Summary
Wir zeigen, dass eine entwickelte biomedizinischen Vorrichtung mit kontinuierlicher oder gepulster sichtbaren Laser basierende Behandlung, die mit Antibiotika (Gentamycin), führt zu einer statistisch signifikanten synergistischen Effekt führt zu einer Verringerung der Lebensfähigkeit kombiniert
Abstract
Kürzlich gab es mehrere Veröffentlichungen über die bakterizide Wirkung des sichtbaren Lichts, die meisten von ihnen behaupten, dass blaue Teil des Spektrums (400 nm-500 nm) ist verantwortlich für die Tötung verschiedene Pathogene 1-5. Die phototoxische Wirkung von blauem Licht wurde vorgeschlagen, eine Folge der durch Licht induzierten reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) Bildung durch endogene bakterielle Photosensibilisatoren, die meist absorbieren Licht im blauen Bereich 4,6,7 sein. Es gibt auch Berichte von Biozid-Wirkung der roten und nahen infraroten 8 sowie 9 grünes Licht.
In der vorliegenden Studie haben wir eine Methode, die uns um die Wirkung der hohen Leistung Grün (Wellenlänge 532 nm) kontinuierlich (CW) und gepulste Q-switched (QS) Licht auf Pseudomonas aeruginosa charakterisieren erlaubt. Mit dieser Methode untersuchten wir auch die Wirkung von grünem Licht mit einer Antibiotika-Behandlung (Gentamycin) an der Lebensfähigkeit Bakterien kombiniert. P. aeruginosa ist acommon noscomial opportunistische Erreger verschiedener Erkrankungen. Der Stamm ist ziemlich resistent gegen verschiedene Antibiotika und enthält viele vorhergesagt AcrB / Mex-Art RND Multidrug Effluxsysteme 10.
Das Verfahren verwendet freilebenden stationären Phase Gram-negative Bakterien (P. aeruginosa Stamm PAO1) in Luria Broth (LB)-Medium ausgesetzt Q-switched und / oder CW-Laser mit und ohne Zugabe des Antibiotikums Gentamycin. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde zu unterschiedlichen Zeitpunkten bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse zeigten, dass Laser-Behandlung allein nicht reduzieren die Lebensfähigkeit der Zellen im Vergleich zu unbehandelten Kontrolle und dass Gentamycin Behandlung allein nur in einer 0,5 log Reduktion der Keimzahl für P. führte aeruginosa. Die kombinierte Laser-und Gentamycin Behandlung führte jedoch zu einem synergistischen Effekt und die Lebensfähigkeit der P. aeruginosa wurde von 8 LOG reduziert.
Das vorgeschlagene Verfahren kann weiter umgesetztmentiert über die Entwicklung des Katheters ähnliches Gerät in der Lage Einspritzen einer Antibiotika-Lösung in den infizierten Organ gleichzeitig beleuchtet den Bereich mit Licht.
Protocol
1. Bakterienkultur
- Gram-negative P. aeruginosa Stamm PAO1 wurden in Luria Broth (LB) bei 37 ° C für 18 Stunden gezüchtet.
- Die Kultur der Zellen wurde dann bei 7500 rpm (Umdrehungen pro Minute) für 5 min zentrifugiert und der Überstand wurde entfernt.
- Die Bakterien wurden in 10% LB resuspendiert und für weitere 2 Stunden wieder gewachsen, um die Kultur in der stationären Phase erneut einzugeben.
- Die Bakteriensuspension wurde dann in zwei Gruppen unterteilt: in der ersten Gruppe (2 Tuben) kein Antibiotikum zugegeben, in der zweiten Gruppe wir Gentamycin Antibiotikum (50 ug / ml) zugegeben.
2. Bestimmung der Kolonie-bildenden Einheiten (KBE)
- Um die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen 20 ul-Proben wurden aus dem Experiment etwa alle 2 Stunden innerhalb des Zeitrahmens von 24 Stunden gemacht. Serielle Verdünnungen der Proben wurden hergestellt und auf LB-Agarplatten ausplattiert und über Nacht bei 37 ° C inkubiert,
- Für jede Behandlung, die KBE pro plate wurde bestimmt und ein Vergleich zwischen den Zeiträumen und verschiedenen Behandlungen gemacht. Die Log-Reduktion in CFU wurde berechnet, wie in Gl. (1):
Log Reduktion = Logu-LogC [KBE / ml]
Wobei U die koloniebildenden Einheiten Wert zu jedem Zeitpunkt; CFU die koloniebildende Einheit, während die Einheiten der CFU / ml, entsprechend:
CFU / ml = (Anzahl an Kolonien x Verdünnungsfaktor) / (Volumen beimpft)
Und c die CFU in der Kontrollprobe zur Startzeit gefunden. Beachten Sie, dass U die Kolonie bildenden Faktor Messzeitpunkt bezeichnet. - Der Verdünnungsfaktor ist die Anzahl der Verdünnungen während in jedem von ihnen die Konzentration der Bakterien um den Faktor 10 reduziert wurde. Das Volumen geimpft war immer 200 Mikroliter und es wird auf die Größe unseres Reagenzglas zusammen.
Deshalb, um die Konzentration Sicht zusammenzufassen, war das Antibiotikum Gentamycin in einer Konzentration von 50 ug / ml. In Bezug auf die Bakterien, bis zum Ende derdas Verfahren hatten wir insgesamt 8 Verdünnungen. Jede Verdünnung wurde mit einem Faktor von 10 und es wurde in Röhren von 200 ul getan. Der Ausgangspunkt war 20 ul Proben in die 200 ul Röhrchen gegeben (und damit die anfängliche Konzentration war 20/200C 0 = 0.1C0 mit C 0 die anfängliche Konzentration in der 20 ul Proben) und die endgültige Konzentration wurde durch 8 reduziert Größenordnungen aufgrund der 8 Verdünnungen.
3. Beleuchtung
- CW Nd: YAG-Lasers (Wellenlänge von 532 nm und der durchschnittlichen optischen Energie von 200 mW) in zwei optische Wege geteilt durch optische 50% / 50% Strahlteiler. Der Strahldurchmesser betrug etwa 10 mm. Die Expositionsdauer betrug 24 Stunden.
- Gütegeschalteten Nd: YAG-Lasers (Wellenlänge von 532 nm, mittlere Leistung von 300 mW und optische Spitzenleistung von 2,5 MW) wurde ebenfalls in zwei Pfade aufgeteilt, die optische 50% / 50% Strahlteiler. Der Punktdurchmesser betrug 6 mm. Die Impulsbreite des Q-Switch-Laser betrug 6 ns und die Wiederholungsrate war 15Hz. Diemittlere Leistung betrug 106 mW / cm 2 und die Spitzenleistung betrug 8,83 kW / mm 2. Die Expositionsdauer betrug 24 Stunden.
Beachten Sie, dass die Bakteriensuspension während der Bestrahlung gerührt und es wurde unter geeigneten Kulturbedingungen für das bakterielle Wachstum (in allen Röhren gab es Luria Broth Medium, damit die Bakterien wachsen) gehalten.
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Representative Results
Der Laser basierten Setup ist schematisch in Abbildung 1 dargestellt. Die ersten experimentellen Bedingungen verwendete einen CW Nd: YAG-Laser mit einer Wellenlänge von 532 nm ist (der zweiten Harmonischen des Nd: YAG) und der durchschnittlichen optischen Energie von 200 mW. Dieser Strahl wurde in zwei optische Wege geteilt durch optische 50% / 50% Strahlteiler so dass jeder Teilstrahl von 100 mW hat. Der Strahldurchmesser von ca. 10 mm und damit die Leistungsdichte von etwa 100 mW / cm 2. Die Expositionsdauer betrug 24 Stunden. Obwohl der Lichtleistung ist relativ hoch ist, ist nicht hoch genug, um die Erwärmung der Probe führen.
Die zweite experimentellen Bedingungen verwendet eines gütegeschalteten Nd: YAG-Laser mit einer Wellenlänge von 532 nm (zweite Harmonische) und Spot-Durchmesser von 6 mm. Die durchschnittliche Leistung von 300 mW und optische Spitzenleistung von 2,5 MW. Die Impulsbreite des Q-Switch-Laser betrug 6 ns und die Wiederholungsrate war 15Hz. Dieser Strahl wurde auch in zwei Pfade aufgeteilt, die optische50% / 50% Strahlteiler. Die mittlere Leistungsdichte von etwa 100 mW / cm 2 und die Spitzenleistung betrug 8,83 kW / mm 2. Dieser Peak Leistungsdichte entspricht Energie fließend von 88,3 uJ / mm 2 pro Impuls als jeder Impuls 10 nsec lang in dem Zeitbereich ist. Die Expositionsdauer betrug 24 Stunden. Beide Versuche wurden unter ähnlichen Wachstumsbedingungen mit no-Belichtung (dh mit und ohne Gentamycin), die als Kontrolle dienten durchgeführt.
In den 2 (a) und 2 (b) die Wirkung erhalten durch Bestrahlung der Proben mit CW-Laserlicht und mit Q-Switch-Laser jeweils mit und ohne Antibiotikum auf P. aeruginosa dargestellt.
Bei den Proben, die nicht belichtet wurden (dh die Steuerung) gab es keine Verringerung der Lebensfähigkeit der Zellen mit oder ohne Gentamycin Behandlung. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Bakterien resistent gegen die Gentamycin Behandlung sind, imitiertdie Situation in der Klinik oft begegnet.
Das Laserlicht allein auch nicht jede Tötung entweder induzieren. Allerdings reduziert die Kombination von Laserlicht und Gentamycin Bakterien Lebensfähigkeit durch mehrere Größenordnungen. Der prominenteste Effekt wurde nach 24 Stunden, in denen die Kombination von entweder CW oder Q-switched Laser reduziert die Lebensfähigkeit von 8 Größenordnungen im Vergleich zu den Messungen in der Kontrollgruppe (Antibiotikum allein oder Licht allein) erhalten gemessen.
Dies ist ein wichtiges Ergebnis, das eine Lösung von Behandlung für diese Art von antibiotikaresistenten Bakterien vor. Die Tatsache, dass mehrere Stunden erforderlich sind, um eine wirksame Abtötung der Bakterien zu erhalten, verringert nicht die klinische Potenzial dieses Ansatzes, da die vorgeschlagene Behandlung in Kathetern und anderen Geräten im Krankenhaus verwendet eingearbeitet werden können. Zum Beispiel in Abbildung 3 zeigen wir ein Beispiel für einen Katheter entwickelt, in dem in zusätzlichention der Flüssigkeitseinspritzung Kanal gibt es mehrere Löcher ermöglicht, gleichzeitig diffundieren angemessene Beleuchtung in dem infizierten Organ.
Die Anzahl der Proben für die Statistik verwendet wurde, war 6 (es gab ein oder zwei Fälle von einigen der Rohre, die versehentlich kontaminiert wurden und dann wurden sie aus der Statistik genommen). Der p-Wert unterhalb von 0,05.
Beachten Sie, dass wir nicht wiederholen unseren Experimenten für verschiedene Konzentrationen der Antibiotika. In all unseren Experimenten die Konzentration war sehr hoch. Der Grund dafür war, besser belegen die Stärke unseres Ansatzes, als ob in der höchsten Konzentration der Bakterien wurde noch nicht von den Antibiotika ohne Beleuchtung betroffen und wurde mit der Beleuchtung zerstört, wird es offensichtlich für niedrigere Konzentrationen vorkommen.
Eine der Begründungen für die Auswahl der Beleuchtungswellenlänge war es, eine Wellenlänge zu wählen, für die das Bakteriuma und die Antibiotika sind transparent. Dies ist in Fig. 4 gezeigt. Zusätzliche Motivation für die Verwendung der 532 nm Wellenlänge Laser war aufgrund seiner Verfügbarkeit in unserem Labor und aufgrund der Tatsache, dass es uns auch erlaubt, höhere Lichtleistung (im Vergleich zu regulären weiße Lichtquelle mit spektralen Filtern) sowie Tuning-Fähigkeit für das erhalten Leistung und für das zeitliche Verhalten der Beleuchtung.
Abbildung 1. . Bakterien Beleuchtung Aufbau der Laser entweder CW Nd: YAG-Laser oder gütegeschalteten Nd: YAG-Laser. Auf der linken Seite kann man sehen, das Bild des experimentellen Aufbaus, in dem der Laser zwischen zwei Rohren, einem mit Antibiotika und eine ohne geteilt ist, um beide in identischen Bedingungen zu beleuchten. Beide Rohre sind Stellung ed auf einem Rührer. Schematische Darstellung der Versuchsanordnung ist in dem rechten Teil der Figur zu sehen.
2. (A). Wirkung von CW-Laser und Gentamycin auf P. aeruginosa. Die Proben wurden mit einem CW-Laserlicht (Leistung von 100 mW) mit und ohne Gentamycin (50 ug / ml) beleuchtet. Der Durchschnitt von 3 Experimenten dargestellt. (B). Wirkung der Q-Switch-Laser und Gentamycin auf P. aeruginosa. Die Proben wurden mit Q-switched Laser Licht (1,65 MW) mit und ohne Gentamycin (50 ug / ml) auf P. beleuchtet aeruginosa Lebensfähigkeit. Der Durchschnitt von 3 Experimenten dargestellt.
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Abbildung 3. Der vorgeschlagene Katheter basierende Vorrichtung zur biomedizinischen Behandlung gegen P. aeruginosa. Die Punkte in der Figur stellen Lichtstreuung Punkten wodurch das Licht zu sein, in das behandelte Gewebe diffundiert.
Abbildung 4 Das Absorptionsspektrum (in au) um Wellenlänge von 532 nm für:. (A). Die Bakterien, (b). Die Gentamycin. Klicke hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
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Discussion
Lichttherapie ist ein Gebiet der modernen multidisziplinären Forschung in den letzten Jahren Schwellenländern als vielversprechender Ansatz für die Behandlung zahlreicher Krankheiten. In diesem Zusammenhang ist die Verwendung von Licht im sichtbaren Bereich ist eingehend untersucht worden. Zum Beispiel wurde gefunden, dass infizierte Wunden effektiver, indem sie sie intensive sichtbare Licht entkeimt geheilt werden. Der Wirkmechanismus für diesen Ansatz wurde nachgewiesen, dass durch die Induktion von Licht-induzierte Sauerstoffradikale (ROS), die die Bakterien töten 11 sein.
Frühere Studien haben 6 viel höhere Mengen an ROS in Bakterien mit blauem Licht als die von Rot und nahes Infrarot-Licht induzierte beleuchtet demonstriert. Dies erklärt, warum die meisten Beweise in der Literatur konzentriert sich auf die bakterizide Wirkung von blauem Licht.
Ein weiteres aktuelles Beispiel für den Einsatz von Laserlicht zu resistenten Bakterien zu bekämpfen wurde von Kresp nachgewieseni et al. 12. In dieser Studie Laser erzeugten Stoßwellen-Technologie wurde verwendet, um Biofilme zu beseitigen. Durch die Verwendung eines Miniatur-Q-switched Nd: YAG-Laser und dünnen Fasern, spezielle Sonden erzeugte Plasma Formation, die Schockwelle Wirkung erzeugt. Die Autoren zeigten, dass dieses Verfahren in der Lage, effektiv zu stören P. war aeruginosa Biofilmen in vitro.
Der Ansatz, den wir in dieser Studie präsentiert haben war etwas anders, als wir 13, um die Wirksamkeit von nicht-Photosensibilisator antimikrobielle Mittel erhöhen mit Laserlicht versucht. Unsere Ergebnisse zeigen, dass durch die Kombination von Antibiotika-Behandlung mit Licht, das antimikrobielle Aktivität erheblich erhöht werden kann.
In der Tat aus einer völlig Phänotyp, in das Antibiotikum alleine beobachtet wurde das Bakterium empfindlich in Gegenwart des Antibiotikums und Lichtbehandlung. Der Wirkungsmechanismus dieses Effekts ist nicht klar und wird weiter investigat erfordernion. Doch in der Elektronen-paramagnetischen-Resonanz (EPR)-Messungen, die wir durchgeführt haben, um zu prüfen, ob ROS während der Behandlung erzeugt werden, wurde kein signifikanter Unterschied zwischen den Behandlungen 13 erhalten. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Wirkung der kombinierten Behandlung nicht um ROS-Produktion und verschiedene Mechanismen in Betracht gezogen werden. Es kann die Hypothese aufgestellt, dass die Licht-Behandlung die Durchlässigkeit der Membran verändert und schließlich ermöglicht die Antibiotika in den Bakterien Zelle brachte seine Tötung eindringen.
Obwohl der Mechanismus der Operation nicht vollständig erforscht, markieren Sie unser Ansatz das Potenzial der kombinierten Therapie von Licht mit kommerziellen Antibiotikum, das verworfen kann durch Antibiotikaresistenzen haben, während durch die Anwendung dieser Kombination können nun effektiv in Kliniken verwendet werden.
Offensichtlich, da in der Handschrift wird, ist der Beleuchtung von mehreren Stunden benötigt, um en Hance die Wirksamkeit der Antibiotika. Dies ist in der Tat ein Nachteil des vorgeschlagenen Ansatzes. Die Realisierung einer solchen Beleuchtung kann beispielsweise durch die Installation der Beleuchtungsquelle innerhalb Katheter (nach Fig. 3 vorgeschlagen) erhalten werden. Zusätzlich zu, dass, wenn die Wunde externen spezielle Banding als Putz mit Beleuchtungsquelle kann oben auf die Wunde gelegt und beleuchten es für mehrere Stunden, zB während der Patient in der Nacht schläft. Wenn die Infektion internen und der Patient im Krankenhaus und er / sie mit Infusionsbeutel angeschlossen mehrere Stunden für einige Organe eine Beleuchtung Kanal, wie ein Endoskop oder einem speziellen Faser des Organs angefahren werden und ständig leuchtet es (mit angewendet Antibiotika), während der Patient im Krankenhaus (genau wie die Infusionsbeutel an den Patienten über mehrere Stunden) verbunden ist. Wir stimmen, dass der Ansatz ist nicht gut für die Behandlung von in der Regel infiziert Organe.
nt "> Beachten Sie, dass in diesem Manuskript wir den Vorteil der vorgeschlagenen Technik für schnelle und praktische Anwendung zeigen aber um dies zu erreichen, andere Studien sind notwendig, wie in vivo-Experimente. Die Toxizität an Fibroblasten oder Epithelzellen wird nützlich sein, sowie da die Studien, die den Mechanismus der vorgeschlagenen Therapie in Bakterienzellen demonstrieren erforderlich sind. Darüber hinaus in diesem Papier haben wir die Hypothese auf, dass das Licht induzierten Veränderungen der bakteriellen Membran, die sie durchlässiger für das Antibiotikum gemacht. Offensichtlich Dinge anders sein wird in ein . klinischen Umfeld, wo bakterielle Infektionen sind durch Biofilme Dann gibt es zwei große Probleme:. Biofilm Bakterien widerstandsfähiger gegenüber ihren Pendants Plankton und Penetration von Antibiotika in der Biofilmmasse begrenzt sein wird daher die Erforschung der Wirkung von Licht und Gentamycin auf a P. aeruginosa Biofilm-Modell ist das Ziel unserer zukünftigen Studie.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lauria Broth | Difco | 241420 | |
| Gentamycin | Sigma | G1914 | |
| Bacto Agar | Difco | 231710 |
References
- Feuerstein, O., Persman, N., Weiss, E. I. Phototoxic Effect of Visible Light on Porphyromonas gingivalis and Fusobacterium nucleatum: An In Vitro Study. Photochemistry and Photobiology. 80, 412-415 (2004).
- Enwemeka, C. S., Williams, D., Enwemeka, S. K., Hollosi, S., Yens, D. Blue 470-nm light kills methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in vitro. Photomed. Laser Surg. 27, 221-226 (2009).
- Guffey, J. S., Wilborn, J. In vitro bactericidal effects of 405-nm and 470-nm. Photomed. Laser Surg. 24, 684-688 (2006).
- Lipovsky, A., Nitzan, Y., Friedman, H., Lubart, R. Sensitivity of Staphylococcus aureus strains to broadband visible light. Photochem. Photobiol. 85, 255-260 (2008).
- Lipovsky, A., Nitzan, Y., Lubart, R. A possible Mechanism for visible light induced wound healing. Lasers in Surgery and Medicine. 40, 509-514 (2008).
- Lipovsky, A., Nitzan, Y., Gedanken, A., Lubart, R. Visible light-induced killing of bacteria as a function of wavelength: Implication for wound healing. Lasers in Surgery and Medicine. 42, 467-472 (2010).
- Feuerstein, O., Ginsburg, I., Dayan, E., Veler, D., Weiss, E. Mechanism of Visible Light Phototoxicity on Porphyromonas gingiwalis and Fusobacferium nucleaturn. Photochemistry and Photobiology. 81, 1186-1189 (2005).
- Nussbaum, E. L., Lilge, L., Mazzulli, T. Effects of 630-, 660-, 810-, and 905-nm laser irradiation delivering radiant exposure of 1-50 J/cm2 on three species of bacteria in vitro. J. Clin. Laser Med. Surg. 20, 325-333 (2002).
- Dadras, S., Mohajerani, E., Eftekhar, F., Hosseini, M. Different Photoresponses of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa to 514, 532, and 633 nm Low Level Lasers In Vitro. Current Microbiology. 53, 282-286 (2006).
- Stover, C. K., Pham, X. Q., Erwin, A. L. Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen. Nature. 406, 952-964 (2000).
- Hamblin, M. R., Demidova, T. N. Mechanisms of low level light therapy. Proc. SPIE. 6140, 1-12 (2006).
- Krespi, Y. P., Stoodley, P., Hall-Stoodley, L. Laser disruption of biofilm. Laryngoscope. 118, 1168-1173 (2008).
- Reznick, Y., Banin, E., Lipovsky, A., Lubart, R., Zalevsky, Z. Direct laser light enhancement of susceptibility of bacteria to gentamycin antibiotic. Opt. Commun. 284, 5501-5507 (2011).
