Summary
Vi introducerar en ny metod för underhåll av human tarmslemhinna i kultur och övervakning av reaktionerna på olika typer av stimuli över åtminstone 24 timmar. Med vår metod, är polariteten av vävnaden bibehålls, vilket möjliggör en fysiologisk stimulering via apikala rutten.
Abstract
Några modeller finns för närvarande att realistiskt simulera den komplexa mänskliga tarmen s mikro-miljö, där en mängd olika interaktioner äger rum. Korrekt homeostas beror direkt på dessa interaktioner, eftersom de forma en hel immunologisk tolerans svar inducerar mot livsmedel antigener medan samtidigt montera effektiva immunsvar mot patogena mikrober misstag intas med mat.
Intestinal homeostas upprätthålls också genom olika komplexa interaktioner mellan mikroorganismer (inklusive mat-associerade nyttiga bakteriestammar) och värden, som reglerar den bifogade filen / nedbrytning av slem, produktion av antimikrobiella peptider genom epitelbarriären, och "utbildning" av epitelceller "som styr tolerogena eller immunogena fenotyp av unika, gut bosatta lymfoidceller befolkningar. Dessa interaktioner har hittills mycket svårt att reproducera med in vitro-analyseranvändning av antingen odlade cellinjer eller perifera mononukleära blodceller. Dessutom musmodeller skiljer sig avsevärt i delar av tarmslemhinnan (slemlager organisation, bakteriefloran gemenskap) med avseende på den mänskliga tarmen. Således har studier av en mängd olika behandlingar för att föras på klinikerna för viktiga stressrelaterade eller patologiska tillstånd såsom colon irritabile, inflammatorisk tarmsjukdom eller kolorektal cancer varit svårt att genomföra.
För att hantera dessa frågor, har vi utvecklat ett nytt system som gör det möjligt för oss att stimulera explantat av human tarmslemhinna som har kvar sin in situ konditionering av värdens mikroorganismer och immunförsvar, i ett polariserat sätt. Polarized apikal stimulering är av stor betydelse för resultatet av den framkallade immunsvaret. Det har upprepade gånger visat att samma stimuli kan ge helt olika svar när de förbi den apikala ytan av intestinala epithelium, stimulerar epitelceller basolaterally eller kommer i direkt kontakt med komponenter lamina propria, byta fenotypen från tolerogena till immunogena och orsakar onödig och överdriven inflammation i området.
Vi uppnådde polariserad stimulering genom limning en grotta cylinder som avgränsas området av stimulering på den apikala ytan av slemhinnan som kommer att beskrivas i protokollet. Vi använde den här modellen för att undersöka, bland annat, differentiella effekter av tre olika laktobaciller stammar. Vi visar att denna modell systemet är väldigt kraftfullt att bedöma immunmodulerande egenskaper av probiotika på friska och sjukdomstillstånd.
Protocol
Ett. Erhålla och Förbereda Tissue
- Vävnad (friska eller IBD slemhinna) erhålls under operationen. När preparatet skärs överföring till laboratoriet så snart som möjligt, att hålla den i Ca + + / Mg + +-fri HBSS buffert kompletterad med Pen / Strep vid 4 ° C eller på is.
* Storleken på provet beror på tillgången av vävnad: den del av den erhållna vävnaden, är absolut det som inte behövs för diagnos och kan variera kraftigt mellan friska och IBD försökspersoner. Frisk vävnad skärs ut från patienter som opererats för tjocktarmscancer.
- Tvätta vävnaden försiktigt och rengör det om allt mesenterica material. Separera mukosa skiktet från submucosa med steril sax och pincett och samtidigt hålla vävnaden i HBSS-buffert i en petriskål (inte nödvändigtvis immerged). Peka slemhinneytan med pincett så lite som möjligt.
- Skär slemhinnan i ränder på minst 1 cm bred och så länge som möjligt. Använd två sterila skalpeller, mycket som om du skär din mat.
- Tvätta rent slemhinna försiktigt i HBSS och utvidga det på en petriskål med den apikala sidan uppåt.
2. Montering av Tissue
- Bered färskt medium (tisDMEM). Använd DMEM kompletterat med glutamin (2 mM) och NaPyr (1 mM), och tillsätt 15% FBS-Na (fetalt bovint serum - nordamerikanska), 1% ITS-X och 200 ng / ml EGF vid tiden för användning.
- Fyll en 10 cm petriskål med resten av FBS-Na (använd ca 30 ml så att metallgaller kommer vara helt under vattenytan) och dränka metallgaller. Håll plattan öppna och stödja plastcylindrar på sin kran.
* De metallgaller är gjorda av järn. Nätet är kvadratiskt med en sida av 0,5 mm.
- Ta 3 pl kirurgiskt lim med en 10 eller 20 l pipett. Applicera den försiktigt till en av gränserna för en plast cylinder medan du håller det fIRM med pincett.
- Placera försiktigt cylindern på den apikala sidan av slemhinnan, så nära till en av de gränser remsan som möjligt.
- För att ge limmet tid att ordentligt fästa cylindern på vävnaden, förbereda centrum-brunnar organkultur: Fördela 850 il-1 ml medium i centrum väl och stödja metallgaller på kanterna av plattan centrala väl.
- Klipp bort överflödig vävnad från gränsen till cylindern med hjälp av två sterila skalpeller som förut.
- Lyft försiktigt cylinder med den bifogade vävnaden och placera den basolaterala sidan på metallgaller i mitten av plattan.
Tre. Stimulering
- Använd de stimuli som du väljer i önskad koncentration.
- Tillämpa lämplig volym i centrum av plastcylindern utan att störa cylinder eller slemhinneytan med pipettspetsen. Se till att din valda volymen jämnt täcker ytan inuti cylindern. Idicated volymer:
Stor plast cylinder: 200 l
Medium plastcylinder: 100 l
Liten plastcylinder: 50 ^ - Inkubera i upp till 3 h i en konventionell inkubator.
* Om du vill att inkubera längre tidpunkter, se till att du använder en mycket mindre volym av stimuli (10-20 l) och direkt placera vävnaden i en atmosfär av 100% O 2 i tryck av 1 atm (se 3.5) .
- Ta mediet med stimuli utanför den apikala ytan av vävnaden och ersätter inte med färskt medium, eftersom vävnaden inte får tillräckligt med O2 om ett tjockt lager av medium på apikala ytan förhindrar gasutbyte. Täck plattan.
- Placera vävnaden i en atmosfär av 100% O 2 i trycket av 1 atm.
4. Skörd
- Efter 24 timmar av total kultur tid (± 2,5 tim) försiktigt bort cylindern från the vävnad med hjälp av en skalpell försiktigt skrapa lim och förvara den beroende på önskad analys (fixa för immunohistokemi och / eller immunofluorescens analyser, eller snap frysa i flytande N2 för RNA-rening och profilering av genuttryck eller protein rening och västerländska analyser blot ).
- Skörda det basolaterala mediet för cytokinutsöndring profilering. Centrifugera vid 8000 rpm under 7 minuter för att pelletera debris, överför supernatanten i ett Eppendorf-rör (alternativt alikvot) och omedelbart lagra vid -20 ° C.
* Om du vill behålla överstående längre, förvara dem vid -80 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi lyckades bibehålla friska och IBD human tarmslemhinna i odling under minst 24 tim bevara välbefinnandet hos vävnaden. I enlighet med tidigare iakttagelser 1, var detta endast möjligt om majoriteten av kulturen tid (minst 85% av totalt) ägde rum i O 2, eftersom vävnaden inte överlever under 24 timmar i konventionella inkubatorer (Figur 2). Vi har också visat att olika svaren från explantaten kan observeras på denna modell beroende på polariteten hos den stimulering (apikala vs basolateral), och immunogeniciteten hos de stimuli 2,3.
Med hjälp av detta protokoll, visar vi att olika probiotiska stammar kan framkalla olika reaktioner på vävnaden del. Lactobacillus plantarum NCIMB8826 visade sig vara förvånansvärt immunogenisk på frisk vävnad. I motsats till de två andra laktobaciller stammar, inte bara det inducerar migration av lymfoida celler till avvärjer den översta ytan av slemhinnan, men det också betydligt uppregleras en kemokin relevant till detta migration, CCI4, liksom IL-1b, ett cytokin traditionellt relaterad till pro-inflammatorisk aktivitet. Till vår förvåning, även om vi hade tidigare observerat en förebyggande verkan av L. paracasei i en musmodell av kolit 4, gjorde detta översätter inte till en botande effekt då levande bakterier av denna stam applicerades på inflammerad IBD vävnad. Snarare visade alla tre stammar skadligt när det används på IBD slemhinnan i den akuta fasen av sjukdomen 2.
Vidare visade vi att den nedbrytningsprodukt av en probiotisk, kallas postbiotic, kan avskärmning frisk epitel mot en ganska invasiv Salmonellastam (FB62), medan samtidigt avsevärt förbättrar inflammation när den tillämpas på IBD slemhinna 2.
_upload/4368/4368fig1.jpg "fo: innehåll-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/4368/4368fig1hires.jpg "/>
Figur 1. Schematisk representation av set-up och foton. En. Schematiskt upplägg sett från sidan, b.. Schematiskt upplägg sett uppifrån, c.. Foto av metallnät som används som stöd för explantatet. När korrekt placerad, blir bara den basolaterala sidan i kontakt med den centrala mediet kammaren, d.. Bild av hela ensemblen. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2. Vävnaden överlever bara kulturen i O 2. En. Obildad vävnad, fixerad vid ankomst från operationssalen,
Figur 3 Effekten av en pro-inflammatorisk retning på explantaten C-: ostimulerad vävnadsodlingsvätska för de angivna tidpunkterna, Sal:.. Tissue utmanas med Salmonella och odlades under de angivna tidpunkterna. Förstörelsen av det övre skiktet av epitelet är redan synlig vid 2 tim. Explantatet presenterar omfattande degeneration efter 24 tim. Original förstoringen: 10X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Behovet av fysiologiskt relevanta modeller på vilka behandlingar för human tarmslemhinna kan giltigt testas har länge betonat. Många forskare har identifierat potentiella artefakter och defekter i både cell 5 och modeller mus 6 som hittills använts för detta ändamål. Även om den lovande prekliniska data erhålls ofta, dessa översätter sällan betydande kliniska fördelar.
Den metod som beskrivs i detta arbete presenterar en relativt enkel, men effektiv och romanen anpassning till befintliga protokoll 7, 8 för kultur och stimulering av human tarmslemhinna explants i ett polariserat sätt.
Denna modell skulle kunna vara ett utmärkt kompletterande strategi för att generera giltiga pre-kliniska data innan du tar en potentiell behandling av något slag till klinikerna. Således kunde olyckliga kliniska resultat 9 potentiellt undvikas och forskare kunde mersäkert främja behandlingar till klinikerna för hantering av akuta inflammatoriska tillstånd.
De stora fördelarna med modellen är möjligheten att jämföra polariserad kontra icke polariserat stimulans och att följa vävnaden svar under en 24-timmars tidsram. En mycket viktig parameter är att i varje experiment, är de olika behandlingarna på explants kommer från samma patient som möjliggör hänsyn till variabilitet mellan patienter. Det faktum att explantaten är av en relativt stor storlek jämfört med biopsier innebär också att en mängd olika analyser kan utföras på samma explantatet, vilket bekräftar resultat i många olika sätt (ELISA-analyser, kvantitativa rtPCRs, microarray analyser, immunhistokemi och / eller immunfluorescens data). Vidare kan andra typer av analyser optimeras i framtiden, till exempel rening av cellpopulationer av intresse från stimulerade explantat och utvärdering av deras fenotyp av cytofluorimetric analysis.
Men det finns också viktiga begränsningar som ska beaktas. Vid sin nuvarande form denna modell är inte lämplig för hög genomströmning screening av ett stort antal behandlingar, eftersom det är beroende av tillgången av vävnaden. Cellkulturdata modeller är förmodligen mer lämpade för detta ändamål eftersom de är lättare att hantera och utföra ett stort antal stimuli på 10 medan den modell vi beskriver skulle vara mer effektivt används som slutet testning av kandidat behandlingar innan klinikerna. Dessutom tillåter den tid under vilken vi har lyckats att bevara livskraften i vävnaden inte för experiment som kräver långa övervakning perioder, t.ex. RNA-interferens. Slutligen är den bakteriella stimulering genomföras i en vanlig inkubator och tillåter inte för att bevara eller testa effekten av anaeroba bakterier. Det är vår avsikt att arbeta med dessa frågor i framtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Erika Mileti för utmärkt teknisk support och Dr Antonio Di Sabatino för att ge syre kamrarna.
Finansiering: Detta arbete har finansierats med bidrag från EU: s 7 ramprogram (IBDase, ERC: Dendroworld) och Fondazione Cariplo till MR och stöd genom ett Marie Curie internationell utbildning rörlighet nätverk (överhörning, bidragsavtal nr: 21.553-2) till KT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 10X HBSS | Eurocalne | ECM4006XL | |
| Peni/Strepto | Lonza | DE17602E | |
| Gentamycin | Gibco | 15750-037 | |
| DMEM | Lonza | BE12614 | |
| FBS-Na | Gibco | 16000-044 | |
| 100X ITS-X | Gibco | 51500-056 | |
| EGF | Tebu-bio | 100-15 | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17605E | |
| Non essential aminoacids 100X | Gibco | 11140-035 | |
| NaPyr | Gibco | 11360-039 | |
| Materials | |||
| Cloning cylinders 6x8 mm | BellCo | 2090-00608 | |
| Cloning cylinders 8x8 mm | BellCo | 2090-0080 | |
| Cloning cylinders 10x10 mm | BellCo | 2090-01010 | |
| Metal grids | Home made | ||
| Centre well organ culture plate | BD Falcon | 353037 | |
| Surgical glue (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Oxygen Jars | Home made | ||
| Oxygen tanks | Air Liquid Sanità | ||
References
- Schuller, S., Lucas, M., Kaper, J. B., Giron, J. A., Phillips, A. D. The ex vivo response of human intestinal mucosa to enteropathogenic Escherichia coli infection. Cell. Microbiol. 11, 521-530 (2009).
- Tsilingiri, K., et al. Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model. Gut. , (2012).
- Tsilingiri, K., Rescigno, M. Should probiotics be tested on ex vivo organ culture models? Gut Microbes. , Manuscript in preparation (2012).
- Mileti, E., Matteoli, G., Iliev, I. D., Rescigno, M. Comparison of the immunomodulatory properties of three probiotic strains of Lactobacilli using complex culture systems: prediction for in vivo efficacy. PLoS One. 4, e7056 (2009).
- Cencic, A., Langerholc, T. Functional cell models of the gut and their applications in food microbiology--a review. Int. J. Food Microbiol. 141, Suppl 1. S4-S14 (2010).
- te Velde, A. A., Verstege, M. A., Hommes, D. W. Critical appraisal of the current practice in murine TNBS-induced colitis. Inflamm. Bowel Dis. 12, 995-999 (2006).
- Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture. J. Anat. 134, 459-469 (1982).
- Browning, T. H., Trier, J. S. Organ culture of mucosal biopsies of human small intestine. J. Clin. Invest. 48, 1423-1432 (1969).
- Besselink, M. G., et al. Probiotic prophylaxis in predicted severe acute pancreatitis: a randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 371, 651-659 (2008).
- Lakhdari, O., et al. Identification of NF-kappaB modulation capabilities within human intestinal commensal bacteria. J. Biomed. Biotechnol. 2011, 282356 (2011).
