Summary
Nous introduisons une nouvelle méthode pour le maintien de la muqueuse intestinale humaine dans la culture et le suivi de la réponse à différents types de stimuli sur au moins 24 heures. Avec notre procédé, la polarité de la conservation du tissu, ce qui permet une stimulation physiologique par voie apicale.
Abstract
Peu de modèles existent actuellement pour simuler de façon réaliste micro-environnement de la complexité humaine intestin, où une variété d'interactions ont lieu. Homéostasie correcte dépend directement de ces interactions, comme elles façonnent une réponse immunologique toute tolérance inducteur contre des antigènes alimentaires tandis que dans le même temps de montage des réponses immunitaires efficaces contre les microbes pathogènes accidentellement ingéré avec les aliments.
Homéostasie intestinale est préservée aussi à travers diverses interactions complexes entre le microbiote (y compris les souches bactériennes bénéfiques liés à des aliments) et l'hôte, qui régulent l'attachement / dégradation de mucus, la production de peptides antimicrobiens par la barrière épithéliale, et «l'éducation» des cellules épithéliales »qui contrôlent le phénotype tolérogénique ou immunogène de cellules lymphoïdes uniques, gut-résidents» des populations. Ces interactions ont été jusqu'à présent très difficile à reproduire avec des essais in vitroen utilisant soit des lignées de cellules en culture ou des cellules mononucléaires du sang périphérique. En outre, des modèles de souris diffèrent sensiblement dans les composants de la muqueuse intestinale (organisation de la couche de mucus, de la communauté des bactéries commensales) par rapport à l'intestin humain. Ainsi, des études sur une variété de traitements soient traduits dans les cliniques pour les conditions importantes liées au stress ou pathologiques tels que le syndrome du côlon irritable, les maladies inflammatoires de l'intestin ou de cancer colorectal ont été difficiles à réaliser.
Pour répondre à ces questions, nous avons développé un nouveau système qui nous permet de stimuler des explants de muqueuse intestinale de l'homme qui conservent leur in situ conditionné par le microbiote hôte et la réponse immunitaire, d'une manière polarisée. Stimulation apicale polarisée est d'une grande importance pour l'issue de la réponse immunitaire provoquée. Il a été démontré à plusieurs reprises que les mêmes stimuli peuvent produire des réponses complètement différentes quand ils contournent la face apicale de l'épidémie intestinalethelium, en stimulant les cellules épithéliales basolatéral ou d'entrer en contact direct avec les composants de la lamina propria, le passage du phénotype de tolérogénique à immunogène et provoquant une inflammation excessive et inutile dans la région.
Nous avons atteint stimulation polarisée par collage d'une bouteille de cave qui délimitait la zone de stimulation sur la face apicale de la muqueuse comme cela sera décrit dans le protocole. Nous avons utilisé ce modèle pour examiner, entre autres, les effets différentiels des trois souches de lactobacilles différentes. Nous montrons que ce système modèle est très puissant pour évaluer les propriétés immunomodulatrices des probiotiques dans des conditions saines et la maladie.
Protocol
1. Obtention et préparation du tissu
- Tissue (saine ou IBD muqueuse) est obtenue pendant la chirurgie. Une fois que l'échantillon est excisé transfert au laboratoire dès que possible, en le gardant dans + + tampon HBSS sans Ca + + / Mg complété avec Pen / Strep à 4 ° C ou sur de la glace.
* La taille de l'échantillon dépend de la disponibilité du tissu: la partie du tissu obtenu est strictement ce qui n'est pas nécessaire pour le diagnostic et peut varier considérablement entre les sujets sains et les MII. Les tissus sains est excisé de patients subissant une chirurgie pour le cancer du côlon.
- Laver le tissu doucement et nettoyer tout le matériel mésentérique. Séparer la couche muqueuse de la sous-muqueuse avec des ciseaux et des pinces stériles tout en gardant le tissu dans un tampon HBSS dans une boîte de Pétri (pas nécessairement immergée). Touchez la surface de la muqueuse avec la pince aussi peu que possible.
- Couper la muqueuse en bandes au moins 1 cm de large et le plus longtemps possible. Utilisez deux scalpels stériles, un peu comme si vous coupiez votre nourriture.
- Laver nettoyer la muqueuse doucement dans HBSS et l'étendre sur une boîte de Pétri avec le côté apical vers le haut.
2. Montage de la soie
- Préparer un milieu frais (tisDMEM). Utilisez DMEM supplémenté avec de la glutamine (2 mM) et NaPyr (1 mM), et ajouter 15% de FBS-Na (sérum de veau foetal - Amérique du Nord), 1% ITS-X et 200 ng / ml d'EGF au moment de l'utilisation.
- Remplissez une boîte de Pétri 10 cm avec le reste de la FBS-Na (utiliser environ 30 ml de sorte que les grilles métalliques seront complètement immergés) et submerger les grilles métalliques. Gardez la plaque ouvrir et soutenir les bouteilles en plastique sur son robinet.
* Les grilles en métal sont en fer. La maille est de forme carrée avec un côté de 0,5 mm.
- Prenez 3 pi de colle chirurgicale avec un 10 ou 20 pipette ul. Appliquez-le soigneusement à l'une des frontières d'un cylindre en plastique tout en le tenant f auIRM avec les forceps.
- Placer doucement le cylindre sur le côté apical de la muqueuse, au plus près de l'un des bords de la bande que possible.
- Pour donner le temps de la colle pour fixer fermement le cylindre sur le tissu, préparer la plaque de culture orgue centre-bien: Verser 850 ml ul-1 de milieu dans le centre de bien et de soutenir la grille métallique sur les bords du puits central de la plaque.
- Coupez l'excès de tissu à partir des frontières du cylindre à l'aide de deux scalpels stériles comme avant.
- Soulever légèrement le cylindre avec le tissu joint et placer le côté basolatéral de la grille métallique dans le centre de la plaque.
3. Stimulation
- Utilisez les stimuli de votre choix dans votre concentration préférée.
- Appliquer un volume approprié au centre du cylindre en matière plastique, sans perturber le cylindre ou la surface d'une muqueuse avec la pointe de pipette. Assurez-vous que votre volume choisi couvre uniformément la surface à l'intérieur du cylindre. Envolumes dicated:
Grand cylindre en plastique: 200 pi
Moyen plastique cylindre: 100 pi
Petit cylindre en plastique: 50 pi - Incuber jusqu'à 3 heures dans un incubateur classique.
* Si vous souhaitez incuber points de plus longues périodes, assurez-vous d'utiliser un volume beaucoup plus petit de stimuli (10-20 pi) et de placer directement le tissu dans une atmosphère de 100% d'O 2 dans la pression de 1 atm (voir 3.5) .
- Prenez le milieu avec les stimuli de la surface apicale du tissu et ne remplacent pas un milieu frais, parce que le tissu ne reçoit pas assez d'O 2 si une épaisse couche de support sur la face apicale empêche les échanges gazeux. Recouvrir la plaque.
- Placer le tissu dans une atmosphère de 100% d'O 2 à la pression de 1 atm.
4. La récolte
- Après 24 h de temps de culture totale (± 2,5 h) retirer délicatement le cylindre de etissu e avec l'aide d'un scalpel colle grattant doucement et de le stocker en fonction de l'analyse souhaitée (fixe pour l'immunohistochimie et / ou immunofluorescence, ou refroidissement rapide en N2 liquides pour l'ARN purification et le profilage de l'expression génique ou la purification des protéines et des dosages de Western blot ).
- Récolter le milieu basolatéral de la sécrétion de cytokines profilage. Centrifuger à 8000 rpm pendant 7 min de débris granulés, transférer le surnageant dans un tube Eppendorf (alternativement aliquote) et stocker immédiatement à -20 ° C.
* Si vous voulez garder surnageants de plus, les stocker à -80 ° C.
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Representative Results
Nous avons réussi à maintenir la muqueuse intestinale humaine saine et IBD en culture pendant au moins 24 heures en préservant le bien-être du tissu. Conformément à ses précédentes observations 1, cela n'était possible que si la majorité du temps de culture (au moins 85% du total) a eu lieu en O 2, que le tissu n'a pas survécu pendant 24 heures dans des incubateurs classiques (Figure 2). Nous avons aussi montré que les différentes réponses des explants peuvent être observés sur ce modèle en fonction de la polarité de la stimulation (apical vs basolateral) et l'immunogénicité des stimuli 2,3.
En utilisant ce protocole, nous montrons que différentes souches de probiotiques peuvent provoquer des réactions différentes de la part du tissu. Lactobacillus plantarum NCIMB8826 s'est avéré étonnamment immunogène sur les tissus sains. Contrairement aux deux autres souches de lactobacilles, non seulement at-il induit la migration des cellules lymphoïdes pupilles de la surface supérieure de la muqueuse, mais aussi sensiblement régulée à la hausse d'une chimiokine appropriés à cette migration, CCL4, ainsi que l'IL-1b, une cytokine traditionnellement lié à l'activité pro-inflammatoire. A notre grande surprise, même si nous avions déjà observé une action préventive de L. paracaseï dans un modèle murin de colite 4, cela ne se traduit pas par un effet curatif lors de bactéries vivantes de cette souche ont été appliquées sur les tissus enflammés MII. Au contraire, les trois souches se sont révélées néfastes lorsqu'ils sont utilisés sur les MII muqueuse dans la phase aiguë de la maladie 2.
En outre, nous avons montré que le produit métabolique d'un probiotique, appelé postbiotic, est capable de protéger l'épithélium sain contre une souche de Salmonella plutôt invasive (FB62), tandis que dans le même temps améliore de manière significative l'inflammation lorsqu'il est appliqué sur les MII muqueuse 2.
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Figure 1. Représentation schématique de la mise en place et des photos. Une. Représentation schématique de l'ensemble des vues de côté, b. Représentation schématique de la mise en place, vus du haut, c. Photo de la grille métallique utilisé comme support pour l'explantation. Correctement placée, seul le côté basolatéral entre en contact avec la chambre de milieu central, d. Photo de tout l'ensemble. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 2. Le tissu ne survit culture en O 2. Un tissu. Inculte, fixée à l'arrivée de la salle d'opération,
Figure 3 L'effet d'un stimulus pro-inflammatoire sur les explants C-: tissu non stimulé cultivées pendant les moments indiqués; Sal:.. Tissue contesté par la bactérie Salmonella et cultivées pendant les moments indiqués. La destruction de la couche supérieure de l'épithélium est déjà visible à 2 h. L'explantation présente de nombreuses dégénérescence après 24 h. Grossissement d'origine: 10X.
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Discussion
La nécessité pour les modèles physiologiquement pertinents sur lesquels les traitements pour la muqueuse intestinale humaine peuvent être valablement testées a longtemps été soulignée. De nombreux chercheurs ont identifié les artefacts et les défauts potentiels dans les deux cellules 5 et 6 modèles murins utilisés jusqu'ici à cette fin. En effet, même si les données précliniques prometteurs sont souvent obtenus, ceux-ci se traduisent rarement à l'avantage clinique significatif.
La méthode décrite dans ce travail, présente une adaptation relativement simple, mais efficace et novatrice pour les protocoles existants 7, 8 pour la culture et la stimulation des explants de muqueuse intestinale de l'homme dans un mode polarisé.
Ce modèle pourrait fournir une excellente approche complémentaire pour la production de données pré-cliniques valides avant de prendre un traitement potentiel de toute nature dans les cliniques. Ainsi, les résultats cliniques malheureux 9 pourraient être évités et les chercheurs pourraient pluspromouvoir la sécurité des traitements dans les cliniques pour le traitement de conditions inflammatoires aiguës.
Les principaux avantages de ce modèle sont la possibilité de comparer stimulation polarisée polarisée par rapport aux non et de suivre la réaction du tissu sur une période de 24 heures. Un paramètre très important est que, dans chaque expérience, les différents traitements sont appliqués sur des explants provenant du même patient qui permet de prendre en compte la variabilité entre les patients. Le fait que les explants sont d'une taille relativement importante par rapport aux biopsies signifie également que diverses analyses peuvent être effectuées sur le même explant, confirmant les résultats de plusieurs façons différentes (tests ELISA, rtPCRs quantitatives, les analyses de biopuces, immunohistochimie et / ou immunofluorescence données). En outre, d'autres types d'analyses pourraient être optimisés à l'avenir, tels que la purification de populations de cellules d'intérêt à partir d'explants stimulés et l'évaluation de leur phénotype par cytofluorimétrique analysesis.
Cependant, il ya aussi des limites importantes à prendre en compte. Lors de sa forme actuelle, ce modèle n'est pas adapté pour le criblage à haut débit d'un grand nombre de traitements, car il repose sur la disponibilité du tissu. modèles de culture cellulaire sont probablement plus approprié à cet effet car ils sont faciles à manipuler et effectuer un grand nombre de stimulations sur 10, tandis que le modèle que nous décrivons serait plus efficacement utilisé comme test de fin des traitements candidats avant d'entrer dans les cliniques. En outre, le délai pendant lequel nous avons réussi à préserver la viabilité du tissu ne permet pas pour des expériences nécessitant de longues périodes de surveillance, tels que l'interférence ARN. Enfin, la stimulation bactérienne est effectuée dans un incubateur régulière et ne permet pas de préserver ou de tester l'effet des bactéries anaérobies. Il est de notre intention de travailler sur ces questions à l'avenir.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous remercions Erika Mileti pour un excellent support technique et le Dr Antonio Di Sabatino pour fournir des chambres à oxygène.
Financement: Ce travail a été soutenu par des subventions du programme-cadre de l'UE 7 (IBDase, ERC: Dendroworld) et la Fondazione Cariplo à MR et le soutien d'un réseau international Marie Curie de formation à la mobilité (Cross-Talk, accord de subvention n °: 21553-2) à KT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 10X HBSS | Eurocalne | ECM4006XL | |
| Peni/Strepto | Lonza | DE17602E | |
| Gentamycin | Gibco | 15750-037 | |
| DMEM | Lonza | BE12614 | |
| FBS-Na | Gibco | 16000-044 | |
| 100X ITS-X | Gibco | 51500-056 | |
| EGF | Tebu-bio | 100-15 | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17605E | |
| Non essential aminoacids 100X | Gibco | 11140-035 | |
| NaPyr | Gibco | 11360-039 | |
| Materials | |||
| Cloning cylinders 6x8 mm | BellCo | 2090-00608 | |
| Cloning cylinders 8x8 mm | BellCo | 2090-0080 | |
| Cloning cylinders 10x10 mm | BellCo | 2090-01010 | |
| Metal grids | Home made | ||
| Centre well organ culture plate | BD Falcon | 353037 | |
| Surgical glue (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Oxygen Jars | Home made | ||
| Oxygen tanks | Air Liquid Sanità | ||
References
- Schuller, S., Lucas, M., Kaper, J. B., Giron, J. A., Phillips, A. D. The ex vivo response of human intestinal mucosa to enteropathogenic Escherichia coli infection. Cell. Microbiol. 11, 521-530 (2009).
- Tsilingiri, K., et al. Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model. Gut. , (2012).
- Tsilingiri, K., Rescigno, M. Should probiotics be tested on ex vivo organ culture models? Gut Microbes. , Manuscript in preparation (2012).
- Mileti, E., Matteoli, G., Iliev, I. D., Rescigno, M. Comparison of the immunomodulatory properties of three probiotic strains of Lactobacilli using complex culture systems: prediction for in vivo efficacy. PLoS One. 4, e7056 (2009).
- Cencic, A., Langerholc, T. Functional cell models of the gut and their applications in food microbiology--a review. Int. J. Food Microbiol. 141, Suppl 1. S4-S14 (2010).
- te Velde, A. A., Verstege, M. A., Hommes, D. W. Critical appraisal of the current practice in murine TNBS-induced colitis. Inflamm. Bowel Dis. 12, 995-999 (2006).
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