Summary
אנחנו מציגים את שיטה חדשה לשמירה על רירית מעי אנושית בתרבות ובניטור של התגובה לסוגים שונים של גירויים על פני לפחות 24 שעות. בשיטה שלנו, את הקוטביות של הרקמה נשמר, מה שמאפשר לגירוי פיסיולוגי דרך מסלול הפסגה.
Abstract
דגמים אחדים קיימים כיום לדמות מיקרו הסביבה של המעי האנושי המורכב, שבו מגוון רחב של יחסי גומלין יתקיים מציאותי. הומאוסטזיס תקין ישירות תלוי באינטראקציות הללו, כפי שהם מעצבים את סובלנות גרימת תגובה חיסונית נגד אנטיגנים מזון כולו ובו בזמן ההרכבה תגובה חיסונית יעילה כנגד חיידקים פתוגניים לבלוע בטעות עם אוכל.
הומאוסטזיס מעיים נשמר גם דרך אינטראקציות מורכבות שונות בין החיידקים (כולל זני חיידקים מועילים הקשורים לאוכל) והמארח, שמסדירים את הקובץ המצורף / השפלה של ריר, את הייצור של פפטידים מיקרוביאלית על ידי מחסום אפיתל, ו" החינוך "של תאי אפיתל 'ששולט פנוטיפ tolerogenic או immunogenic של ייחודיים, מעיים תושבי תאי הלימפה "אוכלוסיות. אינטראקציות אלה היו עד כה קשים מאוד לשחזר עם מבחני חוץ גופיתאו באמצעות שורות תאים בתרבית או תאי דם היקפיים mononuclear. בנוסף, מודלים עכבר שונים באופן מהותי ברכיבים של רירית המעי (ארגון שכבת ריר, קהילת חיידקי commensal) ביחס למעי האדם. לכן, מחקרים של מגוון רחב של טיפולים שהביאו במרפאות לתנאים חשובים הקשורים ללחץ או פתולוגי כגון תסמונת מעי רגיז, מחלות מעי דלקתיות או סרטן מעי גס היו קשים לביצוע.
כדי לטפל בבעיות אלה, פיתחנו מערכת חדשנית המאפשרת לנו לעורר explants של רירית מעי אדם ששומר עליהם באתרו על ידי מיזוג חיידקי המארח והתגובה חיסונית, באופן קוטבי. גירוי הפסגה מקוטב הוא בעלת חשיבות רבה לתוצאות שהושרו תגובה חיסונית. הוכח שוב ושוב את אותם גירויים שיכולים לייצר תגובות שונות לחלוטין כאשר הם עוקפים את פני הפסגה של EPI המעייםthelium, מגרה את תאי האפיתל basolaterally או לבוא במגע ישיר עם רכיבי propria lamina, מיתוג פנוטיפ מtolerogenic לimmunogenic וגורם לדלקת מיותרת ומוגזמת באזור.
השגנו גירוי מקוטב על ידי הדבקת גליל מערה שתחם את האזור של גירוי על פני הפסגה של הרירית כפי שיפורט בפרוטוקול. אנחנו השתמשנו במודל זה כדי לבחון, בין יתר, השפעות שונות של שלושה זני לקטובצילוס שונים. אנו מראים כי מערכת המודל הזה היא חזקה מאוד כדי להעריך את מאפייני המערכת החיסונית של פרוביוטיקה בתנאים בריאים ומחלה.
Protocol
1. קבלת והכנת רקמות
- רקמה (בריא או IBD רירית) מתקבלת במהלך ניתוח. ברגע שהוא נכרת העברת הדגימה למעבדה בהקדם האפשרי, להשאיר אותו ב+ / Mg + חיץ HBSS Ca + + ללא תוספת פן / סטרפטוקוקוס על 4 מעלות צלזיוס או על קרח.
* גודל הדגימה תלוי בזמינות של הרקמה: חלק מהרקמה שהושגה, הוא אך ורק את מה שאין צורך לאבחון ויכול להשתנות במידה רבה בין נבדקים בריאים ומחלת מעי דלקתי. רקמה בריאה הוא נכרת מחולים שעברו ניתוח לטיפול בסרטן מעי גס.
- שטוף את הרקמות בעדינות ולנקות אותו מכל חומר mesenteric. הפרד את השכבה רירית מsubmucosa באמצעות מספריים מלקחיים סטריליים, תוך שמירה על הרקמה בחיץ HBSS בצלחת פטרי (לא בהכרח immerged). לגעת במשטח הרירי עם המלקחיים קטן ככל האפשר.
- חותכים רירית בפסי ג לפחות 1מ 'רוחב וזמן רב ככל האפשר. השתמש בשני אזמלים סטריליים, הרבה כאילו היית חיתוך האוכל שלך.
- שטוף בעדינות לנקות את הרירית בHBSS ולהרחיב אותו על צלחת פטרי עם צד apical יפנה כלפי מעלה.
2. הרכבה רקמות
- הכן את המדיום חדש (tisDMEM). השתמש DMEM בתוספת גלוטמין (2 מ"מ) וNaPyr (1 מ"מ), ולהוסיף 15% FBS-Na (סרום שור עוברי - בצפון אמריקה), 1% ITS-X ו-EGF 200 ng / ml בעת השימוש.
- למלא צלחת פטרי 10 ס"מ עם שאר FBS-Na (להשתמש בכ -30 מ"ל, כך שרשתות מתכת תהיה שקועות לחלוטין) ולהטביע את רשתות המתכת. שמור את הצלחת לפתוח ולתמוך בגלילי הפלסטיק על הברז שלה.
* רשתות המתכת עשויות ברזל. הרשת היא בצורת ריבוע עם צד של 0.5 מ"מ.
- קח 3 μl של דבק כירורגי עם 10 או 20 פיפטה μl. יש ליישם אותה בזהירות לאחד מגבולותיה של גליל פלסטיק בעת החזקתו fIRM עם המלקחיים.
- מניח בעדינות את הגליל בצד הפסגה של הרירית, קרוב לאחד מגבולות הרצועה ככל האפשר.
- כדי לתת זמן הדבק לצרף את הגליל על הרקמה בתקיפות, להכין צלחת תרבות איבר המרכז היטב: לוותר על 850 מיליליטר μl-1 של מדיום במרכז היטב ותומך ברשת המתכת בשולי של הצלחת המרכזית היטב.
- לחתוך את הרקמות עודפת מהגבולות של הגליל באמצעות שני אזמלים סטריליים כמו קודם.
- רם בעדינות את הגליל עם הרקמה המצורפת ומניח בצד basolateral על רשת המתכת במרכז הצלחת.
3. גרייה
- השתמש בגירויים על פי בחירתך בריכוז המועדף עליך.
- החל הנפח מתאים במרכז גליל הפלסטיק מבלי להפריע את הצילינדר או את פני השטח הרירי עם קצה פיפטה. ודא שעוצמת הקול שבחרת אחיד מכסה את פני השטח בתוך הצילינדר. בתוךכרכי dicated:
גליל פלסטיק גדול: 200 μl
μl 100: גליל פלסטיק בינוני
גליל פלסטיק קטן: 50 μl - דגירה לתקופה של עד 3 שעות בחממה קונבנציונלית.
* אם ברצונך דגירה של נקודות זמן ארוכות יותר, הקפד להשתמש בנפח קטן בהרבה של גירויים (10-20 μl) וישירות למקם את הרקמה באווירה של 100% O 2 בלחץ של כספומט 1 (ראה 3.5) .
- קח בינונית עם הגירויים מחוץ למשטח הפסגה של הרקמה ולא להחליף עם מדיום חדש, משום שהרקמות אינה מקבלים מספיק O 2 אם שכבה עבה של מדיום על פני הפסגה מונעת חילוף גזים. מכסה את הצלחת.
- הנח את הרקמה באווירה של 100% O 2 בלחץ של כספומט 1.
4. קציר
- לאחר 24 שעות של זמן התרבות כולל (± 2.5 שעות) להסיר את הגליל מה בזהירותרקמת הדואר בעזרת דבק בעדינות מגרד אזמל ולאחסן אותו בהתאם לניתוח הרצוי (לתקן אימונוהיסטוכימיה ו / או מבחני immunofluorescence, או הקפאת הצמד בN2 הנוזלי לטיהור RNA ופרופיל ביטוי גן או טיהור חלבונים ומבחני מערב למחוק ).
- למסוק בינוני basolateral לפרופיל הפרשת ציטוקינים. צנטריפוגה ב 8000 סל"ד במשך 7 דקות לפסולת גלולה, להעביר את supernatant בצינור Eppendorf (לחלופין aliquot) ולאחסן באופן מיידי ב -20 ° C.
* אם אתה רוצה לשמור על supernatants למשך זמן ארוך יותר, לאחסן אותם ב -80 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אנחנו הצלחנו לשמור על רירית מעי אדם בריאה וIBD בתרבות במשך לפחות 24 שעות שמירה על שלומה של הרקמה. בהתאם לתצפיות קודם 1, זה היה אפשרי רק אם רוב זמן התרבות (לפחות 85% בסך הכל) התקיים בO 2, כמו הרקמה לא לשרוד במשך 24 שעות בחממות קונבנציונליות (איור 2). יש לנו גם הראו כי תגובות שונות של explants ניתן להבחין במודל זה תלוי בקוטביות של הגירוי (הפסגה לעומת basolateral) וimmunogenicity של הגירויים 2,3.
באמצעות פרוטוקול זה, אנו מראים כי זנים פרוביוטיים שונים יכולים לעורר תגובות שונות בחלק של הרקמה. קטובצילוס Plantarum NCIMB8826 הוכיח את עצמו באופן מפתיע immunogenic על רקמה בריאה. בניגוד לשני זני לקטובצילוס האחרים, לא רק שזה לא יגרום להגירה של תאי הלימפה כדי מחלקות פני השטח העליונים של הרירית, אבל זה גם הוגבר chemokine רלוונטי להעברה זו, CCl4, כמו גם IL-1b, ציטוקינים באופן מסורתי קשורים לפעילות הפרו דלקתית באופן משמעותי. להפתעתנו, למרות שאנחנו הבחנתי בפעולה מונעת של ל 'בעבר paracasei במודל עכבר של קוליטיס 4, זה לא תרגם לאפקט מרפא כאשר חיידקים חיים של זן זה יושמו על רקמה דלקתית IBD. במקום זאת, כל שלושת הזנים הוכיחו מזיקים כאשר נעשה שימוש על IBD רירית בשלב החריף של המחלה 2.
יתר על כן, הראה שחילוף החומרים של המוצר פרוביוטי, הנקרא postbiotic, הוא מסוגל להגן על האפיתל בריא נגד זן סלמונלה ולא פולשני (FB62), ואילו באותו הזמן באופן משמעותי ameliorates דלקת כשהם מיושמים על IBD רירית 2.
_upload/4368/4368fig1.jpg "עבור: תוכן-width =" 5IN "עבור: src =" / files/ftp_upload/4368/4368fig1hires.jpg "/>
איור 1. ייצוג סכמטי של תמונות להגדרה ול.. ייצוג סכמטי של הקבוצה שנצפו עד מהצד, ב. ייצוג סכמטי של הקבוצה שנצפו עד מלמעלה, ג. תמונה של רשת המתכת המשמשת כתמיכה explant. כשהניח כראוי, רק את צד basolateral מקבל במגע עם התא הבינוני המרכזי, ד. תמונה של כל ההרכב. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 2. הרקמה שורדת רק תרבות בO 2. רקמות. חסרות תרבות, שנקבעו עם הגעה מחדר הניתוח,
איור 3 ההשפעה של גירוי הפרו דלקתי על explants C-: רקמת unstimulated תרבית לנקודתי הזמן המצוינת; סאל:.. רקמות תיגר עם סלמונלה ותרבית לנקודתי הזמן המצוינות. ההרס של השכבה העליונה של האפיתל הוא כבר נראה לעין בשעה 2. Explant מציג ניוון נרחב לאחר 24 שעות. ההגדלה מקורית: 10X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הצורך בדגמים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית שבו ניתן לבדוק את הטיפול ברירית מעי אנושי כדין כבר הדגיש ארוך. חוקרים רבים זיהו חפצים ופגמים פוטנציאליים בשניהם תא 5 ומודלי עכבר 6 השתמש עד כה למטרה זו. ואכן, למרות שנתונים פרה מבטיחים לעתים קרובות מתקבלים, אלה רק לעתים נדירות לתרגם לתועלת קלינית משמעותית.
השיטה המתוארת בעבודה זו, מציגה עיבוד פשוט יחסית, אך יעיל וחדשני לפרוטוקולים קיימים 7, 8 לתרבות ולגירוי של רירית מעי explants אדם באופנה מקוטבת.
מודל זה עשוי לספק גישה משלימה מצוינת עבור הדור של נתונים טרום קליניים תקפים לפני נטילת טיפול פוטנציאלי מכל סוג למרפאות. כך, עלולים להימנע והחוקרים יכלו יותר תוצאות מצערות 9 קליניותבטחה לקדם טיפולים למרפאות לטיפול במצבים דלקתיים חריפים.
יתרונותיו העיקריים של המודל הם האפשרות להשוות גירוי מקוטב מקוטב לעומת הלא ולעקוב אחרי התגובה של הרקמה על מסגרת זמן של 24 שעות. פרמטר חשוב מאוד הוא כי בכל ניסוי, את הטיפולים השונים מוחלים על explants הקרובים מאותו המטופל המאפשר תוך לקיחה בחשבון של שונות בין חולים. העובדה שאת explants הוא בגודל גדול יחסית בהשוואה לביופסיות גם אומרת שמגוון של ניתוחים ניתן לבצע באותו explant, המאשר את התוצאות בדרכים רבות ושונות (מבחני ELISA, rtPCRs כמותיים, ניתוחי microarray, אימונוהיסטוכימיה ו / או immunofluorescence נתונים). יתר על כן, סוגים אחרים של ניתוחים יכולים להיות מותאמים בעתיד, כגון טיהור של אוכלוסיות תאים של עניין מexplants והערכה המאולצים של הפנוטיפ שלהם על ידי cytofluorimetric analyאחותי.
עם זאת, יש גם מגבלות חשובות שיש לקחת בחשבון. במתכונתו הנוכחית מודל זה אינו מתאים להקרנת תפוקה גבוהה של מספר רב של טיפולים, כפי שהוא מסתמך על הזמינות של הרקמות. מודלים תרבית תאים הם כנראה מתאימים יותר למטרה זו כפי שהם קלים יותר לטפל ולבצע מספר רב של גירויים על 10 ואילו המודל שאנו מתארים יהיה בצורה יעילה יותר בשימוש כבדיקת סוף טיפולי מועמד לפני הכניסה למרפאות. יתר על כן, פרק הזמן שבמהלכו הצלחנו לשמור על יכולת הקיום של הרקמה אינו מאפשר לניסויים הדורשים ניטור תקופות ארוכות, כגון התערבות RNA. לבסוף, גירוי החיידקים מתבצע בחממה רגילה ואינו מאפשר לשימור או בודק את ההשפעה של חיידקים אנאירוביים. הכוונה שלנו הוא לעבוד על נושאים אלה בעתיד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
אנו מודים לאריקה Mileti לתמיכה טכנית מצוינת ואנטוניו די ד"ר Sabatino למתן החמצן לתאים.
מימון: עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מתכנית ה -7 של האיחוד האירופי המסגרת (IBDase, ERC: Dendroworld) וFondazione Cariplo למר ותמיכה על ידי רשת מארי קירי בינלאומית הכשרת ניידות (Cross-Talk, אין הסכם מענק: 21,553-2) כדי KT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 10X HBSS | Eurocalne | ECM4006XL | |
| Peni/Strepto | Lonza | DE17602E | |
| Gentamycin | Gibco | 15750-037 | |
| DMEM | Lonza | BE12614 | |
| FBS-Na | Gibco | 16000-044 | |
| 100X ITS-X | Gibco | 51500-056 | |
| EGF | Tebu-bio | 100-15 | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17605E | |
| Non essential aminoacids 100X | Gibco | 11140-035 | |
| NaPyr | Gibco | 11360-039 | |
| Materials | |||
| Cloning cylinders 6x8 mm | BellCo | 2090-00608 | |
| Cloning cylinders 8x8 mm | BellCo | 2090-0080 | |
| Cloning cylinders 10x10 mm | BellCo | 2090-01010 | |
| Metal grids | Home made | ||
| Centre well organ culture plate | BD Falcon | 353037 | |
| Surgical glue (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Oxygen Jars | Home made | ||
| Oxygen tanks | Air Liquid Sanità | ||
References
- Schuller, S., Lucas, M., Kaper, J. B., Giron, J. A., Phillips, A. D. The ex vivo response of human intestinal mucosa to enteropathogenic Escherichia coli infection. Cell. Microbiol. 11, 521-530 (2009).
- Tsilingiri, K., et al. Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model. Gut. , (2012).
- Tsilingiri, K., Rescigno, M. Should probiotics be tested on ex vivo organ culture models? Gut Microbes. , Manuscript in preparation (2012).
- Mileti, E., Matteoli, G., Iliev, I. D., Rescigno, M. Comparison of the immunomodulatory properties of three probiotic strains of Lactobacilli using complex culture systems: prediction for in vivo efficacy. PLoS One. 4, e7056 (2009).
- Cencic, A., Langerholc, T. Functional cell models of the gut and their applications in food microbiology--a review. Int. J. Food Microbiol. 141, Suppl 1. S4-S14 (2010).
- te Velde, A. A., Verstege, M. A., Hommes, D. W. Critical appraisal of the current practice in murine TNBS-induced colitis. Inflamm. Bowel Dis. 12, 995-999 (2006).
- Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture. J. Anat. 134, 459-469 (1982).
- Browning, T. H., Trier, J. S. Organ culture of mucosal biopsies of human small intestine. J. Clin. Invest. 48, 1423-1432 (1969).
- Besselink, M. G., et al. Probiotic prophylaxis in predicted severe acute pancreatitis: a randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 371, 651-659 (2008).
- Lakhdari, O., et al. Identification of NF-kappaB modulation capabilities within human intestinal commensal bacteria. J. Biomed. Biotechnol. 2011, 282356 (2011).
