Summary
We zien dat een ontwikkelde biomedische inrichting met continue of gepulseerde zichtbare laser gebaseerde behandeling die wordt gecombineerd met antibiotica (gentamycine), resulteert in een statistisch significant synergistisch effect leidt tot een vermindering van de levensvatbaarheid van
Abstract
Onlangs waren er verschillende publicaties over het bacteriedodende effect van zichtbaar licht, de meeste van hen beweren dat blauwe deel van het spectrum (400 nm-500 nm) is verantwoordelijk voor het doden van verschillende ziekteverwekkers 1-5. De fototoxische effect van blauw licht werd voorgesteld om een resultaat van licht-geïnduceerde reactive oxygen species (ROS) vorming door endogene bacteriële fotosensitizers die meestal licht absorberen in het blauwe gebied 4,6,7 zijn. Er zijn ook meldingen van biociden effect van rode en nabij-infrarood 8 evenals groen licht 9.
In de huidige studie hebben we een methode die liet ons toe om het effect van een hoog vermogen groene (golflengte van 532 nm) continue (CW) en gepulste Q-switched (QS) licht op Pseudomonas aeruginosa karakteriseren ontwikkeld. Met deze werkwijze bestudeerden we ook het effect van groen licht gecombineerd met antibiotica (gentamycine) de bacterie levensvatbaarheid. P. aeruginosa is acEMEENSCHAPPELIJKE noscomial opportunistisch pathogeen, kan verschillende ziekten. De stam is vrij resistent tegen verschillende antibiotica en bevat vele voorspelde AcrB / Mex-achtige RND multidrug efflux systemen 10.
De gebruikte methode vrijlevende stationaire fase Gram-negatieve bacteriën (P. aeruginosa stam PAO1), gekweekt in Luria Broth (LB) medium blootgesteld aan Q-switched en / of CW lasers met en zonder de toevoeging van het antibioticum gentamycine. Cellevensvatbaarheid werd vastgesteld op verschillende tijdstippen. De verkregen resultaten toonden aan dat laserbehandeling alleen celleefbaarheid verminderen niet vergeleken met onbehandelde controle en gentamycine behandeling alleen resulteerde slechts in een 0,5 log reductie van de levensvatbare telling van P. aeruginosa. De gecombineerde laser en gentamycine behandeling resulteerde echter in een synergistisch effect en de levensvatbaarheid van P. aeruginosa werd verminderd met 8 log's.
De voorgestelde werkwijze kan verder worden uitgevoerd via de ontwikkeling van de katheter achtig apparaat in staat is het injecteren van een antibioticum oplossing in de geïnfecteerde orgaan, terwijl tegelijkertijd het verlichten van de ruimte met licht.
Protocol
1. Bacteriële Culture
- Gram-negatieve P. aeruginosa stam PAO1 werden gekweekt in Luria Broth (LB) bij 37 ° C gedurende 18 uur.
- De celkweek werd gecentrifugeerd bij 7.500 rpm (omwentelingen per minuut) gedurende 5 min en de supernatant werd verwijderd.
- De bacteriën werden geresuspendeerd in 10% LB en opnieuw gekweekt gedurende 2 uur om de cultuur stationaire fase opnieuw in te voeren.
- De bacteriesuspensie werd vervolgens verdeeld in twee groepen: de eerste groep (2 buizen) geen antibiotica werden toegevoegd, in de tweede groep we het antibioticum gentamycine (50 ug / ml) toegevoegd.
2. Bepaling van de kolonievormende eenheden (CFU)
- Levensvatbaarheid van de cellen te bepalen 20 gl monsters werden genomen uit het experiment ongeveer elke 2 uur binnen het tijdsbestek van 24 uur. Seriële verdunning van de monsters gemaakt en uitgeplaat op LB agar platen en overnacht geïncubeerd bij 37 ° C.
- Voor elke behandeling, de CFU's per platforme werd bepaald en een vergelijking werd gemaakt tussen de perioden en diverse behandelingen. De log reductie van CFU werd berekend zoals beschreven in Eq. (1):
Log reductie = Logu-LogC [CFU / ml]
Waarin U de kolonievormende eenheden waarde op elk tijdstip, CFU de kolonievormende eenheid terwijl de eenheden van CFU / ml gelijk aan:
CFU / ml = (aantal kolonies x verdunningsfactor) / (volume geënt)
En C is de CFU in het controlemonster op begintijd. Merk op dat U duidt de kolonie vormende factor bij directe meting. - De verdunningsfactor is het aantal verdunningen terwijl elk van hen de concentratie van de bacteriën werd verminderd met een factor 10. Het geënte volume was altijd 200 microliter en het is gerelateerd aan de grootte van onze reageerbuis.
Daarom de concentratie oogpunt vatten, het antibioticum gentamycine was in een concentratie van 50 ug / ml. Wat de bacteriën tot eindhet proces dat we hadden algehele 8 verdunningen. Elke verdunning werd door een factor van 10 en werd gedaan in buisjes van 200 ul. Uitgangspunt was 20 ui monsters toegevoegd aan de 200 ul buis (en dus de initiële concentratie 20/200C 0 = 0.1C0 met C 0 de initiële concentratie in het 20 ui monsters) en de eindconcentratie werd verminderd met 8 ordes van grootte als gevolg van de 8 verdunningen.
3. Verlichting
- CW Nd: YAG laser (golflengte van 532 nm en de gemiddelde optische vermogen van 200 mW) werd gesplitst in twee optische wegen met optische 50% / 50% bundelsplitser. De bundeldiameter ongeveer 10 mm. De blootstellingsduur was 24 uur.
- Q-switched gepulste Nd: YAG laser (golflengte van 532 nm, gemiddeld vermogen van 300 mW en optische piekvermogen van 2,5 MW) werd gesplitst in twee wegen met optische 50% / 50% bundelsplitser. De diameter plek was 6 mm. De pulsbreedte van de Q-switched laser was 6 nsec en de herhalingsfrequentie 15Hz was. Degemiddelde vermogensdichtheid was 106 mW / cm 2 en de piek vermogensdichtheid was 8,83 kW / mm 2. De blootstellingsduur was 24 uur.
Merk op dat de bacteriële suspensie geroerd gedurende de bestraling en werd onder geschikte kweekomstandigheden voor bacteriële groei (in alle buizen was Luria Broth medium om de bacteriën te groeien) gehouden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De laser gebaseerde opstelling is schematisch weergegeven in figuur 1. De eerste experimentele conditie gebruikt een CW Nd: YAG laser met golflengte van 532 nm (de tweede harmonische van de Nd: YAG) en de gemiddelde optische vermogen van 200 mW. Deze bundel werd opgesplitst in twee optische paden met behulp van optische 50% / 50% straaldeler zodanig dat elke split beam had vermogen van 100 mW. De bundeldiameter ongeveer 10 mm en daarmee de vermogensdichtheid ongeveer 100 mW / cm 2. De blootstellingsduur was 24 uur. Hoewel de lichtsterkte relatief hoog is het niet geschikt is voor verwarming van het monster veroorzaken.
De tweede experimentele conditie gebruikt een Q-switched gepulseerde Nd: YAG laser met golflengte van 532 nm (tweede harmonische) en spot diameter van 6 mm. Het gemiddelde vermogen is 300 mW en optische piekvermogen van 2,5 MW. De pulsbreedte van de Q-switched laser was 6 nsec en de herhalingsfrequentie 15Hz was. Deze bundel werd ook opgesplitst in twee paden met behulp van optische50% / 50% beam splitter. De gemiddelde vermogensdichtheid was ongeveer 100 mW / cm 2 en de piek vermogensdichtheid was 8,83 kW / mm 2. Deze piek vermogensdichtheid gelijk aan energie vloeiendheid van 88,3 uJ / mm 2 per puls vanaf elke puls was 10 nsec lang in het tijdsdomein. De blootstellingsduur was 24 uur. Beide experimenten werden onder vergelijkbare groeiomstandigheden uitgevoerd zonder-belichting (dwz zonder gentamycine) die diende als controle.
In Figuren 2 (a) en 2 (b) verkregen effect door belichting van de monsters met CW laserlicht en Q-switched laser respectievelijk met en zonder antibioticum aan P. aeruginosa gepresenteerd.
In de monsters die niet werden blootgesteld aan licht (dwz de controle) was er geen vermindering van de levensvatbaarheid van de cellen met of zonder gentamycine behandeling. Dit resultaat suggereert dat de bacterie zijn bestand tegen gentamycine behandeling, nabootsende situatie vaak aangetroffen in de kliniek.
Het laserlicht alleen ook leverde geen doden of te induceren. De combinatie van laserlicht en gentamycine verminderde levensvatbaarheid bacteriën met verscheidene orden van grootte. De meest opvallende effect werd gemeten na 24 uur, waarbij de combinatie van beide CW of Q-switched laser verminderde de levensvatbaarheid van 8 orden van grootte vergeleken met de meetresultaten van de controlegroep (antibioticum alleen of licht alleen).
Dit is een belangrijk resultaat dat een oplossing van behandeling kan voorstellen voor dit soort antibiotica resistente bacteriën. Het feit dat verschillende uren zijn vereist om effectief doden van de bacteriën te verzamelen, is het klinische potentieel van deze benadering niet verlagen omdat de voorgestelde behandeling in katheters en andere inrichtingen die in het ziekenhuis worden opgenomen. Bijvoorbeeld in figuur 3 geven we een voorbeeld van een ontworpen katheter die extratie van de vloeibare injectiekanaal er meerdere gaten toelaat om gelijktijdig diffunderen goede verlichting in de geïnfecteerde orgaan.
Het aantal monsters voor statistiek 6 was (er was een enkel geval van sommige van de buizen die per ongeluk besmet waren en ze werden uit de statistiek). De p-waarde lager was dan 0,05.
Merk op dat we niet onze experimenten hebben herhaald voor verschillende concentraties van de antibiotica. In al onze experimenten was de concentratie hoog. De reden daarvoor was om de kracht van onze aanpak beter te tonen als in de hoogste concentratie van de bacterie is nog niet aangetast door de antibiotica zonder verlichting en werd vernietigd met de verlichting, het zal uiteraard gebeuren voor lagere concentraties.
Een van de beweegredenen voor het kiezen van de golflengte verlichting was om een golflengte te kiezen waarvoor de bacterieen en antibiotica zijn transparant. Dit wordt aangetoond in figuur 4. Bijkomende reden om het gebruik van de 532 nm laser golflengte was vanwege de beschikbaarheid in ons lab en vanwege het feit dat het ook toegestaan ons hogere lichtsterkte (vergelijking tot de witte lichtbron met spectrale filters) en afstelcapaciteit voor het verkrijgen van vermogen en het gedrag in de verlichting.
Figuur 1. . Bacteriën verlichting setup De laser was ofwel CW Nd: YAG laser of Q-switched gepulste Nd: YAG laser. Links kan men het beeld zien van de experimentele opstelling waarbij de laser wordt verdeeld tussen twee buizen, een met antibiotica en een zonder, teneinde beide oplichten identieke omstandigheden. Beide buizen zijn positie ed een roerder. Schematische tekening van de experimentele opstelling is te zien in het rechter gedeelte van de figuur.
Figuur 2. (A). Effect van CW-laser en gentamycine op P. aeruginosa. Monsters werden belicht met een CW laserlicht (vermogen van 100 mW) met en zonder gentamycine (50 ug / ml). Het gemiddelde van 3 experimenten gepresenteerd. (B). Effect van Q-switched laser en gentamycine op P. aeruginosa. Monsters werden verlicht met Q-switched laser light (1.65 MW) met en zonder gentamycine (50 ug / ml) op blz. levensvatbaarheid aeruginosa. Het gemiddelde van 3 experimenten gepresenteerd.
4370/4370fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/4370/4370fig3.jpg "/>
Figuur 3. De voorgestelde katheter gebaseerd apparaat voor de biomedische behandeling tegen P. aeruginosa. De stippen in de figuur vertegenwoordigen lichtverstrooiing punten waardoor het licht om verspreid te worden in de behandelde weefsel.
Figuur 4 Het absorptiespectrum (in au) golflengte van ongeveer 532 nm voor:. (A). De bacteriën, (b). De gentamycine. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fototherapie is een gebied van geavanceerde multidisciplinair onderzoek in de afgelopen jaren in opkomst als een veelbelovende benadering voor de behandeling tal van ziekten. In dit verband is het gebruik van licht in het zichtbare gebied is uitgebreid bestudeerd. Zo is gebleken dat geïnfecteerde wonden beter kan worden genezen door bloot te stellen aan sterk licht voor sterilisatiedoeleinden. Het werkingsmechanisme van deze benadering werd bewezen door inductie van licht-geïnduceerde zuurstofradicalen (ROS) die de bacteriën 11.
Eerdere studies 6 hebben veel hogere hoeveelheden ROS aangetoond in bacteriën verlicht met blauw licht dan die geïnduceerd door rood en nabij-infrarood licht. Dit verklaart waarom de meeste bewijsmateriaal in de literatuur concentreert zich op het bacteriedodende effect van blauw licht.
Een ander recent voorbeeld voor het gebruik van laserlicht om resistente bacteriën te bestrijden werd aangetoond door Krespi et al.. 12. In dat onderzoek laser werd gegenereerd shockwave technologie gebruikt om biofilms te roeien. Door een miniatuur Q-switched Nd: YAG laser en dunne vezels, speciale probes gegenereerd plasma formatie die schokgolfeffect geproduceerd. De auteurs toonden aan dat deze methode kon effectief verstoren P. aeruginosa biofilms in vitro.
Aanpak is hier in deze studie was enigszins anders 13 als we geprobeerd de werkzaamheid van niet-fotosensibilisator antimicrobieel middel verhogen met laserlicht. Onze resultaten suggereren dat het combineren van antibiotische behandeling met verlichting, de antimicrobiële activiteit kan drastisch worden verhoogd.
In feite, een volledig fenotype, waargenomen in het antibioticum alleen de bacteriën werden gevoelig aanwezigheid van antibiotica en lichtbehandeling. Het werkingsmechanisme van dit effect is niet duidelijk en zal verder investigat vereisenion. In de Electron-paramagnetische resonantie (EPR) metingen die we hebben uitgevoerd om te onderzoeken of ROS ontstaan tijdens de behandeling werd geen significant verschil tussen de verschillende behandelingen verkregen 13. Deze resultaten suggereren dat het effect van de gecombineerde behandeling niet gepaard ROS productie en verschillende mechanismen worden overwogen. Het kan worden verondersteld dat de lichtbehandeling verandert de permeabiliteit en uiteindelijk kan de antibiotica te dringen in de bacteriecel waardoor de doden.
Hoewel het werkingsmechanisme niet volledig onderzocht, onze benadering markeert het potentieel voor de gecombineerde behandeling van licht met commerciële antibioticum dat kan zijn verwijderd door antimicrobiële resistentie terwijl door toepassing van deze combinatie kan nu effectief worden hergebruikt in klinieken.
Uiteraard zoals in het manuscript wordt oplichten van meerdere uren nodig om en Hance de werkzaamheid van de antibiotica. Dit is inderdaad een nadeel van de voorgestelde aanpak. De realisatie van een dergelijke verlichting kan bijvoorbeeld worden verkregen door het installeren van de lichtbron binnen katheters (zoals voorgesteld in figuur 3). Behalve dat, als de wond externe bijzonder banding zoals gips met verlichtingsbron kan worden bovenop de wond en belichten gedurende enkele uren, bijvoorbeeld wanneer de patiënt slaapt 's nachts. Als de infectie interne en de patiënt gehospitaliseerd en hij / zij verbonden infuuszak enkele uren voor sommige organen een belichtingsstelsel kanaal zoals een endoscoop of een speciale vezel kan worden benaderd om het orgaan en continu belichten (met toegepaste antibiotica) terwijl de patiënt gehospitaliseerd (precies zoals de infusiezak is aangesloten op de patiënt gedurende vele uren). Wij zijn het volledig eens dat de aanpak niet goed is voor de behandeling van het algemeen besmette organen.
nt "> Merk op dat in dit manuscript tonen we het voordeel van de voorgestelde techniek voor snelle en praktische toepassing, maar om te komen tot deze andere onderzoeken nodig, zoals in vivo experimenten. Het onderzoek naar toxiciteit op fibroblast of epitheelcellen zal nuttig zijn als ook de studies die het mechanisme van de voorgestelde therapie in bacteriële cellen demonstreren bij. Bovendien in dit document hebben we de hypothese dat licht geïnduceerde veranderingen van het bacteriële membraan dat meer doorlaatbaar voor het antibioticum gemaakt. Uiteraard dingen anders zal een . klinische setting waar bacteriële infecties zijn het gevolg van biofilms Dan zijn er twee grote problemen:. biofilm bacteriën meer resistent vergelijking met hun planktonische tegenhangers en penetratie van antimicrobiële stoffen in de biofilm massa zal beperkt zijn daarom, het verkennen van de effecten van licht en gentamycine op een P. aeruginosa biofilm-model is het doel van onze toekomstige studie.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lauria Broth | Difco | 241420 | |
| Gentamycin | Sigma | G1914 | |
| Bacto Agar | Difco | 231710 |
References
- Feuerstein, O., Persman, N., Weiss, E. I. Phototoxic Effect of Visible Light on Porphyromonas gingivalis and Fusobacterium nucleatum: An In Vitro Study. Photochemistry and Photobiology. 80, 412-415 (2004).
- Enwemeka, C. S., Williams, D., Enwemeka, S. K., Hollosi, S., Yens, D. Blue 470-nm light kills methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in vitro. Photomed. Laser Surg. 27, 221-226 (2009).
- Guffey, J. S., Wilborn, J. In vitro bactericidal effects of 405-nm and 470-nm. Photomed. Laser Surg. 24, 684-688 (2006).
- Lipovsky, A., Nitzan, Y., Friedman, H., Lubart, R. Sensitivity of Staphylococcus aureus strains to broadband visible light. Photochem. Photobiol. 85, 255-260 (2008).
- Lipovsky, A., Nitzan, Y., Lubart, R. A possible Mechanism for visible light induced wound healing. Lasers in Surgery and Medicine. 40, 509-514 (2008).
- Lipovsky, A., Nitzan, Y., Gedanken, A., Lubart, R. Visible light-induced killing of bacteria as a function of wavelength: Implication for wound healing. Lasers in Surgery and Medicine. 42, 467-472 (2010).
- Feuerstein, O., Ginsburg, I., Dayan, E., Veler, D., Weiss, E. Mechanism of Visible Light Phototoxicity on Porphyromonas gingiwalis and Fusobacferium nucleaturn. Photochemistry and Photobiology. 81, 1186-1189 (2005).
- Nussbaum, E. L., Lilge, L., Mazzulli, T. Effects of 630-, 660-, 810-, and 905-nm laser irradiation delivering radiant exposure of 1-50 J/cm2 on three species of bacteria in vitro. J. Clin. Laser Med. Surg. 20, 325-333 (2002).
- Dadras, S., Mohajerani, E., Eftekhar, F., Hosseini, M. Different Photoresponses of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa to 514, 532, and 633 nm Low Level Lasers In Vitro. Current Microbiology. 53, 282-286 (2006).
- Stover, C. K., Pham, X. Q., Erwin, A. L. Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen. Nature. 406, 952-964 (2000).
- Hamblin, M. R., Demidova, T. N. Mechanisms of low level light therapy. Proc. SPIE. 6140, 1-12 (2006).
- Krespi, Y. P., Stoodley, P., Hall-Stoodley, L. Laser disruption of biofilm. Laryngoscope. 118, 1168-1173 (2008).
- Reznick, Y., Banin, E., Lipovsky, A., Lubart, R., Zalevsky, Z. Direct laser light enhancement of susceptibility of bacteria to gentamycin antibiotic. Opt. Commun. 284, 5501-5507 (2011).
