Summary
Vi introduserer en ny fremgangsmåte for vedlikehold av human intestinal mukosa i kultur og overvåking av responsen på ulike typer stimuli over minst 24 timer. Med foreliggende fremgangsmåte, er polariteten av vev opprettholdes, slik at for en fysiologisk stimulering via den apikale rute.
Abstract
Få modeller i dag eksisterer for å realistisk simulere komplekse menneskelige tarmen mikro-miljø, der en rekke interaksjoner finner sted. Riktig homeostase er direkte avhengig av disse interaksjonene, så de former en hel immunologisk respons indusere toleranse mot mat-antigener, mens på samme tid montering effektive immunresponser mot patogene mikrober puttes i munnen sammen med mat.
Intestinal homeostase er bevart også gjennom forskjellige komplekse interaksjoner mellom den bakterieflora (inkludert mat-forbundet fordelaktige bakteriestammer) og verten, som regulerer fundament / degradering av slim, produksjon av antimikrobielle peptider ved den epiteliale barrieren, og "utdannelse" i epitelceller 'som styrer tolerogenic eller immunogenic fenotype av unike, gut-resident lymfoide celler' populasjoner. Disse interaksjonene har vært så langt veldig vanskelig å gjengi med in vitro analyserved hjelp av enten dyrkede cellelinjer eller perifere mononukleære blodceller. I tillegg musemodeller avviker vesentlig i komponenter av tarmslimhinnen (slim lag organisasjon, kommensal bakterie fellesskap) med hensyn til den menneskelige tarm. Således har undersøkelser av en rekke behandlinger for å bli brakt i klinikker for viktige stressrelaterte eller patologiske tilstander slik som irritabel tarmsyndrom, inflammatorisk tarmsykdom eller kolorektal kreft har vært vanskelig å utføre.
For å løse disse problemene, har vi utviklet et nytt system som gjør oss i stand til å stimulere explants av menneskelig tarmslimhinnen som beholder sin in situ condition av verten bakterieflora og immunrespons, i en polarisert mote. Polarisert apical stimulering er av stor betydning for utfallet av fremkalte immunrespons. Det har gjentatte ganger blitt vist at de samme stimuli kan produsere helt forskjellige responser når de omgå den apikale ansiktet til den intestinale epithelium, stimulere epitelceller basolaterally eller kommer i direkte kontakt med lamina propria komponenter, bytte fenotypen fra tolerogenic til immunogenic og forårsaker unødvendig og overdreven betennelse i området.
Vi oppnådde polarisert stimulering ved å lime en hule sylinder som avgrenses området stimulering på den apikale forsiden av slimhinnen som vil bli beskrevet i protokollen. Vi brukte denne modellen til å undersøke, blant andre, differensial effekten av tre forskjellige Lactobacilli stammer. Vi viser at denne modellen systemet er svært kraftig for å vurdere immunmodulerende egenskaper av probiotika i friske og sykdom forhold.
Protocol
En. Innhenting og Klargjøre Tissue
- Vev (sunn eller IBD slimhinner) oppnås under operasjonen. Når prøven er uttatt overføring til laboratoriet så snart som mulig, å holde den i Ca + + / Mg + + fri HBSS-buffer supplert med Pen / Strep ved 4 ° C eller på is.
* Størrelsen av prøven er avhengig av tilgjengeligheten av vevet: den del av vev oppnådd, er det strengt tatt ikke er nødvendig for diagnose og kan variere sterkt mellom friske og IBD forsøkspersoner. Friskt vev fjernes fra pasienter som gjennomgår kirurgi for kreft i tykktarmen.
- Vask vev forsiktig og rens det for alt mesenteric materiale. Separer den mucosa laget fra submucosa ved hjelp av sterile pinsetter saks og samtidig holde vevet i HBSS-buffer i en petriskål (ikke nødvendigvis immerged). Trykk på slimhinnen med tang så lite som mulig.
- Skjær slimhinnene i striper på minst en cm bred og så lenge som mulig. Bruk to sterile skalpeller, mye som om du skulle kutte mat.
- Vask rense slimhinnene forsiktig i HBSS og utvide det på en petriskål med den apikale siden vendt oppover.
2. Montering av Tissue
- Forbered frisk medium (tisDMEM). Bruk DMEM supplert med glutamin (2 mM) og NaPyr (1 mM) og tilsettes 15% FBS-Na (kalvefosterserum - nordamerikanske), 1% SIN-X, og 200 ng / ml EGF ved tidspunktet for bruk.
- Fyll en 10 cm petriskål med resten av FBS-Na (bruke omtrent 30 ml, slik at metall-nett vil være helt neddykket) og senk metall-nett. Hold platen åpne og støtte de plastsylindre på trykk sin.
* Metallet nett er laget av jern. Duken er firkantet med en side på 0,5 mm.
- Ta 3 ul av kirurgisk lim med en 10 eller 20 mL pipette. Bruk den forsiktig til en av grensene til en plastikk sylinder mens du holder den fIRM med tang.
- Forsiktig plassere sylinderen på den apikale side av slimhinnene, som nær en av kantene av strimmelen som mulig.
- For å gi limet tid for å fast feste sylinderen på vev, klargjøres senter-brønn organ kultur plate: Tilsett 850 pl-1 ml medium i sentrum godt og støtt metallrist på kantene av platens sentrale godt.
- Skjær vekk overflødig vev fra grensen til sylinderen ved hjelp av to sterile skalpeller som før.
- Løft forsiktig sylinder med vedlagte vev og plasser basolateral side på metallrist i sentrum av platen.
3. Stimulering
- Bruk stimuli av ditt valg i ønsket konsentrasjon.
- Anvende passende volum i sentrum av plastsylinderen uten å forstyrre sylinder eller slimhinnen med pipettespissen. Sørg for at du har valgt volum jevnt dekker overflaten inne i sylinderen. Idicated volumer:
Stor plast sylinder: 200 ul
Medium plastsylinder: 100 pl
Liten plast sylinder: 50 pl - Dyrkes i inntil tre timer i en vanlig inkubator.
* Hvis du ønsker å ruge for lengre tidspunkter, må du bruke et mye mindre volum av stimuli (10-20 mL) og direkte plassere vev i en atmosfære av 100% O 2 i trykket av en ATM (se 3.5) .
- Ta medium med stimuli utenfor den apikale overflaten av vevet og erstatter ikke med friskt medium, fordi vevet ikke får nok O 2 hvis et tykt lag med medium på den apikale ansiktet hindrer gassutveksling. Dekk platen.
- Plasser vev i en atmosfære av 100% O 2 i trykk på 1 atm.
4. Høsting
- Etter 24 timer av total kultur tid (± 2,5 t) forsiktig fjerne sylinderen fra the vev ved hjelp av en skalpell forsiktig skrape limet av og lagre den avhengig av ønsket analyse (fikse for immunhistokjemi og / eller immunfluorescens analyser, eller snap fryse i flytende N2 for RNA rensing og genuttrykk profilering eller protein rensing og Western blot analyser ).
- Høste basolateral medium for cytokin sekresjon profilering. Sentrifuger ved 8000 rpm i 7 minutter for å pelletere rusk, Overfør supernatanten i en Eppendorf rør (alternativt alikvot) og umiddelbart lagres ved -20 ° C.
* Hvis du ønsker å holde supernatants for lenger, lagre dem ved -80 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi lyktes i å opprettholde en sunn og IBD menneskelige tarmslimhinnen på kultur i minst 24 timer bevare trivsel i vevet. I overensstemmelse med tidligere observasjoner 1, var dette bare mulig dersom flertallet av kulturen tid (minst 85% av totalen) fant sted i O 2, som vevet ikke overleve i 24 timer i konvensjonelle inkubatorer (figur 2). Vi har også vist at forskjellige reaksjoner fra eksplantater kan observeres på denne modell, avhengig av polariteten av stimulering (apikale vs basolateral), og immunogenisiteten av stimuli 2,3.
Ved hjelp av denne protokollen, viser vi at ulike probiotiske kan lokke fram ulike reaksjoner på vevets del. Lactobacillus plantarum NCIMB8826 viste seg å være overraskende immunogent på friskt vev. I motsetning til de to andre Lactobacilli stammer, ikke bare det indusere migrasjon av lymfoide celler til avdelinger den øverste overflaten av slimhinnen, men det har også en signifikant oppregulert kjemokin relevant for denne migreringen, CCI4, i tillegg til IL-1B, et cytokin som tradisjonelt er relatert til pro-inflammatorisk aktivitet. Til vår overraskelse, selv om vi hadde tidligere observert en forebyggende handling av L. paracasei i en mus modell av kolitt 4, gjorde dette ikke oversette til en helbredende effekt når levende bakterier av denne stamme ble brukt på betent IBD vev. Snarere, viste alle tre stammer skadelig når de brukes på IBD mukosa i den akutte fase av sykdommen 2..
Videre viste vi at det metabolske produkt av en probiotiske, kalt postbiotic, er i stand til skjerming sunn epitel mot en heller invasiv Salmonella-stamme (FB62), mens på samme tid betydelig ameliorates betennelse når de påføres på IBD mucosa to.
_upload/4368/4368fig1.jpg "fo: content-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/4368/4368fig1hires.jpg "/>
Figur 1. Skjematisk fremstilling av oppsett og bilder. En. Skjematisk fremstilling av oppsettet sett fra siden, f.. Skjematisk fremstilling av oppsettet sett fra toppen, ca. Bilde av metall rutenett brukes som støtte for eksplantering. Når riktig plassert, blir bare den basolateral side i kontakt med den sentrale medium kammer, d.. Bilde av hele ensemblet. Klikk her for å se større figur .
Figur 2. Vevet overlever bare kultur i O 2. En. Uncultured vev, fast ved ankomst fra operasjonsstuen,
Figur 3 Effekten av en pro-inflammatorisk stimulus på eksplantater C-: ustimulerte vev dyrket i de indikerte tidspunkter; Sal:.. Tissue utfordret med Salmonella og dyrket i de indikerte tidspunkter. Ødeleggelsen av de øvre lag av epitelet er allerede synlig på 2 timer. Eksplantering presenterer omfattende degenerasjon etter 24 timer. Original forstørrelse: 10x.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Behovet for fysiologisk relevante modeller på hvilke behandlinger for human intestinal mukosa kan være gyldig testet har lenge blitt understreket. Mange forskere har identifisert mulige gjenstander og mangler i både celle 5 og mus modeller seks brukt så langt for det formålet. Faktisk, selv om lovende prekliniske data blir ofte innhentet, disse sjelden oversette til betydelig klinisk nytte.
Metoden som beskrives i dette arbeidet, oppviser en forholdsvis enkel, men allikevel effektiv og ny tilpasning til eksisterende protokoller 7, 8 for kulturen og stimulering av humane tarmslimhinnen eksplantater i et polarisert måte.
Denne modellen kan gi en utmerket komplementær tilnærming for generering av gyldige pre-kliniske data før du tar en potensiell behandling av noe slag til klinikkene. Dermed kan uheldige kliniske utfall 9 potensielt unngås og forskere kunne mertrygt fremme behandlinger til klinikker for behandling av akutte inflammatoriske tilstander.
De største fordelene med modellen er at det åpnes for å sammenligne polarisert versus ikke polarisert stimulering og å følge vevets reaksjon over en 24 timers tidsperiode. En meget viktig parameter er at i hvert eksperiment, blir de forskjellige behandlinger anvendt på eksplantater som kommer fra den samme pasient som gjør det mulig å ta hensyn til variabiliteten mellom pasienter. Det faktum at eksplantater er av en relativt stor størrelse sammenlignet med biopsier betyr også at en rekke analyser kan bli utført på samme eksplantasjon bekrefter resultater i mange forskjellige måter (ELISA-analyser, kvantitative rtPCRs, mikromatrise analyser, immunhistokjemi og / eller immunfluorescens data). Videre kan andre typer analyser være optimalisert i fremtiden, for eksempel rensing av celle populasjoner av interesse fra stimulerte eksplantater og evaluering av fenotype deres ved cytofluorimetric analysesis.
Men det er også viktige begrensninger som må tas i betraktning. I sin nåværende form denne modellen er ikke egnet for høy overføringshastighet screening av et stort antall behandlinger, da det er avhengig av tilgjengeligheten av vevet. Cellekultur modeller er sannsynligvis mer egnet for dette formål fordi de er enklere å håndtere og utføre et stort antall stimuleringer på 10 mens modellen beskriver vi ville være mer effektivt brukt som slutten testing av kandidat-behandlinger før de går inn i klinikker. Videre gjør den tidsperiode som vi har lykkes å bevare levedyktighet av vevet ikke tillate for eksperimenter som krever lange overvåking perioder, for eksempel RNA interferens. Til slutt blir den bakterielle stimulering utføres i en vanlig inkubator og kan ikke brukes ved konservering eller testing av effekten av anaerobe bakterier. Det er vår intensjon å arbeide med disse spørsmålene i fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi takker Erika Mileti for god teknisk støtte og Dr. Antonio Di Sabatino for å gi oksygen kamre.
Finansiering: Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra EUs 7. rammeprogram (IBDase, ERC: Dendroworld) og Fondazione Cariplo til MR og støtte av en Marie Curie internasjonale opplæring mobilitet nettverk (Cross-Talk, stipendavtale No: 21553-2) til KT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 10X HBSS | Eurocalne | ECM4006XL | |
| Peni/Strepto | Lonza | DE17602E | |
| Gentamycin | Gibco | 15750-037 | |
| DMEM | Lonza | BE12614 | |
| FBS-Na | Gibco | 16000-044 | |
| 100X ITS-X | Gibco | 51500-056 | |
| EGF | Tebu-bio | 100-15 | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17605E | |
| Non essential aminoacids 100X | Gibco | 11140-035 | |
| NaPyr | Gibco | 11360-039 | |
| Materials | |||
| Cloning cylinders 6x8 mm | BellCo | 2090-00608 | |
| Cloning cylinders 8x8 mm | BellCo | 2090-0080 | |
| Cloning cylinders 10x10 mm | BellCo | 2090-01010 | |
| Metal grids | Home made | ||
| Centre well organ culture plate | BD Falcon | 353037 | |
| Surgical glue (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Oxygen Jars | Home made | ||
| Oxygen tanks | Air Liquid Sanità | ||
References
- Schuller, S., Lucas, M., Kaper, J. B., Giron, J. A., Phillips, A. D. The ex vivo response of human intestinal mucosa to enteropathogenic Escherichia coli infection. Cell. Microbiol. 11, 521-530 (2009).
- Tsilingiri, K., et al. Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model. Gut. , (2012).
- Tsilingiri, K., Rescigno, M. Should probiotics be tested on ex vivo organ culture models? Gut Microbes. , Manuscript in preparation (2012).
- Mileti, E., Matteoli, G., Iliev, I. D., Rescigno, M. Comparison of the immunomodulatory properties of three probiotic strains of Lactobacilli using complex culture systems: prediction for in vivo efficacy. PLoS One. 4, e7056 (2009).
- Cencic, A., Langerholc, T. Functional cell models of the gut and their applications in food microbiology--a review. Int. J. Food Microbiol. 141, Suppl 1. S4-S14 (2010).
- te Velde, A. A., Verstege, M. A., Hommes, D. W. Critical appraisal of the current practice in murine TNBS-induced colitis. Inflamm. Bowel Dis. 12, 995-999 (2006).
- Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture. J. Anat. 134, 459-469 (1982).
- Browning, T. H., Trier, J. S. Organ culture of mucosal biopsies of human small intestine. J. Clin. Invest. 48, 1423-1432 (1969).
- Besselink, M. G., et al. Probiotic prophylaxis in predicted severe acute pancreatitis: a randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 371, 651-659 (2008).
- Lakhdari, O., et al. Identification of NF-kappaB modulation capabilities within human intestinal commensal bacteria. J. Biomed. Biotechnol. 2011, 282356 (2011).
