Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Için Multibarrel Elektrodları Üretim ve Piggy-back kullanma doi: 10.3791/4358 Published: January 18, 2013

Summary

Ekstrasellüler sırasında nöral agonistleri ve antagonistleri İyontoforez

Abstract

Tek nöronların vivo kayıtlarında bir araştırmacı duyusal uyaranlara yanıt, örneğin nöronların ateşleme özelliklerini incelemek için izin verir. Nöronlar genellikle birbirleri ile entegre çoklu eksitatör ve inhibitör afferent ve / veya efferent girdileri almak ve nöron nihai ölçülen yanıt özellikleri bu girişlerin nöral entegrasyonları ile tahrik edilmektedir. Sinir sistemlerinin bilgi işleme incelemek için, bir nöron veya sinir sistemine çeşitli girdiler anlamak için gerekli olduğunu ve bu girdilerin belirli özellikleri. Belirli bir nöron aldığını belli girdilerin fonksiyonel rolünü değerlendirmek için güçlü ve teknik olarak nispeten basit bir yöntem dinamik ve geri dönebilen bastırmak ya da yok bu girişler, ve bu manipülasyona neden nöronun çıktı değişiklikleri ölçmek için. Bu farmakolojik piggy-back multibarrel elektrikli olan nöron yakın çevresini değiştirerek gerçekleştirilebilirgazeller. Bu elektrotlar tek bir varil kayıt elektrot ve 4 farklı sinaptik agonist veya antagonist kadar taşıyabilen bir multibarrel ilaç elektrot oluşur. Farmakolojik ajanlar zaman kontrollü dağıtım ve sinaptik giriş tersinir yeniden sağlayan, deney sırasında istenilen zaman iontophoretically uygulanabilir. Mikroçevresinin gibi, Farmakolojik manipulasyon nöral devre fonksiyonu hakkında spesifik hipotezleri test etmek için güçlü ve benzersiz yöntemi temsil eder. Gibi

Burada piggy-back elektrotlar üretilmektedir nasıl tanımlamak ve nasıl in vivo deneyler sırasında kullanılır. Piggy-back sistemi bir araştırmacı bir multibarrel uyuşturucu elektrot ile herhangi bir keyfi özelliği tek bir varil kayıt elektrot (direnç, ucu boyutu, şekli vb) birleştirmek sağlar. Bu, tüm varil daha fazla veya daha az benzer şekil ve özelliklere sahip standart çok elektrotlar üzerinde önemli bir avantajdır. Multibarrel electrodes ilk 40 yıl önce 1-3 tanıtıldı ve piggy-back türü 1980'lerde 4,5 tanıtıldı kadar tasarım geliştirmeleri 2,3 bir dizi uğramıştır. Burada az zarar nispeten ince elektrot şaftının nedeniyle vivo hayvan hazırlıkları bozulmamış derin beyin penetrasyon için izin piggy-back elektrotlar laboratuvar üretiminde önemli iyileştirmeler bir dizi sunuyoruz. Bundan başka, bu elektrotların düşük ses kayıtları ile karakterize olan ve arzu edilen farmakolojik maddelerin çok etkili bir iyontoforez için düşük dirençli bir ilaç varil sahiptir.

Protocol

  1. Cam elektrotlar çekin

    Cam elektrotlar çekin
    1. Tek beşik elektrot çekin. Filamanlı kapiller tek beşik camını kullanın ve ölçülen yaklaşık 1-2 mikrometre, 10-12 mm şaft uzunluğu ve yaklaşık 12 MOhm karşılık gelen elektrot direnci (aralık 5-20 MOhms) bir çapa ucu çekin % 0.9 'luk NaCl çözeltisi içinde. Alt elektrot dirençleri daha fazla arka plan aktivitesi ile sonuçlanabilir ve bireysel nöronların üniter aktivite yalıtma dolayısıyla daha zor olurdu. Bu elektrot çekme için, ısıtma rezistanslarının ya da ısıtma bobinleri ya da birlikte bir yatay ya da dikey ya da çekici kullanır.
    2. Multibarrel elektrot çek. Multibarrel camın çok daha büyük bir çap ve tüm multibarrel etrafında eşit bir ısı dağılımı olan ihtiyacı nedeniyle, daha büyük çaplı bir ısıtma bobini, bir ısıtma filaman, güçlü bir çektirme gereklidir. Bir pipet multibarrel n ile ısıtma filaman merkezinden yerleştirilmiş olması gerekiro ısıtma bobini ile temasa geçiniz. Bunun yanında, 5-namlu pipetler burada açıklanan dikkat ediniz, 3-varil ya da 7-varil pipetler ticari olarak temin alternatiflerdir. Yaklaşık 10 mikrometre toplam çapı, ya da daha az bir pipet cam çekin. Ucu, bir sonraki adımda doğru çapına kırık, bu nedenle uç tam boy uzun ve nispeten ince olması gerekir elektrot ucu genel şekle göre, daha çekme işlemi sırasında daha az kritiktir. İstenilen elektrot ucu şekil için Şekil 1C yılında resme bakın. Çok uzun ve ince elektrot şekiller (Şekil 1A) viraj olacak ve böylece zor doğru için elektrot ucu kırmak için yapacak ise kısa ve küt elektrot şekiller (Şekil 1B), beyin içine ilerletilir doku hasarı önemli miktarda neden olur çap (adım 2).
  2. Elektrot ipuçları Değiştir

    Elektrot uçları değiştirin. Iki elektrot birbirine yapıştırılmış olabilir önce, Bunlar modifiye edilmesi gerekir. Tek bir elektrot arasında şaft da bitmiş domuz geri elektrot bileşik şaft mümkün olduğu kadar ince olduğundan emin olmak için multibarrel eklenebilir önce bükülmüş gerekmektedir. Buna ek olarak, multibarrel elektrot ucu iyontoforez için düşük direnç sağlamak için kesilmek sahiptir.
    1. Yaklaşık 20 derecelik tek bir varil elektrot mili bükün. Mümkün olan en küçük Bunsen beki alev kullanın. Standart laboratuar tedarik şirketlerinin tipik "küçük" Bunsen brülör bu uygulama için çok büyük alev boyutları oluşturabilirsiniz. Bu sorunu küçük ticari Bunsen beki kullanmak ve brülör üstüne bir şırınga (~ 18 gauge) güvenli ve diş çimento kullanarak bağlantı mühür aşmak için. Çalıştırılırken, alev çapı 5 mm ya da daha az, yaklaşık 8 mm uzunluğunda ve yaklaşık görmesi zor olması gerekir. Odada herhangi bir hava hareketi o alev sönecektir, bu yüzden de brülör çalıştırmak için iyi bir fikirdirkapalı bir odada, ya da rüzgar kalkanları kullanın. Yaklaşık 20 derece bükün için alev aracılığıyla tek beşik elektrodu taşıyın. Brülör alevi uzak elektrot ucu yaklaşık 10 milimetre geçiş alanı, cam eritmek için hedefleyin. Ucu aşağı doğru, biz elektrot yaklaşık 45 derecelik düzenlenecek öneririz elektrodun ucunda erime önlemek ve nispeten hızlı bir alev ile elektrot taşımak için.
    2. Multibarrel elektrot ucu kesiyorum. Elektrot ucu kırarak, en az 10x objektif ve 10x oküler ile mikroskop kullanırken görsel kontrolü sağlamak için. Oküler takılı bir ölçme skalası da meme boyutlarını ölçmek için gerekli olacaktır. Pleksiglas uç mikroskop görüş alanının bir buçuk katı kadar yaklaşık üçte-biri görülebilir bu tür mikroskop ile pleksiglas bir parça ekleyin. Bizim durumumuzda, pleksiglas parçası özel olarak güvence altına alınabilir bir vida ile 25 x 70 mm ve kalın ve ekli 5 mm dirmikroskop aşamasında iplik yapılır. Bu pleksiglas bağımsız slayt taşımak için izin veren bir tasarıma sahip olmak önemlidir. Bir cam slayt üzerine kil modelleme bir yatakta multibarrel elektrot yerleştirin ve mikroskop sahne adlı slayt tutucu içine elektrot içeren slayt eklemek. Mikroskop sahne en xy manipülatörler kullanarak yavaşça pleksiglas parçası karşı elektrot ucu taşımak ve mikroskop Okülerin aracılığıyla ucunun kırılması gözlemlemek. Temizce yaklaşık 25-35 mikrometre kümülatif çapı multibarrel ucu kırmaya çalışın. Düzensiz aralıklarla çok büyük, ya da ipuçları kesti ucu çapı pipetler atın. Biz istenmeyen ucu şekilleri nedeniyle bizim multibarrel elektrotlar yaklaşık% 30 atın.
  3. Piggy-back Elektrot Assemble

    Piggy-back elektrot birleştirin.
    1. Pozisyon elektrotlar. Mikroskop aşamasından adım 2.2 'de kullanılan pleksiglas parçasını çıkarın. Tamamlanmış Güvenlibir cam slayt üzerine kil modelleme içine multibarrel elektrot, hafifçe yukarı doğru işaret ipucu. Yukarı İşaret adım 3.2, iki elektrot yapıştırma için önemli olacaktır. Yukarı işaret İpuçları tutkal yapıştırma elektrot uçları kaçınarak, ucu kaçmak neden. Ölçüye mikromanipülatör (Şekil 2) elektrot tutucu içine bükülmüş tek beşik elektrodu takın. Birinci ve daha sonra mikroskobik kılavuz görsel kılavuz kullanarak, multibarrel elektrot üzerine tek bir namlu elektrot düşürmektedir. Tek bir elektrot yaklaşık 5-10 mikrometre ile multibarrel ucu uç çıkıntı ucu ile birlikte, 5 varil düzenleme ile oluşturulan oluk içine direkt olarak azaltılabilmektedir. Tek bir namlu alçaltılırken, yakından iki elektrot arasında oluşan açı dikkate alınmalıdır. En iyi sonuç ipucu birbirinden işaret etmektedir, ancak daha ziyade tek bir elektrot üzerine düşürmek için çalışır ki içinde, her açıdan önlemek için çok mükemmel bir şekilde paralel veya düz ucu ileÇOK hafif 'kama' düzenlemesi oluşturan, ilk multibarrel dokunmadan. Tek bir namlu ucu çok esnek olduğundan, yay içinde yapılmış bir eylem az miktarda bir temiz bir bileşik uç oluşturan uç çoklu namlu elektrot üst yüzeyi ulaştıktan sonra tek bir elektrot biraz daha indirildiği zaman bükülür Birlikte ipuçları tutarak yardımcı olur. Tek bir namlu ve multibarrel elektrot arasındaki açı (a kama çok fazla) çok dik Bununla birlikte, eğer, yay etkisi çok yüksek olması ve elektrot düzenlemesi aşağı doğru bükülür.
    2. Birlikte Tutkal elektrot milleri. Tutkal birlikte iki elektrot milleri kullanarak siyanoakrilat (yapıştırıcı). Tutkal damla ile düz bir kürdan ve dokunmatik elektrot montaj küçük yüzüne tutkal küçük bir düşüş yerleştirin. Ipuçları en distal pozisyonda başlayın ve yavaşça elektrot uçları doğru elektrot miller boyunca tutkal damla ile kürdan taşıyın. Çok fazla tutkal kullanarak, ya da yapıştırıcı t uygulayarakelektrot uçları için oo yakınında en azından kısmen işlevsiz hale elektrot, tutkallama elektrot açıklıklar neden olur.
    3. Diş çimento ile eklemini stabilize., Küçük bir tek kullanımlık plastik tabak, diş çimento ve diş akrilik az miktarda karıştırın veya düz bir kürdan kullanarak, tekne tartın. Çimento moldable hale gelene kadar bekleyin ve eklem (Şekil 3 pembe materyal) stabilize iki elektrot arasındaki eklem az miktarda uygulayın. Yaklaşık 15 dakika kurumasını bekleyin.
    4. Elektrot çıkarın ve saklayın. Dikkatlice mikromanipülatör sahibinden ilk tamamlanmış piggy-back elektrot kaldırmak ve sonra cam slayt ayırmak ve toz geçirmez bir kapta saklayın.
  4. Elektrot Dolgu Çözümleri hazırlayın

    Elektrot dolgu çözümleri hazırlayın. İyontoforez yüklü moleküllerin gerektirdiğinden, en madde bir asidik ya da bazik bir ortamda (tipik olarak bir ya da çözünmüş olması gerekirsırasıyla ta yaklaşık 3-4 arasında pH, ya da 8-10 arasında bir pH değerine). Sık sık iyontoforez olarak kullanılan kimyasal bir dizi Tablo 1 'de listelenmiştir. Tabloda yer almayan maddeler için, bu molekülü ücret tutmak için bir asidik veya alkali bir ortamda molekül kullanmak daha kolay olabilir ve buna göre çözülür edip, pKa değeri belirler. En iyi sonuçlar için, günlük tüm çözümleri taze karıştırın.
  5. Dolgu ve Elektrotları hazırlayın

    Doldurun ve elektrotlar hazırlar. Şırınga filtreleri ile şırınga bağlı 34 gauge iğne - Sadece elektrot kullanmadan önce, karbon fiber 28 kullanılarak, ilgili ilaç ile her bir varil geri doldurun. Tercih edilen ilaçlar, ve dengeleyici bir varil olarak 3M NaCl ile merkez namlu ile 5-varil konfigürasyonu 4 dış varil doldurun. Sıra 3M NaCl ile tek beşik kayıt elektrot doldurun. Böyle hızlı yeşil veya fenol kırmızısı gibi, NaCl bir boya ekleme daha kolay elektrot ucu görmek için yapacaktırbeyin yüzeye elektrot yerleştirme esnasında. Kayıt kurulum elektrot tutucu içine elektrot takın ve uygun cam varil içine tüm kabloları takın. Yalıtım yaklaşık 1 cm ucunda kaldırıldığı izole gümüş tel kullanın. Multibarrel elektrot (4 ilaç varil ve bir dengeleme namlu), artı elektrot kayıt tek bir varil içine takılması gerekir amplifikatör için tel 5 tel olmalıdır.
  6. İyontoforez Pompa Modüller açın

    İyontoforez pompa modülleri açın ve tüm varil sınayın. Her pompa modülü elektrot test fonksiyonu elektrod varil fonksiyonel olup olmadığını belirlemenize yardımcı olur. Kullanılmadığı, molekül ücret olarak zıt kutuplu bir tutma gerilimi gerektiğinde varil ilaçların sızıntısını önlemek için.

Representative Results

Bu deneyde, glisin reseptör antagonisti striknin hidroklorid iontophoretically uygulanmıştır. Tipik glycinergic inhibisyon Engelleme nöronların ateşleme artar. Şekil 4 yanıtları hayvanın kulakları teslim artan yoğunluk sinüzoidal ses uyaranlara kaydedildi işitsel bir nörondan örnek verileri gösterir. Bir deneme Bu tür nöronun boşaltma hızı vs yoğunluk fonksiyonu olarak ifade edilir. Yüksek sesle sesleri yüksek başak oranları (siyah eğri) sonuçlandı. Bu deney sırasında kullanılan başlangıç ​​iyontoforez akım 15 nA oldu. Mevcut açık ve oran yoğunluğu fonksiyonunda değişiklikler, yeni bir seviyeye (koyu mavi eğri) stabilize ettikten sonra, ejeksiyon akım giderek 30, 45 ölçüde ve 60 nA (turuncu, yeşil ve mavi ışık eğrileri, sırasıyla). Her bir durumda, ses yoğunlukları aynı aralığı boyunca nöronun yanıtları boşalmış olan değişikliklerden sonra kaydedildiyeni çıkarma akımına yanıt olarak rge-kur yoğunluk fonksiyonları stabilize vardı. Geçerli bu seviyeleri artık farklı nöronun yanıtları değiştirebilir çünkü bu örnekte kullanılacak mevcut en uygun fırlatma 45 nA 60 nA oldu. Bu sonuç, 45 mevcut nA de, bu nöronların her glisin reseptörlerine zaten striknin hidroklorür tarafından bloke edildiğini düşündürmektedir. Ejeksiyon akım ve bırakmadan daha striknin herhangi başka bir artış nöronun deşarj oranı düzey işlevi bir başka değişikliğe yol açmamıştır. Protokol tamamlanmasından sonra, püskürtme akım kapatılmış. Başlangıç ​​noktasına geri nöral yanıtların kurtarma yaklaşık 25 dk (kırmızı çizgi) sonra elde edildi. Bu işlem birkaç saniye ile birkaç on dakika arasında, püskürtülen ilaç tipi ve miktarına bağlı olarak, alabilir.

Ilaç Konsantrasyon çözelti pH'ı Çözücü Şirket Kedi. # Tipik Tutma Güncel Tipik Ejeksiyon Akımlar
GABA 500 mM 3.5-4.0 dH 2 O Sigma A-2129 -15 NA +100 NA +5 nA
Glisin 100 mM 3.5-4.0 dH 2 O Sigma G-7126 -15 NA +100 NA +5 nA
Bicuculline metiyodit 10 mM 3.0 DH 2 O 0.165 M NaCl Sigma B-6889 -15 NA +5 NA +60 nA
Striknin hidroklorür 10 mM 3.0 DH 2 O 0.165 M NaCl Sigma S-8753 -15 NA +5 NA +80 nA
L-glutamik asit 500 mM 8 dH 2 O Sigma G-1251 +30 NA -10 NA -150 nA
L-Aspartik Asit 500 mM 8 dH 2 O Sigma A-8949 +30 NA -10 NA -150 nA
Kainik Asit 1 mM 9.0 dH 2 O Sigma K-0250 +30 NA -100 NA için-10nA

Çözme ve konsantrasyon için pH Tablo 1. Yaygın olarak kullanılan ilaçlar. Tablo iyontoforez birlikte kullanılan en yaygın olarak kullanılan sinaptik agonistleri ve antagonistleri listeler. PH ortamı t kutuplaştırmaya ihtiyacı için hesaplar listelenir Hese ajanlar ve farklı uyuşturucular arasındaki etkinliği değişkenlik için önerilen konsantrasyon hesapları.

Şekil 1
Şekil 1. Farklı uç uzunlukları ile Üç multibarrel pipetler A:. Bu 5 varil elektrot ucu çok uzun ve ince çekilmiş. Ucu bükülmüş ve çok yumuşak olduğunu unutmayın. Bu tür uç istenilen çapa kırmak için çok zordur. B: Bu elektrot ucu çok kısa ve küt olduğunu. Derin beyin alanları içine ilerletilir, bu elektrot elektrot sadece birkaç milimetre ucu sonra nispeten kalın olur olmasından dolayı gereksiz yere beyin hasarına neden olur. C: Bir doğru çekti ucu ile bir elektrot bir örnek. Uzun ve ince olurken, ucu hala sağlam ve istenen uç çapına kolayca kırılmış olabilir.

Güre 2 "src =" / files/ftp_upload/4358/4358fig2.jpg "/>
Şekil 2. Elektrot manipülatör montaj çizimi. Manipülatör montaj piggy-back elektrotlar monte etmek için, mikroskop ile birlikte kullanılır. Gri renkli işaretlenmiş ürünler piyasada bulunan ürünleri ve Tablo 2'de listelenmiştir. Maviyle işaretli ürünler özel bizim kurumun makine atölyesi de işlendi. 2) isteğe bağlı açı düzeneğin devirme tertibatı, bir devirme aşama;, 3) Şekiller 1/4 inç çelik levha büyüklüğünde 43x26 Newport tarafından sağlanan delik kalıp göre bunun içine delinmiş Newport aşama 423 için delikler ile cm) 1 olduğu üst öteleme sahneye elektrod tutucu bağlar konektörü.

Şekil 3
Şekil 3,. Bir örnek piggy-back elektrot Foto. Bir tek varil kayıt el ile birlikte monte A mamul 5 namlulu elektrotectrode. Bir derin beyin kayıtları için izin verilmesi konusunda 7mm uzun şaft unutmayın.

Şekil 4,
Şekil 4. Ejeksiyon akımların Titrasyon. Grafiği hayvanın kulakları değişik yoğunlukta tonları ile stimüle ederken tek bir işitsel nörondan Kaydedilen hızı yoğunluk fonksiyonlarını gösterir. Yüksek sesle sesleri yüksek ateş oranları ortaya eğiliminde. Ilaç uygulamasından önce, nöronun oranı-şiddet fonksiyon düşük başak oranları (siyah eğri) gösterdi. Giderek daha yüksek ejeksiyon akımların giderek daha yüksek atış oranları ile sonuçlanan, nöron da giderek daha glisin reseptörleri bloke. Bu nöron mevcut optimum ejeksiyon 45-60 nA oldu. Bu çıkarma akımları ile, tüm nöronun glisin reseptörlerinde tam tıkanma elde edildi. Deneysel protokol tamamlanmasından sonra, iyontoforez sonlandırıldı ve nöron izin verildikurtarabilirsiniz. Iyileşme oranı yoğunluk fonksiyonu ilk ön-ilaç kurtarma işlevi eşleşen zaman tam iyileşme sağlandı. Klug ve ark, 1995 Amerikan Fizyoloji Derneği'nin izni ile, yayınlanmıştır.

Discussion

Aynı zamanda, deneysel manipülasyon sırasında nöronun yanıtlarının kayıt için izin Biz ise, in vivo olarak, tek bir nöronun mikrodevre manipülasyonu için izin veren bir yöntem açıklanmaktadır. Nöral devreler sinaptik agonistleri ve antagonistleri iontophoretical uygulaması ile manipüle edilmiştir. Basınç tahliye üzerinde İyontoforez temel avantajı, iyontoforez sinir dokusu içine elektrot gelen sıvı, fiziksel hareketi gerektirmez ve bu nedenle uygulanan basınç ve sıvı hacmi ile doku hasarına neden herhangi bir endişe vardır. Bu tekniğin başlıca kısıtlılığı dokusunda mutlak ilaç konsantrasyonu, ve doku etkilenen hacmi hakkında bilgi eksikliğidir. Iyontoforez ile çıkarılır farmakolojik ajanların miktarları çok daha küçük ve basınç püskürtme ile çok daha kesin olarak kontrol edilebilir Bununla beraber, ilaç uygulamasından çok daha hızlı bir iyileşme tipik olarakd daha tamamlandı. Microiontophoresis başarılı bir şekilde sinir sistemi, duyusal ve diğer bir dizi kullanılmakta olan ve çok az veya hiçbir içsel işlem ile beyin bölgelerinde en başarılı bir şekilde uygulanır. Nedeni püskürtülen farmakolojik ajan bazı komşu nörona uygulama sitesinden yaygın ve aynı zamanda komşu nöronun yanıtı özellikleri manipüle olabilir olmasıdır.

Tekli ve çoklu varil elektrotların ayrı bir imalat keyfi ve akraba olmayan özelliklere sahip elektrot kombinasyonu sağlar. Birlikte elektrot varil Çekme ve iyontoforez amaçlı kayıt ve bazıları için bazı kullanarak, çok benzer özelliklere sahip elektrot uçları ya tek hücreli kayıt veya ilaç uygulama için çok küçük için çok büyük olurdu böyle elektrot uçları üretecektir. Ayrıca, tek namlu ucu yaklaşık 20 mikrometre ile multibarrel elektrot uçları ötesine sahip büyük bir, kayıtları gürültüyü azaltırd nöronun ateşleme 3 retansiyonu veya ejeksiyon akımlarından olası karıştırıcı akımı etkilerini ortadan kaldırır.

Piggy-back multibarrel elektrotlar ilk 4-6 30 yıl önce tarif edilmiştir ve nöral devrelerin 7-18 19-29 incelemek için çok başarılı sonuçlar alınmıştır. Dolayısıyla, per se yöntemi roman ya da benzersiz değil. Ancak, elektrot hazırlanması ve kullanımının belirli ayrıntıları yılda modifiye edilmiştir, ve burada açıklanan talimatları kümesi özellikle kolay ve başarılı olduğu kanıtlanmıştır ve başka literatürde ayrıntılı olarak yayınlanmamıştır. Özellikle, tek bir namlu elektrot ucu bükme, domuz geri elektrot son ucu böylece nispeten ince (Şekil 3) ve olmasına olanak tanır beyin için en az hasar ile derin atom çekirdeklerinden gelen kayıtlar için izin verir; tek bir namlu bölgesinin çıkıntılı çok namlu elektrot elektrot üzerinde hemen hemen tüm Curren kaldırırgenellikle teknik 3 bir dezavantaj olarak sayıldı t etkiler. Yeni detayları gibi piggy-back elektrotlar üretirken tutkallama işlemi sırasında yukarıyı gösterecek ve multibarrel elektrot oluğuna tek beşik dinlenme elektrot ucu yüksek bir başarı oranı sağlayacak sahip olarak burada sunulan. Tekniği nispeten kolaydır ve genellikle birkaç gün içinde bir acemi tarafından hakim olabilir.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Iş R01 DC 011582 (AK) ve RO1 DC011555 (DJT) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bunsen burner 17928-027 Available from: VWR
Two-component dental cement: "Cold cure" dental material Co-oral-ite Dental Mfg. Co 525000 Available from: A-M Systems, Inc
Two-component dental cement: Denture material crosslinking Liquid Compound Co-oral-ite Dental Mfg. Co 525000 Available from: A-M Systems, Inc
Liquid glue Henkel 01-06849 Available from: Loctite Super Glue
Micro-Iontophoresis Unit: Neurophore BH-2 Harvard Apparatus 65-0200 & 65-0203 Available from: Harvard Apparatus
Insulated silver wire AM-Systems 785500 Available from: AM-Systems
Horizontal puller Zeitz DMZ-Universal Puller NA Available from: AutoMate Scientific
Micro-manipulator pieces: electrode holder WPI M3301EH Available from: WPI
Micro-manipulator pieces: linear stage Newport 423 Series 423 Available from: Newport
Micro-manipulator pieces: rotation stage Newport RSP-2 RSP-2 Available from: Newport
Micro-manipulator pieces: z translation Newport 433 Series 433 Available from: Newport
Micro-manipulator pieces: angle bracket 90 ° to assemble z and xy axis Newport 360-90 360-90 Available from: Newport
Micro-manipulator pieces: x translation / linear stage Newport 423 Series 423 Available from: Newport
Micro-manipulator pieces: y translation / linear stage Newport 423 423 Available from: Series Newport
Microscope Leitz Laborlux 11
Microscope: objective Leitz Wetzlar 10x, NA 0.25 519760
Microscope: eypieces Leitz Wetzlar, Periplan 10x/18 519748
Microscope: stage Leitz Wetzlar 513544
Multibarrel capillary N/A 612000 Available from: A-M systems, Inc
Sinlge barrel capillary (GC 150F-10) Harvard Apparatus 30-0057 Available from: Harvard Apparatus
Vertical puller Narishige model PE-2
Custom made elements of the Micro-manipulator (marked light blue in Figure 1)
steel plate
tilting base
attachment for electrode holder

Table 2. Manufacturers and item numbers of all equipment and supplies used in the procedure.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Curtis, D. R. A method for assembly of "parallel" micro-pipettes. Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 24, 587-589 (1968).
  2. Carette, B. A new method of manufacturing multi-barrelled micropipettes with projecting recording barrel. Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 44, 248-250 (1978).
  3. Crossman, A. R., Walker, R. J., Woodruff, G. N. Problems associated with iontophoretic studies in the caudate nucleus and substantia nigra. Neuropharmacology. 13, 547-552 (1974).
  4. Havey, D. C., Caspary, D. M. A simple technique for constructing "piggy-back" multibarrel microelectrodes. Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 48, 249-251 (1980).
  5. Verberne, A. J., Owens, N. C., Jackman, G. P. A simple and reliable method for construction of parallel multibarrel microelectrodes. Brain Res. Bull. 36, 107-108 (1995).
  6. Oliver, A. P. Technical contribution. A simple rapid method for preparing parallel micropipette electrodes. Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 31, 284-286 (1971).
  7. Oswald, J. P., Klug, A., Park, T. J. Interaural intensity difference processing in auditory midbrain neurons: effects of a transient early inhibitory input. J. Neurosci. 19, 1149-1163 (1999).
  8. Park, T. J., Pollak, G. D. GABA shapes a topographic organization of response latency in the mustache bat's inferior colliculus. J. Neurosci. 13, 5172-5187 (1993).
  9. Park, T. J., Pollak, G. D. GABA shapes sensitivity to interaural intensity disparities in the mustache bat's inferior colliculus: implications for encoding sound location. J. Neurosci. 13, 2050-2067 (1993).
  10. Peterson, D. C., Nataraj, K., Wenstrup, J. Glycinergic inhibition creates a form of auditory spectral integration in nuclei of the lateral lemniscus. J. Neurophysiol. 102, 1004-1016 (2009).
  11. Ramsey, L. C. B., Sinha, S. R., Hurley, L. M. 5-HT1A and 5-HT1B receptors differentially modulate rate and timing of auditory responses in the mouse inferior colliculus. Eur. J. Neurosci. 32, 368-379 (2010).
  12. Wenstrup, J. J., Leroy, S. Spectral Integration in the Inferior Colliculus: Role of Glycinergic Inhibition in Response Facilitation. J. Neurosci. 21, RC124 (2001).
  13. Yang, L., Pollak, G. D. Features of ipsilaterally evoked inhibition in the dorsal nucleus of the lateral lemniscus. Hear. Res. 122, 125-141 (1998).
  14. Yang, L., Pollak, G. D. GABA and glycine have different effects on monaural response properties in the dorsal nucleus of the lateral lemniscus of the mustache bat. J. Neurophysiol. 71, 2014-2024 (1994).
  15. Yang, L., Pollak, G. D. The roles of GABAergic and glycinergic inhibition on binaural processing in the dorsal nucleus of the lateral lemniscus of the mustache bat. J. Neurophysiol. 71, 1999-2013 (1994).
  16. Yang, L., Pollak, G. D., Resler, C. GABAergic circuits sharpen tuning curves and modify response properties in the mustache bat inferior colliculus. J. Neurophysiol. 68, 1760-1774 (1992).
  17. Faingold, C. L., Gehlbach, G., Caspary, D. M. On the role of GABA as an inhibitory neurotransmitter in inferior colliculus neurons: iontophoretic studies. Brain Res. 500, 302-312 (1989).
  18. Faingold, C. L., Hoffmann, W. E., Caspary, D. M. Effects of excitant amino acids on acoustic responses of inferior colliculus neurons. Hear. Res. 40, 127-136 (1989).
  19. Hurley, L., Pollak, G. D. Serotonin shifts first-spike latencies of inferior colliculus neurons. J. Neurosci. 25, 7876-7886 (2005).
  20. Hurley, L., Pollak, G. D. Serotonin effects on frequency tuning of inferior colliculus neurons. J. Neurophysiol. 85, 828-842 (2001).
  21. Hurley, L. M., Pollak, G. D. Serotonin differentially modulates responses to tones and frequency-modulated sweeps in the inferior colliculus. J. Neurosci. 19, 8071-8082 (1999).
  22. Klug, A., Bauer, E. E., Pollak, G. D. Multiple components of ipsilaterally evoked inhibition in the inferior colliculus. J. Neurophysiol. 82, 593-610 (1999).
  23. Klug, A., Park, T. J., Pollak, G. D. Glycine and GABA influence binaural processing in the inferior colliculus of the mustache bat. J. Neurophysiol. 74, 1701-1713 (1995).
  24. Moore, M. J., Caspary, D. M. Strychnine blocks binaural inhibition in lateral superior olivary neurons. J. Neurosci. 3, 237-242 (1983).
  25. Nataraj, K., Wenstrup, J. J. Roles of inhibition in creating complex auditory responses in the inferior colliculus: facilitated combination-sensitive neurons. J. Neurophysiol. 93, 3294-3312 (2005).
  26. Fukui, I., Burger, R. M., Ohmori, H., Rubel, E. W. GABAergic inhibition sharpens the frequency tuning and enhances phase locking in chicken nucleus magnocellularis neurons. J. Neurosci. 30, 12075-12083 (2010).
  27. Burger, R., Pollak, G. D. Reversible inactivation of the dorsal nucleus of the lateral lemniscus reveals its role in the processing of multiple sound sources in the inferior colliculus of bats. J. Neurosci. 21, 4830-4843 (2001).
  28. Burger, R. M., Pollak, G. D. Analysis of the role of inhibition in shaping responses to sinusoidally amplitude-modulated signals in the inferior colliculus. J. Neurophysiol. 80, 1686-1701 (1998).
  29. Coleman, W. L., Fischl, M. J., Weimann, S. R., Burger, R. M. GABAergic and glycinergic inhibition modulate monaural auditory response properties in the avian superior olivary nucleus. J. Neurophysiol. 105, 2405-2420 (2011).
Için Multibarrel Elektrodları Üretim ve Piggy-back kullanma<em&gt; In vivo</emSinir Cevaplarının&gt; Farmakolojik Çarpıtmalar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dondzillo, A., Thornton, J. L., Tollin, D. J., Klug, A. Manufacturing and Using Piggy-back Multibarrel Electrodes for In vivo Pharmacological Manipulations of Neural Responses. J. Vis. Exp. (71), e4358, doi:10.3791/4358 (2013).More

Dondzillo, A., Thornton, J. L., Tollin, D. J., Klug, A. Manufacturing and Using Piggy-back Multibarrel Electrodes for In vivo Pharmacological Manipulations of Neural Responses. J. Vis. Exp. (71), e4358, doi:10.3791/4358 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter