Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

ייצור והשימוש פיגי גב Multibarrel אלקטרודות ל doi: 10.3791/4358 Published: January 18, 2013

Summary

Iontophoresis של אגוניסטים ואנטגוניסטים עצביים במהלך תאי

Abstract

בהקלטות מתא עצב בודד vivo מאפשר לחוקר לבחון את מאפייני הירי של נוירונים, לדוגמה בתגובה לגירויים חושיים. נוירונים בדרך כלל לקבל תשומות מעוררות ומעכבות מרובות הביא ו / או efferent המשתלבים אחד עם השני, ואת מאפייני התגובה נמדדו האולטימטיביים של נוירון מונעים על ידי את האינטגרציות העצביות של תשומות אלה. ללמוד עיבוד מידע במערכות עצביות, יש צורך להבין את הכניסות השונות לתא עצב או במערכת עצבית, ואת המאפיינים הספציפיים של תשומות אלה. שיטה חזקה וטכני יחסית פשוטה כדי להעריך את התפקיד הפונקציונלי של תשומות מסוימות שנוירון נתון שקבל היא דינמי והפיך לדכא או לבטל תשומות אלה, ולמדוד את השינויים בתפוקה של תא העצב הנגרמים על ידי מניפולציה זו. ניתן להשיג זאת על ידי שינוי הסביבה המיידית של תא העצב עם חזירון גב multibarrel אלקטרונ פרמקולוגיתשירי הלל. אלקטרודות אלו כוללות אלקטרודה אחת חבית הקלטה והאלקטרודה תרופת multibarrel שיכול לשאת עד 4 אגוניסטים סינפטיים שונים או יריבים. הסוכנים התרופתיים ניתן ליישם iontophoretically בזמנים רצויים במהלך הניסוי, המאפשרים אספקה ​​הזמן בשליטה ושינוי תצורה הפיך של תשומות הסינפטי. כמניפולציה כזו, תרופתית של microenvironment מייצגת שיטה חזקה ואין כמותו כדי לבחון השערות באופן ספציפי על תפקוד מעגלים עצבי.

כאן אנו מתארים כיצד אלקטרודות חזירון גב מיוצרות, וכיצד משתמש בם בעת בניסויי vivo. מערכת חזירון הגב מאפשרת חוקר לשלב האלקטרודה אחת חבית הקלטה של ​​כל נכס שרירותי (התנגדות, גודל טיפ, וכו 'צורה) עם אלקטרודה תרופת multibarrel. זה יתרון גדול על פני אלקטרודות רבות סטנדרטיות, שבו כל החביות פחות או יותר צורות ומאפיינים דומים. Multibarrel דוארlectrodes הוצגו לראשונה לפני יותר מ 40 שנים 1-3, ועבר מספר השיפורים בעיצוב 2,3 עד סוג חזירון הגב הוצג בשנת 1980 4,5. כאן אנו מציגים סדרה של שיפורים חשובים בייצור המעבדה של אלקטרודות חזירון גב המאפשרים חדיר עמוק במוח שלם בהכנות בעלי חי vivo עקב פיר אלקטרודה דקה יחסית שגורם לניזק מינימאלי. יתר על כן אלקטרודות אלו מאופיינות הקלטות רעש נמוכות, ויש לי חביות סמי התנגדות נמוכות לiontophoresis יעיל מאוד של הסוכנים התרופתיים הרצויים.

Protocol

  1. משוך אלקטרודות זכוכית

    משוך אלקטרודות זכוכית
    1. משוך האלקטרודה חבית אחת. השתמש זכוכית חבית אחת נימים עם נימה ולמשוך קצה לקוטר של כ 1-2 מיקרומטרים, אורך גל של 10-12 מ"מ, והתנגדות האלקטרודה מקבילה של כ 12 MOhm (טווח 5-20 MOhms) כפי שנמדד בתמיסת NaCl 0.9%. התנגדויות אלקטרודה נמוכות תבאנה בפעילות רקע יותר ולכן קשה יותר לבודד פעילות אחידה מתא עצב בודד. עבור משייכת אלקטרודה זו, השתמש בקו אופקי או אנכי חולץ עם או חוטי חימום או סלילי חימום.
    2. משוך האלקטרודה multibarrel. בשל קוטר הרבה יותר הגדול של זכוכית multibarrel ואת הצורך של פיזור חום אפילו סביב כל multibarrel, מושך חזק עם סליל גדול קוטר חימום, ולא חוט חימום, יש צורך. פיפטה multibarrel צריכה להיות מוכנסת במרכז חוט החימום עם no לפנות לסליל החימום. שימו לב שמלבד את pipettes 5-החבית מתוארת כאן, 3-חבית או החבית 7 pipettes חלופות מסחריות זמינות. משוך זכוכית לקצה פיפטה של ​​כ 10 מיקרומטר קוטר כולל, או פחות. טיפ יהיה שבור לקוטר הנכון בשלב הבא, כך שגודל הטיפ המדויק הוא פחות קריטי בתהליך מושך מהצורה הכללית של קצה האלקטרודה, שאמורה להיות ארוך ודק יחסית. עיין בתמונה באיור 1C לצורת קצה האלקטרודה הרצויה. צורות אלקטרודה קצרות ועבות (האיור 1B) תגרומנה לכמות משמעותית של ניזק לרקמה, כאשר התקדמו לתוך המוח, ואילו צורות אלקטרודה ארוכות מאוד ודקות (איור 1 א) תהיינה לכופף ובכך תהפוכנה את זה קשה לשבור את קצה האלקטרודה לנכונה קוטר (ראה שלב 2).
  2. שנה טיפי אלקטרודה

    שנה טיפי אלקטרודות. לפני שתי אלקטרודות יכולות להיות מודבקות יחד, הם צריכים להיות שונים. הפיר של האלקטרודה היחידה צריך להיות כפוף לפני זה יכול להיות מחובר לmultibarrel לוודא הפיר המשולב של האלקטרודה המוגמרת חזירון הגב הוא דק ככל האפשר. בנוסף, קצה האלקטרודה multibarrel יש לשבור את כדי להבטיח עמידות נמוכה לiontophoresis.
    1. כופף את המוט של האלקטרודה חבית אחת של כ 20 מעלות. השתמש להבת בונזן המבער הקטנה ביותר האפשרית. מבערים טיפוסיים "קטנים" בונזן מחברות אספקת מעבדה הרגילות ליצור גדלי להבה, כי הם גדולים מדי עבור יישום זה. כדי לעקוף בעיה זו להשתמש במבער בונזן המסחרי הקטן ביותר ולהבטיח את מחט מזרק (~ 18 מד) לראש המבער, ולאטום את החיבור באמצעות מלט שיניים. כאשר מופעלים, הלהבה צריכה להיות קשה לראות, בערך 5 מ"מ או פחות בקוטר, וכ 8 מ"מ גבוה. כל תנועת האוויר בחדר תהיה לכבות אש ש, כך שזה רעיון טוב לפעול בצורבחדר סגור, או להשתמש במגן רוח. העבר את האלקטרודה חבית אחת דרך הלהבה כדי לכופף אותו בכ 20 מעלות. שואף להיות להבת המבער ממסה את הזכוכית באזור המעבר בכ 10 מילימטרים ספורים מקצה האלקטרודה. כדי למנוע התכת קצה האלקטרודה אנו מציעים שנתקיים באלקטרודה על 45 מעלות, קצה כלפי מטה, ולהזיז את האלקטרודה דרך הלהבה במהירות יחסית.
    2. לשבור את קצה האלקטרודה multibarrel. כדי להבטיח בקרה חזותית תוך שבירת קצה האלקטרודה, השתמש במיקרוסקופ במטרת 10x מינימום וoculars 10x. היקף מדידה מוכנס העיני יהיה גם צורך למדוד גדלי טיפ. צרף חתיכת פרספקס למיקרוסקופ כזה שסופו של פרספקס ניתן לראות כבשליש למחצית משדה הראייה של המיקרוסקופ. במקרה שלנו, חתיכת פרספקס היא כ 70 מ"מ x 25 מ"מ עובי ו 5 ומחובר באמצעות בורג שיכול להיות מאובטח למנהגעשה נושא בשלב מיקרוסקופ. חשוב יש עיצוב שמאפשר לפרספקס נע באופן עצמאי של השקופית. הנח את האלקטרודה multibarrel במיטה של ​​פלסטלינה בשקופית זכוכית, ולהכניס את השקופית המכילה את האלקטרודה לתוך החזיק השקופיות של במת מיקרוסקופ. שימוש המניפולטורים XY של במת מיקרוסקופ, בעדינות להזיז את קצה האלקטרודה נגד חתיכת פרספקס, ולבחון את השבירה של הקצה דרך oculars המיקרוסקופ. תנסה נקי כדי לשבור הקצה של multibarrel לקוטר מצטבר של כ 25-35 מיקרומטרים. השלך pipettes עם קוטר טיפ שפרץ את גדול מדי, או טיפים עם הפסקות לא אחידות. אנחנו זורקים כ 30% מאלקטרודות multibarrel בשל צורות עצה לא רצויות.
  3. להרכיב אלקטרודה פיגי גב

    להרכיב האלקטרודה חזירון גב.
    1. אלקטרודות עמדה. הסרת חתיכת פרספקס משמשת בשלב 2.2 מבמת מיקרוסקופ. Secure השליםmultibarrel האלקטרודה לפלסטלינה בשקופית זכוכית, עצה מצביעה מעט כלפי מעלה. מצביע כלפי מעלה יהיה חשוב עבור צעד 3.2, ההדבקה של שתי אלקטרודות. טיפים שמצביעים בעד לגרום לדבק לברוח מהקצה, הימנעות הדבקת קצות אלקטרודות. הכנס האלקטרודה חבית אחת כפופה למחזיק האלקטרודה של micromanipulator בהתאמה האישי (איור 2). השימוש הראשון ולאחר מכן הדרכה חזותית הנחיה מיקרוסקופית, להנמיך את האלקטרודה חבית אחת על האלקטרודה multibarrel. אלקטרודה הבודדה לא צריכה להיות וריד ישירות לתוך החריץ שנוצר על ידי הסידור של 5 חביות, בקצו הבולט בקצה של קצה multibarrel כ מיקרומטרים 5-10. כאשר מורידים את החבית אחת, עוקב בקפידה אחרת הזווית שנוצרת בין שתי אלקטרודות. לתוצאה הטובה ביותר להימנע מכל זוויות שבקצוות להצביע בנפרד אחד מהשני, אלא מנסים להנמיך את האלקטרודה אחת על רב בצורה מושלמת במקביל או אפילו בקצונגיעת multibarrel הראשון, ויצר הסדר "טריז" קל מאוד. מאז את קצה חבית אחת הוא מאוד גמיש, הוא מתכופף כאשר האלקטרודה היחידה היא הורידה עוד קצת אחרי הקצה הגיע המשטח העליון של האלקטרודה החבית הרבה, ויוצר קצה משולב נקי שיש כמות קטנה של פעולת מעיין נבנתה ב המסייע להחזיק את העצות ביחד. עם זאת, אם הזווית בין חבית אחת ואלקטרודה multibarrel היא תלולה מדי (יותר מדי של טריז), שהקפיץ יהיה גבוה מדי ולכופף את מטה הסדר אלקטרודות.
    2. פירי דבק אלקטרודה יחד. דבקים בפירים של שתי אלקטרודות יחד באמצעות cyanoacrylate (דבק מגע). הנח טיפה קטנה של דבק על הצד הקטן של קיסם שטוח והרכבת האלקטרודה מגע עם טיפת הדבק. התחל במיקום המרוחק ביותר של העצות ולהעביר קיסם לאט עם טיפת דבק לאורך פירים אלקטרודה כלפי טיפי אלקטרודות. שימוש יותר מדי דבק, או החלת דבק לאoo קרוב לטיפים אלקטרודה יגרום הדבקת פתחי אלקטרודה, טיוח האלקטרודה לפחות חלקית מתפקד.
    3. לייצב משותף עם מלט שיניים. מערבבים כמות קטנה של מלט שיניים ואקריליק שיניים בצלחת פלסטיק חד פעמית קטנה או שוקל סירה, באמצעות קיסם שטוח. חכה עד מלט הופך moldable ולהחיל כמות קטנה למפרק בין שתי אלקטרודות מנת לייצב את המפרק (חומר ורוד באיור 3). אפשר כ 15 דקות לייבוש.
    4. הסר ולאחסן אלקטרודה. להסיר בזהירות את האלקטרודה חזירון הגב סיים ראשון מבעל micromanipulator, ולאחר מכן לנתק אותה מהזכוכית השקופית, וחנות במכל dustproof.
  4. הכן את פתרוני אלקטרודה מילוי

    הכן את האלקטרודה פתרוני מילוי. מאז iontophoresis דורש מולקולות טעונות, רוב הסוכנים צריכים להיות מומסים או בסביבת חומצית או בסיסית (בדרך כללta-pH של כ 3-4, או pH של כ 8-10, בהתאמה). מספר הכימיקלים המשמשים לעתים קרובות בiontophoresis מופיעים בטבלת 1. לסוכנים שאינם מופיעים בטבלה, לקבוע מערך PKA, בין אם זה יהיה קל יותר לשימוש במולקולה חומצית או סביבה בסיסית כדי לשמור על המולקולה טעונה, ולפזר בהתאם. לקבלת תוצאות הטובות ביותר, מערבב את כל הפתרונים טריים מדי יום.
  5. מלא והכן אלקטרודות

    מלא ולהכין אלקטרודות. רק לפני השימוש באלקטרודה, גב למלא כל חבית עם התרופה המתאימה, באמצעות סיבי פחם 28-34 מחטי מד מחוברים למזרקים עם מסנני מזרק. מלא את 4 חביות החיצוניות של התצורה 5-החבית עם תרופות של בחירה, וחבית מרכז עם 3M NaCl כחבית איזון. מלא את האלקטרודה הקלטת חבית אחת עם 3M NaCl גם כן. הוספת צבע לפתרון NaCl, כגון אדום ירוק או פנול מהיר תקל לראות קצה האלקטרודהבמהלך ההשמה של האלקטרודה על משטח המוח. הכנס את האלקטרודה לתוך מחזיק האלקטרודה של הגדרת ההקלטה ולהכניס את כל החוטים לתוך חביות הזכוכית המתאימות. השתמש בחוט כסף מבודד ממנו כ 1 הסנטימטר של בידוד הוסר בקצה. לא צריך להיות 5 חוטים לאלקטרודה multibarrel (4 חביות סמים וחבית איזון 1), בתוספת חוט המגבר שצריך להיות מוכנסים לתוך חבית האלקטרודה הקלטה האחת.
  6. הפעל מודולים משאבת Iontophoresis

    הפעל מודולים משאבת iontophoresis ולבדוק את כל החביות. פונקצית בדיקת האלקטרודה של כל מודול משאבה תעזור לקבוע אם חבית אלקטרודה היא פונקציונלית. כדי למנוע דליפה של תרופות מהחביות כשאינן בשימוש, מתח שייר בקוטביות ההפוכה כאחראי המולקולה צריך להיות מיושם.

Representative Results

בניסוי זה, hydrochloride סטריכנין אנטגוניסטית גליצין יושם iontophoretically. חסימת עיכוב glycinergic בדרך כלל עולה ירי בנוירונים. איור 4 מראה נתונים לדוגמה מתא עצב שמיעתי שתגובות לגירויים קוליים סינוסי של אינטנסיביות גוברת נמסרה לאוזניים של בעלי החיים נרשמו. סוג זה של ניסוי שמכונה תפקוד של הנוירון הפרשות בשיעור לעומת העצמה. נשמע קולות הביאו לשיעורים גבוהים יותר ספייק (עקום שחור). הנוכחי iontophoresis הראשונה השתמש במהלך ניסוי זה היה 15 NA. לאחר הנוכחי היה מופעל והשינויים בתפקוד עוצמת השיעור התייצבו ברמה החדשה שלהם (עקומת כחול כהה), הפליטה הנוכחית הוגדל בהדרגה עד 30, 45, ו 60 NA (כתום, ירוקים, ועקומות אור כחול, בהתאמה). בכל מקרה, את התגובות של הנוירון על אותו טווח עוצמות קול נרשמו לאחר השינויים בdischaפונקציות שיעור בעצמת rge בתגובה לזרם הפליטה החדש התייצבו. הפליטה הנוכחית להשתמש בדוגמה זו המתאימה ביותר הייתה 45 Na Na עד 60 כי הרמות אלה של נוכחיים כבר לא לשנות את התגובות של נוירונים אחרים. תוצאה זו מרמזת כי בגיל 45 Na הנוכחי, כל הקולטנים של גליצין שנוירון כבר נחסם על ידי הידרוכלוריד סטריכנין. כל עלייה נוספת של הפליטה סטריכנין הנוכחי ומשחרר עוד יותר לא הביאה לשינוי נוסף בתפקודו של תא עצב פריקת שיעור ברמה. לאחר סיום הפרוטוקול, הפליטה הנוכחית היה כבוי. ההתאוששות של תגובות עצביות חוזרים לנקודת ההתחלה הושגה לאחר כ 25 דקות (קו אדום). זה עלול לקחת, תלוי בסוג וכמות הסם נפלט, בין כמה שניות וכמה עשרות דקות.

תרופה התרכזות ה-pH של תמיסה ממס חברה חתול. # שייר אופייני נוכחי זרמי פליטה אופייניים
GABA 500 מ"מ 3.5-4.0 DH 2 O סיגמא -2129 Na -15 5 Na Na ל100
גליצין 100 מ"מימ 3.5-4.0 DH 2 O סיגמא G-7126 Na -15 5 Na Na ל100
Methiodide Bicuculline 10 mM 3.0 0.165 M NaCl בDH 2 O סיגמא B-6889 Na -15 5 Na Na ל60
hydrochloride סטריכנין 10 mM 3.0 0.165 M NaCl בDH 2 O סיגמא S-8753 Na -15 5 Na Na ל80
חומצת L-גלוטמית 500 מ"מ 8.0 DH 2 O סיגמא G-1251 30 Na -10 Na Na ל-150
חומצה אספרטית L- 500 מ"מ 8.0 DH 2 O סיגמא -8949 30 Na -10 Na Na ל-150
חומצת Kainic 1 mM 9.0 DH 2 O סיגמא K-0250 30 Na -10nA ל -100 Na

לוח 1. תרופות נפוצות, עם חומציות להמסה וריכוז. הטבלה מפרטת את אגוניסטים הנפוצים ביותר הסינפטי ואת היריבים בשימוש עם iontophoresis. סביבת ה-pH רשום חשבונות לצורך לקטב t סוכני hese, ואת חשבונות הריכוז הציעו לשונות ביעילות בין תרופות שונות.

איור 1
איור 1. שלוש multibarrel pipettes עם אורכי עצה שונים: A. קצה האלקטרודה 5-חבית זה כבר משך ארוך ודק מדי. שים לב שהקצה הוא כפוף ורך מאוד. סוג זה של קצה הוא קשה מאוד לשבור לקוטר הרצוי. ב ': קצה אלקטרודה זו הוא קצר ועבה מדי. כשהתקדם לתוך אזורי מוח עמוקים יותר, אלקטרודה זו תגרום ניזק מוחי מיותר בשל העובדה שהופכת את האלקטרודה עבה יחסית רק כמה מילימטרים אחרי הקצה. C: דוגמה לאלקטרודה עם טיפ משך בצורה נכונה. בעת היותו ארוך ודק, הקצה עדיין יציב ויכול להישבר בקלות לקצה הקוטר הרצוי.

gure 2 "src =" / files/ftp_upload/4358/4358fig2.jpg "/>
איור 2. ציור של הרכבת מניפולטור אלקטרודה. הרכבת מניפולטור משמשת יחד עם מיקרוסקופ כדי להרכיב את האלקטרודות חזירון הגב. פריטים המסומנים באפור מוצרים זמינים מסחרי ורשומים בטבלה 2. פריטים המסומנים בכחול המנהג היו במכונה בחנות המכונות של המוסד שלנו. הם 1) 1/4 סנטימטר אינץ פלדת צלחת בגודל 43x26 עם חורים לבמת ניופורט 423 קדחה לתוכו בהתאם לדפוס החור מסופק על ידי ניופורט, 2) בשלב הטיה המאפשר הטיה של ההרכבה בזוויות שרירותיות; 3) מחבר שעולה על בעל אלקטרודה לבמת translational העליונה.

איור 3
איור 3. תמונה של מדגם האלקטרודה חזירון גב. האלקטרודה 5-חבית מוגמרת התאספה יחד עם הקלטת אל יחיד חביתectrode. שים לב ארוך פיר של כ 7mm מאפשר להקלטות מוחיות עמוקות.

איור 4
איור 4. טיטרציה של זרמי פליטה. הגרף מראה פונקציות שיעור בעצימות שנרשמו מתא עצב שמיעת יחידה תוך אוזניו של בעלי חי המגורה עם גוונים של עוצמות שונות. נשמע קולות נטו לעורר שיעורי ירי גבוהים יותר. לפני יישום תרופה, פונקצית שיעור בעצימות של נוירון הראתה שיעורי ספייק הנמוכים ביותר (עקום שחור). זרמי פליטת הדרגה גבוהות יותר נחסמו בהדרגה יותר קולטניים גליצין בנוירון, וכתוצאה מכך שיעורי ירי שעלה בהדרגה. הפליטה האופטימלית הנוכחית בנוירון זה הייתה 45-60 NA. עם זרמי פליטה אלה, חסימה מוחלטת של כל קולטניים גליצין של נוירון הושגה. לאחר השלים פרוטוקול הניסוי, iontophoresis הופסק ונוירון הורשלהתאושש. החלמה מלאה הושגה כאשר פונקצית התאוששות שיעור בעצימות מתאימה פונקצית ההתאוששות מראש תרופה הראשונית. לשכפל, באישור האגודה הפיזיולוגית האמריקנית, מקלוג et al, 1995.

Discussion

אנו מתארים טכניקה שמאפשרת המניפולציה של Microcircuit של נוירון הבודד in vivo, ואילו באותו הזמן המאפשר הקלטה של התגובות של נוירון במניפולציה הניסויית. מעגלים עצביים הם מניפולציה באמצעות יישום iontophoretical של אגוניסטים ואנטגוניסטים הסינפטי. היתרון העיקרי של iontophoresis על פליטת לחץ הוא iontophoresis שאינו דורש תנועה הפיסית של נוזל מהאלקטרודה לתוך רקמה עצבית, ולכן אין חשש לגרימת ניזק לרקמות בעזרת לחץ שהפעיל או נפח נוזל. המגבלה העיקרית של שיטה זו היא חוסר מידע על הריכוז המוחלט תרופה ברקמות, ונפח של רקמה נגועה. עם זאת, מאחר והכמויות של סוכנים תרופתיים נפלטו עם iontophoresis הם הרבה יותר קטנות והרבה יותר מדויקת לשליטה מאשר עם פליטת לחץ, ההתאוששות מיישום התרופה היא בדרך כלל הרבה יותר מהרד הרבה יותר מלא. Microiontophoresis בהצלחה בשימוש במספר המערכות עצביות, חושיים ואחרים, ומיושמת בהצלחה רבה באזורים במוח עם מעט או ללא עיבוד פנימי. הסיבה היא שחלק מהתרופתי עשוי לנטרל נפלטו מאתר הבקשה לנוירון השכן וגם לתפעל את מאפייני התגובה של תא העצב הסמוך.

הייצור הנפרד של אלקטרודות חבית האחת ורבה מאפשר שילוב של אלקטרודות עם מאפיינים שרירותיים ולא קשורים. מושך חביות אלקטרודה יחד ובעזרת כמה להקלטה וכמה למטרות iontophoresis יפיק טיפי אלקטרודה עם תכונות דומות מאוד, כך שטיפי אלקטרודה אחת יהיו גדולים מדי להקלטת תא בודדה, או קטנה מדי ליישום תרופה. כמו כן, בעל קצה חבית האחת להרחיב מעבר לטיפים אלקטרודה multibarrel של כ 20 מיקרומטרים מקטין מאוד רעש בהקלטות,ד מבטל השפעות נוכחיות מבלבלות אפשריות מזרמי השמירה או פליטה על הירי של נוירון 3.

פיגי גב multibarrel אלקטרודות ש1 תוארו לפני 30 שנים ויש לי 4-6 מיושמות בהצלחה רבה לנתח מעגלים עצביים 7-18 19-29. לכן, שיטת כשלעצמה אינה רומן או ייחודית. עם זאת, פרטים המסוימים של הכנה ושימוש באלקטרודה שונו במשך השנים, והקבוצה של הוראות המתוארות כאן הוכיחה להיות קל ומוצלחת במיוחד, ולא פורסמו בהרחבה במקומות אחר בספרות. במיוחד, הכיפוף של קצה האלקטרודה חבית האחת מאפשר הקצה הסופי של האלקטרודה קופת חיסכון, חזרה להיות דק יחסית (איור 3) ובכך, מאפשר להקלטות מגרעינים עמוקים עם ניזק מינימאלי למוח; בולט של חבית האחת האלקטרודה על האלקטרודה רבה החבית מסירה כמעט כל currenהשפעות לא, שלעתים קרובות היו מצוטטות כמו חסרון של השיטה 3. פרטים חדשים שהוצגו כאן כמו שיש קצה האלקטרודה מצביע כלפי מעלה במהלך תהליך ההדבקה ונח חבית אחת בחריץ של האלקטרודה multibarrel יבטיח שיעור הצלחה גבוהה כאשר ייצור אלקטרודות חזירון גב. הטכניקה היא קלה יחסית ובדרך כלל יכולה להיות השתלטה על ידי טירון בתוך ימים ספורים.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgments

העבודה נתמכה על ידי R01 DC 011582 (AK) וRO1 DC011555 (DJT).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bunsen burner 17928-027 Available from: VWR
Two-component dental cement: "Cold cure" dental material Co-oral-ite Dental Mfg. Co 525000 Available from: A-M Systems, Inc
Two-component dental cement: Denture material crosslinking Liquid Compound Co-oral-ite Dental Mfg. Co 525000 Available from: A-M Systems, Inc
Liquid glue Henkel 01-06849 Available from: Loctite Super Glue
Micro-Iontophoresis Unit: Neurophore BH-2 Harvard Apparatus 65-0200 & 65-0203 Available from: Harvard Apparatus
Insulated silver wire AM-Systems 785500 Available from: AM-Systems
Horizontal puller Zeitz DMZ-Universal Puller NA Available from: AutoMate Scientific
Micro-manipulator pieces: electrode holder WPI M3301EH Available from: WPI
Micro-manipulator pieces: linear stage Newport 423 Series 423 Available from: Newport
Micro-manipulator pieces: rotation stage Newport RSP-2 RSP-2 Available from: Newport
Micro-manipulator pieces: z translation Newport 433 Series 433 Available from: Newport
Micro-manipulator pieces: angle bracket 90 ° to assemble z and xy axis Newport 360-90 360-90 Available from: Newport
Micro-manipulator pieces: x translation / linear stage Newport 423 Series 423 Available from: Newport
Micro-manipulator pieces: y translation / linear stage Newport 423 423 Available from: Series Newport
Microscope Leitz Laborlux 11
Microscope: objective Leitz Wetzlar 10x, NA 0.25 519760
Microscope: eypieces Leitz Wetzlar, Periplan 10x/18 519748
Microscope: stage Leitz Wetzlar 513544
Multibarrel capillary N/A 612000 Available from: A-M systems, Inc
Sinlge barrel capillary (GC 150F-10) Harvard Apparatus 30-0057 Available from: Harvard Apparatus
Vertical puller Narishige model PE-2
Custom made elements of the Micro-manipulator (marked light blue in Figure 1)
steel plate
tilting base
attachment for electrode holder

Table 2. Manufacturers and item numbers of all equipment and supplies used in the procedure.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Curtis, D. R. A method for assembly of "parallel" micro-pipettes. Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 24, 587-589 (1968).
  2. Carette, B. A new method of manufacturing multi-barrelled micropipettes with projecting recording barrel. Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 44, 248-250 (1978).
  3. Crossman, A. R., Walker, R. J., Woodruff, G. N. Problems associated with iontophoretic studies in the caudate nucleus and substantia nigra. Neuropharmacology. 13, 547-552 (1974).
  4. Havey, D. C., Caspary, D. M. A simple technique for constructing "piggy-back" multibarrel microelectrodes. Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 48, 249-251 (1980).
  5. Verberne, A. J., Owens, N. C., Jackman, G. P. A simple and reliable method for construction of parallel multibarrel microelectrodes. Brain Res. Bull. 36, 107-108 (1995).
  6. Oliver, A. P. Technical contribution. A simple rapid method for preparing parallel micropipette electrodes. Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 31, 284-286 (1971).
  7. Oswald, J. P., Klug, A., Park, T. J. Interaural intensity difference processing in auditory midbrain neurons: effects of a transient early inhibitory input. J. Neurosci. 19, 1149-1163 (1999).
  8. Park, T. J., Pollak, G. D. GABA shapes a topographic organization of response latency in the mustache bat's inferior colliculus. J. Neurosci. 13, 5172-5187 (1993).
  9. Park, T. J., Pollak, G. D. GABA shapes sensitivity to interaural intensity disparities in the mustache bat's inferior colliculus: implications for encoding sound location. J. Neurosci. 13, 2050-2067 (1993).
  10. Peterson, D. C., Nataraj, K., Wenstrup, J. Glycinergic inhibition creates a form of auditory spectral integration in nuclei of the lateral lemniscus. J. Neurophysiol. 102, 1004-1016 (2009).
  11. Ramsey, L. C. B., Sinha, S. R., Hurley, L. M. 5-HT1A and 5-HT1B receptors differentially modulate rate and timing of auditory responses in the mouse inferior colliculus. Eur. J. Neurosci. 32, 368-379 (2010).
  12. Wenstrup, J. J., Leroy, S. Spectral Integration in the Inferior Colliculus: Role of Glycinergic Inhibition in Response Facilitation. J. Neurosci. 21, RC124 (2001).
  13. Yang, L., Pollak, G. D. Features of ipsilaterally evoked inhibition in the dorsal nucleus of the lateral lemniscus. Hear. Res. 122, 125-141 (1998).
  14. Yang, L., Pollak, G. D. GABA and glycine have different effects on monaural response properties in the dorsal nucleus of the lateral lemniscus of the mustache bat. J. Neurophysiol. 71, 2014-2024 (1994).
  15. Yang, L., Pollak, G. D. The roles of GABAergic and glycinergic inhibition on binaural processing in the dorsal nucleus of the lateral lemniscus of the mustache bat. J. Neurophysiol. 71, 1999-2013 (1994).
  16. Yang, L., Pollak, G. D., Resler, C. GABAergic circuits sharpen tuning curves and modify response properties in the mustache bat inferior colliculus. J. Neurophysiol. 68, 1760-1774 (1992).
  17. Faingold, C. L., Gehlbach, G., Caspary, D. M. On the role of GABA as an inhibitory neurotransmitter in inferior colliculus neurons: iontophoretic studies. Brain Res. 500, 302-312 (1989).
  18. Faingold, C. L., Hoffmann, W. E., Caspary, D. M. Effects of excitant amino acids on acoustic responses of inferior colliculus neurons. Hear. Res. 40, 127-136 (1989).
  19. Hurley, L., Pollak, G. D. Serotonin shifts first-spike latencies of inferior colliculus neurons. J. Neurosci. 25, 7876-7886 (2005).
  20. Hurley, L., Pollak, G. D. Serotonin effects on frequency tuning of inferior colliculus neurons. J. Neurophysiol. 85, 828-842 (2001).
  21. Hurley, L. M., Pollak, G. D. Serotonin differentially modulates responses to tones and frequency-modulated sweeps in the inferior colliculus. J. Neurosci. 19, 8071-8082 (1999).
  22. Klug, A., Bauer, E. E., Pollak, G. D. Multiple components of ipsilaterally evoked inhibition in the inferior colliculus. J. Neurophysiol. 82, 593-610 (1999).
  23. Klug, A., Park, T. J., Pollak, G. D. Glycine and GABA influence binaural processing in the inferior colliculus of the mustache bat. J. Neurophysiol. 74, 1701-1713 (1995).
  24. Moore, M. J., Caspary, D. M. Strychnine blocks binaural inhibition in lateral superior olivary neurons. J. Neurosci. 3, 237-242 (1983).
  25. Nataraj, K., Wenstrup, J. J. Roles of inhibition in creating complex auditory responses in the inferior colliculus: facilitated combination-sensitive neurons. J. Neurophysiol. 93, 3294-3312 (2005).
  26. Fukui, I., Burger, R. M., Ohmori, H., Rubel, E. W. GABAergic inhibition sharpens the frequency tuning and enhances phase locking in chicken nucleus magnocellularis neurons. J. Neurosci. 30, 12075-12083 (2010).
  27. Burger, R., Pollak, G. D. Reversible inactivation of the dorsal nucleus of the lateral lemniscus reveals its role in the processing of multiple sound sources in the inferior colliculus of bats. J. Neurosci. 21, 4830-4843 (2001).
  28. Burger, R. M., Pollak, G. D. Analysis of the role of inhibition in shaping responses to sinusoidally amplitude-modulated signals in the inferior colliculus. J. Neurophysiol. 80, 1686-1701 (1998).
  29. Coleman, W. L., Fischl, M. J., Weimann, S. R., Burger, R. M. GABAergic and glycinergic inhibition modulate monaural auditory response properties in the avian superior olivary nucleus. J. Neurophysiol. 105, 2405-2420 (2011).
ייצור והשימוש פיגי גב Multibarrel אלקטרודות ל<em&gt; בחי</em&gt; מניפולציות תרופתיות של תגובות עצביות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dondzillo, A., Thornton, J. L., Tollin, D. J., Klug, A. Manufacturing and Using Piggy-back Multibarrel Electrodes for In vivo Pharmacological Manipulations of Neural Responses. J. Vis. Exp. (71), e4358, doi:10.3791/4358 (2013).More

Dondzillo, A., Thornton, J. L., Tollin, D. J., Klug, A. Manufacturing and Using Piggy-back Multibarrel Electrodes for In vivo Pharmacological Manipulations of Neural Responses. J. Vis. Exp. (71), e4358, doi:10.3791/4358 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter