Summary
我们引入了一种新的方法，为维护人类文化和监测至少24小时应对各类刺激肠黏膜。有了我们的方法中，维持组织的极性，可用于生理刺激通过心尖路由。
Abstract
目前很少有车型存在，逼真地模拟复杂的人类肠道内的微环境，在那里发生的各种相互作用。适当的稳态直接取决于这些相互作用的，因为它们形成整个的免疫反应对食物抗原诱导免疫耐受，而在同一时间对意外地与食物摄入的病原微生物的有效的免疫反应。
肠道动态平衡也被保留通过各种微生物（包括食品相关的有益的细菌菌株）和主机，调节附件/降解粘液之间复杂的相互作用，生产抗菌肽上皮屏障，而“教育”上皮细胞表型独特，肠道居民淋巴细胞人口控制的耐受性或免疫原性。这些相互作用到目前为止已经很难复制的体外实验可以使用培养的细胞系或外周血单核细胞。此外，小鼠模型显着不同的元件相对于人体肠道对肠粘膜（粘液层的组织，共生细菌群落）。因此在诊所被带到重要的压力相关的或病理情况下，如肠易激综合征，炎性肠病或结直肠癌的治疗方法有多种，研究一直难以开展。
为了解决这些问题，我们开发了一种新的系统，使我们能够刺激人体肠道黏膜植保留其在原位空调主机菌群和免疫反应，极化方式。偏振光根尖刺激引起的免疫反应的结果，非常重要的。已经一再证明，相同的刺激，可以产生完全不同的反应，当他们绕过心尖面对肠道外延thelium basolaterally或刺激上皮细胞进入固有层组件的直接接触，切换从耐受性表型的免疫原性，并在区域造成不必要的过度的炎症反应。
通过胶粘的分隔的区域的顶端面的粘膜刺激对将要描述在协议中的一个洞穴缸实现极化刺激。我们用这个模型来考察，其中包括三个不同的乳酸杆菌菌株的不同影响。我们发现，这个模型系统评估益生菌的免疫调节特性，在健康和疾病的情况下是非常强大的。
Protocol
1。获取和组织准备
- 组织（健康或粘膜IBD）是在手术过程中获得。一旦切除试样转移到实验室尽快，保持它的Ca + + / Mg的+ +的HBSS缓冲液在4℃或冰面上青/链霉素补充。
*试样的大小取决于可用的组织得到的组织的一部分，它是严格诊断是没有必要的，并且可以相差很大健康IBD主体之间。健康的组织切除患者结肠癌手术。
- 轻轻洗净的组织，它的所有肠系膜材料和清洁。分离粘膜层，粘膜下层，同时保持组织中的HBSS缓冲液在陪替氏培养皿（不一定浸入），用无菌剪刀和镊子。触摸粘膜表面尽可能少的钳子。
- 切粘膜条纹至少1 C米，宽尽可能长。使用两个无菌手术刀，好像你切割食物。
- 洗干净黏膜轻轻的在HBSS，并扩展它在培养皿上心尖的一面朝上。
2。安装组织
- 准备新鲜培养基（tisDMEM）。使用DMEM培养基，谷氨酰胺（2mM），将NaPyr（1毫摩尔），并添加15％FBS的Na（上胎牛血清 - 北美），1％ITS-X和200 ng / ml的EGF在利用时间。
- FBS娜（约30毫升，使金属电网将完全被海水淹没）和淹没的金属网格与其他填充10厘米的培养皿。保持板打开，并支持其自来水的塑料缸。
*金属网格是铁做的。网丝与0.5毫米的侧面是正方形状。
- 3微升10或20微升吸管手术胶水。仔细应用于塑料筒的边界之一，而它fIRM的镊子。
- 轻轻地放置在气缸上的根尖侧的黏膜，尽可能靠近尽可能的带材的边界之一。
- ，得到胶化时间，牢固地附着在纸巾上的气缸，制备的中心孔的器官培养板：取850微升，1毫升培养基中的中心和边缘的板的中央以及支持金属网格。
- 切去多余的组织从缸使用两个无菌手术刀像以前的边界。
- 轻轻提起缸连接的组织，并在板中心放置基底侧上的金属网格。
3。促进
- 使用您所选择的刺激，在你喜欢的浓度。
- 应用适当的卷在塑料圆筒的中心，而不会干扰用移液管尖的缸或粘膜表面。确保您所选择的量均匀地覆盖在气缸内表面。在dicated卷：
大型塑料圆筒：200微升
中型塑料圆筒：100微升
小型塑料圆筒：50微升 - 孵育3小时，在传统的孵化器。
*如果你想培养更长的时间点，确保您使用体积更小的刺激（10-20微升），并直接将组织100％O 2的气氛中在1个大气压的压力（见3.5） 。
- 关闭根尖组织表面与介质的刺激，不要更换新鲜培养基，因为组织没有得到足够的O 2，如果介质对根尖面对厚厚的一层防止气体交换。 覆盖板。
- 将组织在100％O 2的气氛中，在1个大气压的压力。
4。收获
- 总培养时间（±2.5小时）24小时后，小心地取出气缸日ê组织的帮助下，用手术刀轻轻刮胶和存储取决于所需的分析（修复免疫组化和/或免疫荧光法，或急速冷冻在液氮RNA纯化和基因表达谱或蛋白质纯化和Western blot检测）。
- 收获基底介质，细胞因子分泌剖析。在8,000 rpm下离心7分钟，以沉淀碎片，将上清转移在Eppendorf管（或等分试样），并立即存储于-20℃。
*如果你想以保持更长上清，它们储存在-80°C。
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Representative Results
我们成功地保持健康和传染性法氏囊病的人类文化肠粘膜至少24小时保护组织的福祉。根据先前的观察1，这是唯一可能的，如果培养时间（至少85％的总）的大多数发生在O 2，组织没有生存24小时，在传统的孵化器（ 图2）。我们也显示出，取决于上的的刺激（心尖比基底侧）和刺激的免疫原性2,3的极性在此模型上可观察到的外植体的不同的反应。
使用此协议，我们证明了不同的益生菌菌株可以引起不同的反应。 植物乳杆菌NCIMB8826的组织的一部分被证明是令人惊讶的免疫原性健康组织。其他两个乳酸杆菌菌株相反，不仅没有引起淋巴样细胞迁移到病房的最上部的粘膜表面，但同时也显着上调趋化因子相关的转移过程中，四氯化碳，以及IL-1β，传统的细胞因子有关的促炎症活性。我们惊讶的是，尽管我们此前观察到预防行动L.副干酪 4结肠炎的小鼠模型，并没有转化为具疗效应用于IBD组织发炎时，这株活细菌。相反，所有3个菌株被证明是不利的，在急性期的疾病2 IBD粘膜上使用时，。
此外，我们发现，益生菌的代谢产物，称为postbiotic，能够屏蔽良性上皮对相当的侵入性沙门氏菌菌株（FB62），而在同一时间显着IBD黏膜2上的应用时，可改善炎症。
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图1的设置和照片的示意图。设置从侧面观察的示意性表示。设置从顶部角观察的示意性表示。金属网格的照片作为支持外植体。正确放置时，只有基底侧接触得到中央媒体室，D。整个乐团的照片。 点击这里查看大图 。
图2。组织仅生存文化中的O 2。。蒙昧组织的，固定在抵达时从手术室，
图3。植亲炎症刺激的影响。C型：未刺激组织培养指定的时间点; 萨尔： 沙门氏菌和组织的挑战，培养指定的时间点。已经是可见的破坏上皮细胞的上层2小时。植广泛变性后24小时。原来的放大倍数：10X。
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Discussion
需要有关生理模型人体肠道黏膜上的治疗方法，可以有效地测试一直很重视。许多研究人员已经发现在两种细胞和小鼠模型6迄今所使用为该目的而潜在的工件和缺陷。事实上，即使有前途的临床前数据往往是获得，这些很少转化为显着的临床益处。
在这项工作中所描述的方法，提出了一个相对简单的，但有效的，新颖的适应人体肠道粘膜偏振方式的外植体的培养和刺激的现有的协议，7，8。
这个模型可以提供一个很好的互补诊所之前，任何形式的一个潜在的治疗方法有效的临床前数据的生成。因此，不幸的临床结果9可能避免和研究人员可以更安全促进治疗诊所急性发炎情况的处理。
该模型的主要优点是比较极性与非极化刺激的可能性超过24小时的时间内，并按照组织的响应。一个非常重要的参数是，在每一个实验中，不同的处理方法适用于来自同一病人的，它允许以考虑患者间的变异的外植体上。外植体的相对大的尺寸相比，活组织切片检查的事实，也意味着相同的外植体可以进行各种分析，证实了在许多不同的方式（ELISA测定，定量rtPCRs的，微阵列分析，免疫组织化学和/或免疫荧光的结果数据）。另外，其他类型的分析可以在将来进行了优化，如纯化的细胞群还刺激外植体，并评价其表型由cytofluorimetric分析的sis文件。
然而，也有要考虑的重要的限制。在其目前的形式，这种模式是不适合高通量筛选大量的治疗，因为它依赖于组织的可用性。细胞培养模型可能更适合用于这一目的，因为他们更容易处理和执行了大量的刺激而我们描述的模型更有效地进入诊所前结束测试的候选治疗作为10。此外，需要长期监测期间，如RNA干扰实验的时间框架不允许在此期间，我们已经成功地保护组织的生存能力。最后，细菌的刺激是在正规的培养箱中进行，不允许进行维护或测试的厌氧细菌的效果。这是我们打算在未来的工作，在这些问题上。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢埃里卡Mileti，优异的技术支持和安东尼奥·SABATINO博士提供氧舱。
资金来源 ：本工作得到补助从欧盟第七框架计划（IBDase ERC：Dendroworld），和基金会Cariplo的MR和支持居里夫人国际培训移动网络（相声，赠款协议编号：21553-2） KT。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 10X HBSS | Eurocalne | ECM4006XL | |
| Peni/Strepto | Lonza | DE17602E | |
| Gentamycin | Gibco | 15750-037 | |
| DMEM | Lonza | BE12614 | |
| FBS-Na | Gibco | 16000-044 | |
| 100X ITS-X | Gibco | 51500-056 | |
| EGF | Tebu-bio | 100-15 | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17605E | |
| Non essential aminoacids 100X | Gibco | 11140-035 | |
| NaPyr | Gibco | 11360-039 | |
| Materials | |||
| Cloning cylinders 6x8 mm | BellCo | 2090-00608 | |
| Cloning cylinders 8x8 mm | BellCo | 2090-0080 | |
| Cloning cylinders 10x10 mm | BellCo | 2090-01010 | |
| Metal grids | Home made | ||
| Centre well organ culture plate | BD Falcon | 353037 | |
| Surgical glue (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Oxygen Jars | Home made | ||
| Oxygen tanks | Air Liquid Sanità | ||
References
- Schuller, S., Lucas, M., Kaper, J. B., Giron, J. A., Phillips, A. D. The ex vivo response of human intestinal mucosa to enteropathogenic Escherichia coli infection. Cell. Microbiol. 11, 521-530 (2009).
- Tsilingiri, K., et al. Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model. Gut. , (2012).
- Tsilingiri, K., Rescigno, M. Should probiotics be tested on ex vivo organ culture models? Gut Microbes. , Manuscript in preparation (2012).
- Mileti, E., Matteoli, G., Iliev, I. D., Rescigno, M. Comparison of the immunomodulatory properties of three probiotic strains of Lactobacilli using complex culture systems: prediction for in vivo efficacy. PLoS One. 4, e7056 (2009).
- Cencic, A., Langerholc, T. Functional cell models of the gut and their applications in food microbiology--a review. Int. J. Food Microbiol. 141, Suppl 1. S4-S14 (2010).
- te Velde, A. A., Verstege, M. A., Hommes, D. W. Critical appraisal of the current practice in murine TNBS-induced colitis. Inflamm. Bowel Dis. 12, 995-999 (2006).
- Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture. J. Anat. 134, 459-469 (1982).
- Browning, T. H., Trier, J. S. Organ culture of mucosal biopsies of human small intestine. J. Clin. Invest. 48, 1423-1432 (1969).
- Besselink, M. G., et al. Probiotic prophylaxis in predicted severe acute pancreatitis: a randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 371, 651-659 (2008).
- Lakhdari, O., et al. Identification of NF-kappaB modulation capabilities within human intestinal commensal bacteria. J. Biomed. Biotechnol. 2011, 282356 (2011).
