Burger, R., Pollak, G. D. Reversible inactivation of the dorsal nucleus of the lateral lemniscus reveals its role in the processing of multiple sound sources in the inferior colliculus of bats. J. Neurosci. 21, 4830-4843 (2001).
  28. Burger, R. M., Pollak, G. D. Analysis of the role of inhibition in shaping responses to sinusoidally amplitude-modulated signals in the inferior colliculus. J. Neurophysiol. 80, 1686-1701 (1998).
  29. Coleman, W. L., Fischl, M. J., Weimann, S. R., Burger, R. M. GABAergic and glycinergic inhibition modulate monaural auditory response properties in the avian superior olivary nucleus. J. Neurophysiol. 105, 2405-2420 (2011).
تصنيع واستخدام الخنزير ظهر أقطاب لMultibarrel<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التلاعب الدوائية من الردود العصبية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dondzillo, A., Thornton, J. L., Tollin, D. J., Klug, A. Manufacturing and Using Piggy-back Multibarrel Electrodes for In vivo Pharmacological Manipulations of Neural Responses. J. Vis. Exp. (71), e4358, doi:10.3791/4358 (2013).More

Dondzillo, A., Thornton, J. L., Tollin, D. J., Klug, A. Manufacturing and Using Piggy-back Multibarrel Electrodes for In vivo Pharmacological Manipulations of Neural Responses. J. Vis. Exp. (71), e4358, doi:10.3791/4358 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter