Summary
우리는 적어도 24 시간 동안 자극의 다양한 종류에 대한 응답의 문화와 모니터링 인간의 장 점막의 유지 관리를위한 새로운 방법을 소개합니다. 우리의 방법으로, 조직의 극성이 혀끝의 경로를 통해 생리적 자극 수 있도록 유지됩니다.
Abstract
몇 가지 모델은 현재 현실적으로 상호 작용의 다양한 일어나는 복잡한 인간의 대장의 미세 환경을 시뮬레이션하기 위해 존재한다. 동시에 실수로 음식을 섭취하는 병원성 미생물에 대하여 효과적인 면역 반응을 설치하는 동안 그들은 음식 항원에 대한 전체 면역 반응을 유도 내성 형성으로 적절한 항상성이 직접 이러한 상호 작용에 따라 달라집니다.
장내 항상성은 점액의 부착 / 분해를 조절하는 미생물 (식품 관련 유익한 박테리아 변종 포함)와 호스트 간의 여러 복잡한 상호 작용을 통해도 보존되어, 상피 장벽 항균 펩타이드의 생산, 그리고 "교육" 인구의 고유, 장내 상주 림프 세포의 tolerogenic 또는 면역 표현형 제어 '를 상피 세포. 이러한 상호 작용은 생체 분석에로 재현하는 지금까지 매우 어려웠을배양 세포주 또는 말초 혈액 단핵 세포를 사용하여. 또한, 마우스 모델은 인간의 창자에 대하여 장 점막 (점액 층 조직, 공생 박테리아 사회)의 구성 요소에 실질적으로 차이가 있습니다. 따라서, 이러한 과민성 대장 증후군, 염증성 장 질환이나 대장 암과 같은 중요한 스트레스 관련 또는 병적 조건을 병원에 데려 수 치료의 다양한 연구가 수행하기 어려운되었습니다.
이러한 문제를 해결하기 위해, 우리는 우리가 편광 방식으로, 호스트 미생물 및 면역 반응에 의해 현장 조화에서 자신을 유지 인간의 창자 점막의 절편을 자극 할 수있는 새로운 시스템을 개발했다. 편광 혀끝의 자극의 결과에 대한 매우 중요 면역 반응을 이끌어. 그것은 반복적으로 그들이 장 EPI의 정점 얼굴을 무시할 때 동일한 자극이 완전히 다른 반응을 일으킬 수 것으로 나타났습니다thelium, basolaterally 상피 세포를 자극하거나 고유 층의 구성 요소와 직접 접촉으로 오는 tolerogenic에서 면역 원성에 대한 표현형을 전환하고 지역에서 불필요하고 과도한 염증을 일으키는 원인.
우리는 접착에 의해 점막의 정점 얼굴에 자극의 영역이 같은 프로토콜에 설명한다 구분 동굴 실린더 편광 자극을 달성했다. 우리는 다른 세 가지 유산균 균주의 차등 효과 사이 검토하기 위해이 모델을 사용했다. 우리는이 모델 시스템이 건강과 질병 상태에서 프로바이오틱스의 면역 특성을 평가하는 매우 강력한 것을 보여줍니다.
Protocol
1. 얻기 및 조직 준비
- 조직 (건강 또는 IBD 점막)이 수술하는 동안 얻을 수 있습니다. 일단 시편은 4 ° C에서 또는 얼음에 펜 / Strep의로 보충 칼슘 + + / 마그네슘 + + 무료 HBSS 버퍼에 유지 가능한 빨리 실험실로 전송을 절제합니다.
시편의 * 사이즈는 조직의 가용성에 따라 달라 얻은 조직의 부분은, 진단을 위해 필요하지 않습니다 것을 엄격 건강하고 IBD 주제 사이에서 크게 다를 수 있습니다. 건강한 조직은 대장 암 수술을받은 환자에서 절제합니다.
- 부드럽게 조직을 세척하고 모든 장간막 물질을 청소합니다. 페트리 접시 (반드시 immerged되지 않음)에 HBSS 버퍼에 조직을 유지하면서 멸균 가위와 집게를 사용하여 점막하에서 점막 층을 분리합니다. 가능한 조금 집게와 점막 표면을 터치합니다.
- 최소 1 C는 줄무늬의 점막을 잘라m 폭과 가능한 한 오래. 당신의 음식을 절단하는 것처럼 많은 두 멸균 메스를 사용합니다.
- HBSS에 부드럽게 점막을 청소하고 위쪽을 향하게 정점면 페트리 접시에 그것을 확장 씻으십시오.
2. 조직을 설치
- 새로운 배지 (tisDMEM)를 준비합니다. DMEM는 글루타민 (2 ㎜)와 NaPyr (1 ㎜)로 보완 사용하고 FBS - 나 15 %를 추가 (태아 혈청 - 북미), 1 % ITS-X 및 사용시 200 NG / ML EGF.
- FBS - 나 (금속 그리드가 완전히 빠져들 수 있도록 약 30 mL를 사용한다) 및 잠수함 금속 격자의 나머지 부분과 10cm 페트리 접시를 채우십시오. 접시는 꼭지 플라스틱 실린더를 열고 지원하십시오.
* 금속 격자 철의 만들어집니다. 메쉬 0.5 mm의 측면 사각형 모양입니다.
- 10 20 μL 피펫 수술 접착제의 3 μL를 가져 가라. 이 f를 누른 상태에서 플라스틱 실린더의 경계 중 하나에 조심스럽게 적용집게와 IRM.
- 부드럽게 최대한 가까이 스트립의 경계 중 하나, 점막의 정점 측에 실린더를 놓습니다.
- 물론 중앙에 매체의 850 μL-1 ML을 분배하고 플레이트의 중앙 우물의 가장자리에 금속 격자를 지원 단단히 조직에서 실린더를 연결하는 접착제 시간을주고, 가운데 잘 장기 배양 플레이트를 준비합니다.
- 멀리 이전과 같이 두 개의 멸균 메스를 사용하여 실린더의 경계에서 여분의 조직을 잘라.
- 부드럽게 연결된 조직으로 실린더를 들고 접시의 중앙에 금속 격자의 기저 측면을 놓습니다.
3. 자극
- 원하는 농도 선택의 자극을 사용합니다.
- 피펫 팁 실린더 또는 점막 표면을 방해하지 않고 플라스틱 실린더의 중앙에 적절한 볼륨을 적용합니다. 선택한 볼륨을 균일하게 실린더 내부 표면을 커버해야합니다. 에dicated 볼륨 :
큰 플라스틱 실린더 : 200 μL
보통 플라스틱 실린더 : 100 μL
작은 플라스틱 실린더 : 50 μL - 까지 기존의 배양기에서 3 시간에 대한 품어.
* 당신은 긴 시간 포인트를 배양하고자하는 경우 (3.5 참조) 자극의 아주 작은 볼륨 (20 μL)을 사용하여 확인하고 직접 1 기압의 압력에서 100 % O 2 분위기에서 조직을 배치 .
- 혀끝의 얼굴에 매체의 두꺼운 층이 가스 교환 수없는 경우 조직이 2 O 충분하지 않기 때문에, 조직의 혀끝의 표면에 떨어져 자극으로 매체를 가지고 신선한 배지로 교환하지 않는다. 플레이트를 커버.
- 1 기압의 압력에서 100 % O 2 분위기에서 조직을 놓습니다.
4. 수확
- 전체 문화 시간 (± 2.5 시간) 24 시간 후주의 일에서 실린더를 제거전자 메스 부드럽게 긁어 접착제 오프의 도움으로 조직하고 (RNA 정화 및 유전자 발현 프로파일 또는 단백질 정제와 서양 얼룩 분석 액체 N2의 면역 및 / 또는 면역 분석, 또는 스냅 동결 수정하여 원하는 분석에 따라 저장 ).
- 사이토 카인 분비 프로파일에 대한 기저 매체를 수확. 펠렛 파편에 7 분 동안 8,000 rpm으로 원심 분리, 에펜 도르프 튜브 (또는 분취)의 상층 액을 전송하고 즉시 -20 ° C.에 저장
* 당신이 이상 상층 액을 유지하려는 경우, -80에서 보관 ° C.를
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Representative Results
우리는 조직의 웰빙을 유지 적어도 24 시간 동안 문화 건강하고 IBD 인간의 창자 점막을 유지에 성공했다. 문화 시간의 대부분 (전체의 85 % 이상) O 2에서 일어났다면 이전의 관찰 1 항에 따라,이 조직이 기존의 인큐베이터에서 24 시간 (그림 2) 생존하지 않았습니다으로 만 가능했다. 우리는 또한 절편의 다양한 반응을 자극 (혀끝 대 기저)과 자극 2,3의 면역 원성의 극성에 따라이 모델에서 관찰 될 수있는 것으로 나타났습니다.
이 프로토콜을 사용하여, 우리는 다른 프로 바이오 틱 균주는 조직의 부분에 서로 다른 반응을 유도 할 수 보여줍니다. 유산균 plantarum NCIMB8826는 건강한 조직에 놀라 울 정도로 면역 것으로 판명. 두 개의 다른 유산균 균주는 달리, 그것은에 림프 세포의 이동을 유도하지 않았다 만 점막의 와드는 최상위 표면뿐만 아니라 상당히이 마이그레이션, CCL4뿐만 아니라 IL-1b의 전통적 염증성 활동과 관련된 사이토 카인에 관련된 케모카인을 상향 조절. 놀랍게도, 비록 우리가 이전 L.의 예방 조치를 관찰했다 이 변형의 살아있는 박테리아 염증 IBD 조직에 적용했을 때 대장염 4의 마우스 모델에서 paracasei,이 치료 효과에 번역하지 않았다. 질병 2의 급성 단계에서 IBD 점막에 사용하면 오히려 세 가지 변종 해로운 입증했다.
또한, 우리는 IBD 점막 2 적용될 때 동시에 크게 염증을 개선한다 동안 postbiotic라는 프로 바이오 틱의 신진 대사 제품은, 오히려 침략 살모넬라 균주 (FB62)에 대한 건강한 상피 세포를 보호 할 수 있는지 보여 주었다.
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그림 1.에 대한 지원으로 사용되는 금속 격자의 설정과 사진의 도식 표현..까지 측면에서 볼 세트의 도식 표현, 나.까지 정상, C에서 볼 세트의 도식 표현. 사진 절편. 올바르게 배치 할 때, 오직 기저 측면은 중앙 중간 챔버, D와 접촉옵니다. 전체 앙상블의 사진. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. 조직은 O 2의 문화를 살아. 수술실에서 도착시 고정. 교양 조직,
그림 3 절편에 염증성 자극의 효과는 C-지정된 시간에 포인트를 배양 비자극 조직, 살 :.. 조직은 살모넬라 도전 지정된 시간에 포인트를 배양. 상피의 상부 층의 파괴는 이미 2 시간에 볼 수 있습니다. 절편은 24 시간 후 광범위한 변성을 제공합니다. 원래 배율 : 10X.
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Discussion
인간의 장 점막에 대한 치료가 유효하게 테스트 할 수있는 생리학 관련 모델에 대한 필요성은 오랫동안 강조하고있다. 많은 연구자들은 그 목적을 위해 지금까지 사용한 셀 5와 마우스 모델 모두 6 잠재적 인 유물과 결함을 발견했습니다. 유망한 전임상 데이터가 자주 얻을 수있다하더라도, 실제로, 이들은 거의 중요한 임상 이득으로 변환하지 않습니다.
이 작품에서 설명하는 방법은, 문화와 편광 방식으로 인간의 창자 점막 절편의 자극에 대한 기존의 프로토콜을 7, 8, 비교적 간단하면서도 효과적인 새로운 적응을 제공합니다.
이 모델은 클리닉에 어떤 종류의 잠재적 인 치료를 복용하기 전에 유효한 사전 임상 데이터의 생성에 대한 훌륭한 보완적인 접근 방법을 제공 할 수 있습니다. 따라서, 불행한 임상 결과 9 잠재적으로 피할 수와 연구자들은 더 많은 수안전 급성 염증의 처리를 위해 병원에 치료를 촉진한다.
모델의 주요 장점은 편광 대 비 편광 자극을 비교하고 24 시간 기간 동안 조직의 응답을 따를 수 있습니다. 매우 중요한 매개 변수는 모든 실험에서, 다른 치료는 환자 사이의 계정 다양성을 고려 할 수 있습니다 동일한 환자에서 오는 절편에 적용되는 것입니다. 절편은 조직 검사에 비해 비교적 큰 크기가 있다는 사실 또한 다양한 분석은 여러 가지 방법 (ELISA 분석 실험, 정량 rtPCRs, 마이크로 어레이 분석, 면역 및 / 또는 면역의 결과를 확인, 동일한 절편을 수행 할 수 있다는 것을 의미합니다 데이터)를 참조하십시오. 또한, 분석의 다른 유형은 cytofluorimetric analy하여 이러한 그들의 표현형의 자극 절편 및 평가의 관심의 세포 인구의 정제로, 미래에 최적화 될 수동생.
그러나 고려되어야 할 중요한 제한 사항도 있습니다. 그것은 조직의 가용성에 의존으로 현재의 형태로이 모델은 치료의 큰 숫자의 높은 처리량 검사에 적합하지 않습니다. 그들은 우리가 설명하는 모델을보다 효율적으로 병원에 들어가기 전에 후보자 치료의 최종 테스트로 사용되는 반면, 10 자극의 큰 숫자를 처리하고 쉽게 수행 할 수 있습니다으로 세포 배양 모델은 아마도 그 목적에 더 적합합니다. 또한, 우리는 조직의 생존을 유지하기 위해 성공하는 시간 프레임은 RNA 간섭만큼 모니터링 기간을 필요로하는 실험을 허용하지 않습니다. 마지막으로, 세균의 자극은 정기적 인큐베이터에서 수행되고 혐기성 박테리아의 효력을 유지하거나 시험을 허용하지 않습니다. 그것은 미래에 이러한 문제를 해결하기 위해 우리의 의도이다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 산소 챔버를 제공하는 우수한 기술 지원 및 박사 안토니오 디 Sabatino의를 위해 에리카 Mileti 감사합니다.
자금 조달 : MR에와 폰다 치오 Cariplo와 마리 퀴리 국제 교육 이동성 네트워크 (크로스 토크 부여 계약 번호 : 21553-2)에 의해 지원 :이 작품은 7 EU 프레임 워크 프로그램 (Dendroworld IBDase, ERC)에서 교부금에 의해 지원되었다 KT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 10X HBSS | Eurocalne | ECM4006XL | |
| Peni/Strepto | Lonza | DE17602E | |
| Gentamycin | Gibco | 15750-037 | |
| DMEM | Lonza | BE12614 | |
| FBS-Na | Gibco | 16000-044 | |
| 100X ITS-X | Gibco | 51500-056 | |
| EGF | Tebu-bio | 100-15 | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17605E | |
| Non essential aminoacids 100X | Gibco | 11140-035 | |
| NaPyr | Gibco | 11360-039 | |
| Materials | |||
| Cloning cylinders 6x8 mm | BellCo | 2090-00608 | |
| Cloning cylinders 8x8 mm | BellCo | 2090-0080 | |
| Cloning cylinders 10x10 mm | BellCo | 2090-01010 | |
| Metal grids | Home made | ||
| Centre well organ culture plate | BD Falcon | 353037 | |
| Surgical glue (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Oxygen Jars | Home made | ||
| Oxygen tanks | Air Liquid Sanità | ||
References
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