Summary
Vi introducerer en hidtil ukendt fremgangsmåde til opretholdelse af menneskers tarmslimhinden i kultur og overvågning af reaktion på forskellige typer af stimuli over mindst 24 timer. Med vores metode er polariteten af vævet bibeholdes, giver mulighed for en fysiologisk stimulering via apikale rute.
Abstract
Enkelte modeller i øjeblikket eksisterer for at realistisk simulere den komplekse menneskelige tarmens mikro-miljø, hvor en bred vifte af interaktioner finder sted. Korrekt homeostase direkte afhængig af disse interaktioner, da de forme en hel immunologisk respons inducing tolerance overfor fødevarer antigener, mens på samme tid iværksætte effektive immunreaktioner mod patogene mikrober uheld indtager med fødevarer.
Intestinal homeostase bevares også gennem forskellige komplekse interaktioner mellem mikrobiota (herunder mad-associerede gavnlige bakteriestammer) og værten, der regulerer den vedhæftede fil / nedbrydning af slim, produktion af antimikrobielle peptider ved epitelbarrieren, og "undervisning" af epitelceller ', der styrer tolerogent eller immunogene fænotype af unikke, gut-hjemmehørende lymfoide celler befolkninger. Disse interaktioner har været så langt meget vanskelige at reproducere med in vitro assaysanvendelse af enten dyrkede cellelinier eller perifere mononukleære blodceller. Endvidere afviger musemodeller væsentligt i komponenterne i tarmslimhinden (slimlag organisation, kommensale bakterier samfund) med hensyn til den menneskelige tarm. Således har undersøgelser af en række behandlinger, der skal bringes i klinikkerne for vigtige stress-relaterede eller patologiske tilstande såsom irritabel tyktarm, inflammatorisk tarmsygdom eller kolorektal cancer været vanskeligt at udføre.
For at løse disse problemer, har vi udviklet et nyt system, der gør det muligt for os at stimulere eksplantater af human tarmslimhinden, der bevarer deres in situ konditionering af værten mikrobiota og immunrespons i et polariseret måde. Polariseret apikale stimulering er af stor betydning for resultatet af den fremkaldte immunrespons. Det har gentagne gange vist, at de samme stimuli kan producere helt forskellige reaktioner, når de omgå den apikale overflade af tarmen epithelium, stimulere epitelceller basolateralt eller kommer i direkte kontakt med lamina propria komponenter skifte fænotype fra tolerogent til immunogene og forårsager unødvendig og overdreven betændelse i området.
Vi opnåede polariseret stimulation ved limning en hule cylinder, som afgrænser området stimulering på den apikale overflade af slimhinden som det vil blive beskrevet i protokollen. Vi brugte denne model til at undersøge, blandt andre, differential effekter af tre forskellige Lactobacilli stammer. Vi viser, at denne model system er meget stærke til at vurdere immunmodulerende egenskaber af probiotika i sunde og sygdomstilstande.
Protocol
1.. Indhentning og Forberedelse af Tissue
- Væv (sundt eller IBD slimhinde) opnås under operationen. Når prøven udskæres overførsel til laboratoriet snarest muligt at holde det i Ca + + / Mg + +-fri HBSS buffer suppleret med Pen / Strep ved 4 ° C eller på is.
* Størrelsen af prøven afhænger af tilgængeligheden af vævet: den del af den opnåede væv, er strengt hvad der ikke er nødvendigt for diagnose og kan variere meget mellem sunde og IBD forsøgspersoner. Raske væv udskæres fra patienter, der gennemgår kirurgi for tyktarmskræft.
- Vask vævet blidt og rense det af alt mesenterisk materiale. Adskil slimhinden lag fra submucosa med steril saks og pincet og samtidig holde vævet i HBSS buffer i en petriskål (ikke nødvendigvis immerged). Tryk slimhindeoverfladen med pincet så lidt som muligt.
- Skær slimhinden i striber mindst 1 cm bred og så længe som muligt. Brug to sterile skalpeller, meget som om du var at skære din mad.
- Vask rent slimhinde blidt i HBSS og udvide det på en petriskål med den apikale side opad.
2.. Montering af Tissue
- Forbered frisk medium (tisDMEM). Brug DMEM suppleret med glutamin (2 mM) og NaPyr (1 mM), og der tilsættes 15% FBS-Na (føtalt bovint serum - nordamerikansk), 1% ITS-X og 200 ng / ml EGF på tidspunktet for anvendelsen.
- Fyld en 10 cm petriskål med resten af FBS-Na (bruger omkring 30 ml, så metalgitre vil være fuldstændig neddykket) og nedsænkes metalgitre. Hold pladen åbne og støtte de plastcylindre på vandhanen.
* De metalgitre er lavet af jern. Redskabets er kvadratisk med en side på 0,5 mm.
- Tag 3 pi kirurgisk lim med en 10 eller 20 pi pipette. Anvend det forsigtigt til den ene af de grænser en plastik cylinder, mens du holder den fIRM med pincet.
- Anbring forsigtigt cylinderen på den apikale side af slimhinden, som tæt på en af grænserne af strimlen som muligt.
- At give lim tid til fast fastgøre cylinderen på vævet, forberede centrum-godt orgelkultur plade: Dispensér 850 pi-1 ml medium i midten godt og støtte metalgitter på kanterne af pladen centrale godt.
- Klip overskydende væv fra grænserne for cylinderen ved hjælp af to sterile skalpeller som før.
- Løft forsigtigt cylinderen med den vedhæftede væv og placere den basolaterale side på metalgitteret i midten af pladen.
3.. Stimulation
- Brug de stimuli af dit valg i din foretrukne koncentration.
- Anvende passende volumen i midten af cylinder af plast uden at forstyrre cylinder eller slimhindeoverfladen med pipettespidsen. Sørg for at dit valgte rumfang ensartet dækker overfladen inde i cylinderen. Idicated bind:
Store plastik cylinder: 200 ul
Medium plastic cylinder: 100 pi
Lille cylinder af plast: 50 pi - Inkuberes i op til 3 timer i en konventionel inkubator.
* Hvis du ønsker at inkubere i længere tidspunkter, sørg for at bruge en meget mindre mængde af stimuli (10-20 ul), og direkte placere vævet i en atmosfære af 100% O 2 i tryk på 1 Atm (se 3.5) .
- Tag mediet med stimuli off den apikale overflade af vævet og må ikke træde med frisk medium, fordi vævet ikke få nok O 2 hvis et tykt lag af medium på den apikale ansigt forhindrer gasudveksling. Dæk pladen.
- Placer vævet i en atmosfære af 100% O 2 i tryk på 1 atm.
4.. Høst
- Efter 24 timer af den samlede kultur tid (± 2,5 timer) forsigtigt fjerne cylinderen fra the væv ved hjælp af en skalpel forsigtigt at skrabe limen ud og gemme det afhængigt af den ønskede analyse (fix for immunhistokemisk og / eller immunofluorescens assays, eller snap fryse i flydende N2 til RNA rensning og genekspression profilering eller proteinoprensning og Western blot assays ).
- Harvest basolaterale medium for cytokinudskillelse profilering. Centrifugeres ved 8.000 rpm i 7 minutter for at pelletere snavs, overføre supernatanten i et Eppendorf-rør (alternativt portion) og straks opbevares ved -20 ° C.
* Hvis du ønsker at holde supernatanter i længere tid, opbevare dem ved -80 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det lykkedes os at opretholde en sund og IBD menneske tarmslimhinden i kultur for mindst 24 timer bevare trivsel af vævet. I overensstemmelse med tidligere observationer 1, var dette kun muligt, hvis størstedelen af kulturen tid (mindst 85% af totalen) fandt sted i O 2, da vævet ikke overlevede i 24 timer i konventionelle inkubatorer (figur 2). Vi har også vist, at forskellige reaktioner af eksplantaterne kan iagttages på denne model efter polariteten af stimuleringen (apikale vs basolateral) og immunogenicitet af de stimuli 2,3.
Brug af denne protokol, viser vi, at forskellige probiotiske stammer kan fremkalde forskellige reaktioner på vævets del. Lactobacillus plantarum NCIMB8826 viste sig at være overraskende immunogen på sundt væv. I modsætning til de to andre Lactobacilli stammer, ikke kun gjorde det inducerer migration af lymfoide celler til afdelinger den øverste overflade af slimhinden, men det også væsentligt opreguleres en kemokin relevant for denne migration, CCl4, samt IL-1b, en cytokin traditionelt relateret til pro-inflammatorisk aktivitet. Til vores overraskelse, vi selv tidligere havde observeret en forebyggende indsats på L. paracasei i en musemodel af colitis 4, har dette ikke oversætte til en helbredende virkning, når levende bakterier af denne stamme blev anvendt på betændt IBD væv. Snarere, alle tre stammer viste skadelig når de anvendes på IBD slimhinde i den akutte fase af sygdommen 2..
Endvidere viste vi at det metaboliske produkt af en probiotisk, kaldet postbiotic, er i stand til afskærmning sunde epitel mod en temmelig invasiv Salmonella-stamme (FB62), mens den på samme tid betydeligt mildner inflammation når de anvendes på IBD slimhinde 2..
_upload/4368/4368fig1.jpg "fo: content-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/4368/4368fig1hires.jpg "/>
Fig. 1. Skematisk repræsentation af opsætning og fotos. En. Skematisk repræsentation af sættet op set fra siden, b.. Skematisk repræsentation af sættet op set fra oven, ca. Billede af metalgitteret anvendes som støtte til eksplantatet. Ved korrekt placeret, kun den basolaterale side kommer i kontakt med den centrale medium kammer, d.. Foto af hele ensemblet. Klik her for at se større figur .
Figur 2.. Vævet kun overlever kultur O 2. A. Ukultiverede væv fast på ankomst fra operationsstuen,
Figur 3. Virkningen af en pro-inflammatorisk stimulus på eksplantaterne C-: stimulerede væv dyrket i de angivne tidspunkter, Sal:.. Væv udfordret med Salmonella og dyrket i de angivne tidspunkter. Ødelæggelsen af det øverste lag af epitel er allerede synlige på 2 timer. Eksplantatet præsenterer omfattende degeneration efter 24 timer. Oprindelig forstørrelse: 10X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Behovet for fysiologisk relevante modeller, som behandlinger for human tarmslimhinden gyldigt kan testes har længe været fremhævet. Mange forskere har identificeret mulige artefakter og defekter i både celle 5 og musemodeller 6 hidtil anvendte til dette formål. Selv om lovende prækliniske data opnås ofte, er disse sjældent oversætte til væsentlig klinisk fordel.
Fremgangsmåden beskrevet i dette arbejde, præsenterer en forholdsvis enkel, men effektiv og hidtil ukendt tilpasning til eksisterende protokoller 7, 8 for kultur-og stimulering af humane tarmslimhinde eksplantater i en polariseret måde.
Denne model kunne være en god supplerende tilgang til generering af gyldige prækliniske data, før du tager en potentiel behandling af nogen art til klinikkerne. Således kunne uheldige kliniske resultater 9 potentielt undgås, og forskerne kunne meresikkert fremme behandlinger til klinikker for håndtering af akutte inflammatoriske tilstande.
De store fordele ved modellen, er muligheden for at sammenligne polariseret versus ikke polariseret stimulering og følge vævets respons over en 24-timers tidsramme. En meget vigtig parameter er, at i hvert forsøg, er de forskellige behandlinger anvendes på eksplantaterne fra samme patient, som tillader under hensyntagen variabilitet mellem patienter. Den omstændighed, at eksplantaterne er af en forholdsvis stor størrelse i forhold til biopsier betyder også, at en række analyser kan udføres på samme eksplantatet, bekræfter resultater i mange forskellige måder (ELISA-assays, kvantitative rtPCRs, microarray analyser, immunhistokemi og / eller immunofluorescens data). Endvidere kunne andre typer af analyser optimeres i fremtiden, såsom rensning af cellepopulationer af interesse fra stimulerede eksplantater og evaluering af deres fænotype ved cytofluorimetric anasis.
Men der er også vigtige begrænsninger, der skal tages hensyn til. På sin nuværende form denne model er ikke egnet til high throughput screening af et stort antal behandlinger, da det er baseret på tilgængeligheden af vævet. Cellekulturmodeller er sandsynligvis mere egnet til dette formål, da de er lettere at håndtere og udføre et stort antal stimulationer den 10. hvorimod modellen beskriver vi ville være mere effektivt anvendes som end test af kandidat behandlinger før indtastning klinikkerne. Hertil kommer, at den tid, i hvilken det er lykkedes at bevare levedygtigheden af vævet ikke mulighed for eksperimenter, der kræver lange overvågning perioder, f.eks RNA-interferens. Endelig er den bakterielle stimulering udføres i en regelmæssig inkubator og giver ikke mulighed for at bevare eller afprøve virkningen af anaerobe bakterier. Det er vores hensigt at arbejde med disse spørgsmål i fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi takker Erika Mileti for fremragende teknisk support og Dr. Antonio Di Sabatino for at levere ilt kamre.
Finansiering: Dette arbejde blev støttet af tilskud fra det 7. EU-rammeprogram (IBDase, ERC: Dendroworld) og Fondazione Cariplo til MR og støtte af et Marie Curie international uddannelse mobilitet netværk (Cross-Talk, tilskudsaftale nr.: 21.553 til 2) til KT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 10X HBSS | Eurocalne | ECM4006XL | |
| Peni/Strepto | Lonza | DE17602E | |
| Gentamycin | Gibco | 15750-037 | |
| DMEM | Lonza | BE12614 | |
| FBS-Na | Gibco | 16000-044 | |
| 100X ITS-X | Gibco | 51500-056 | |
| EGF | Tebu-bio | 100-15 | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17605E | |
| Non essential aminoacids 100X | Gibco | 11140-035 | |
| NaPyr | Gibco | 11360-039 | |
| Materials | |||
| Cloning cylinders 6x8 mm | BellCo | 2090-00608 | |
| Cloning cylinders 8x8 mm | BellCo | 2090-0080 | |
| Cloning cylinders 10x10 mm | BellCo | 2090-01010 | |
| Metal grids | Home made | ||
| Centre well organ culture plate | BD Falcon | 353037 | |
| Surgical glue (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Oxygen Jars | Home made | ||
| Oxygen tanks | Air Liquid Sanità | ||
References
- Schuller, S., Lucas, M., Kaper, J. B., Giron, J. A., Phillips, A. D. The ex vivo response of human intestinal mucosa to enteropathogenic Escherichia coli infection. Cell. Microbiol. 11, 521-530 (2009).
- Tsilingiri, K., et al. Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model. Gut. , (2012).
- Tsilingiri, K., Rescigno, M. Should probiotics be tested on ex vivo organ culture models? Gut Microbes. , Manuscript in preparation (2012).
- Mileti, E., Matteoli, G., Iliev, I. D., Rescigno, M. Comparison of the immunomodulatory properties of three probiotic strains of Lactobacilli using complex culture systems: prediction for in vivo efficacy. PLoS One. 4, e7056 (2009).
- Cencic, A., Langerholc, T. Functional cell models of the gut and their applications in food microbiology--a review. Int. J. Food Microbiol. 141, Suppl 1. S4-S14 (2010).
- te Velde, A. A., Verstege, M. A., Hommes, D. W. Critical appraisal of the current practice in murine TNBS-induced colitis. Inflamm. Bowel Dis. 12, 995-999 (2006).
- Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture. J. Anat. 134, 459-469 (1982).
- Browning, T. H., Trier, J. S. Organ culture of mucosal biopsies of human small intestine. J. Clin. Invest. 48, 1423-1432 (1969).
- Besselink, M. G., et al. Probiotic prophylaxis in predicted severe acute pancreatitis: a randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 371, 651-659 (2008).
- Lakhdari, O., et al. Identification of NF-kappaB modulation capabilities within human intestinal commensal bacteria. J. Biomed. Biotechnol. 2011, 282356 (2011).
