Summary
Mostriamo che un dispositivo biomedicale sviluppato comporta il trattamento laser basato visibile continua o pulsata che è combinato con il trattamento antibiotico (gentamicina), determina una statisticamente significativo effetto sinergico che porta a una riduzione della vitalità
Abstract
Recentemente ci sono state diverse pubblicazioni sul effetto battericida della luce visibile, la maggior parte di loro sostenendo che parte blu dello spettro (400 nm-500 nm) è responsabile per l'uccisione di vari agenti patogeni 1-5. L'effetto fototossica di luce blu è stato suggerito di essere il risultato di specie reattive dell'ossigeno luce-indotti (ROS) di formazione per fotosensibilizzanti batteriche endogene che per lo più assorbono la luce nella regione blu 4,6,7. Ci sono anche segnalazioni di effetti biocidi del rosso e del vicino infrarosso 8 così come la luce verde 9.
Nel presente studio, abbiamo sviluppato un metodo che ci ha permesso di caratterizzare l'effetto di verde ad alta potenza (lunghezza d'onda di 532 nm) Q-switched luce continua (CW) e ad impulsi (QS) su Pseudomonas aeruginosa. Con questo metodo abbiamo anche studiato l'effetto di luce verde in combinazione con il trattamento antibiotico (gentamicina) sulla vitalità dei batteri. P. aeruginosa è acCOMUNI noscomial patogeno opportunista che causa varie malattie. Il ceppo è abbastanza resistente a diversi antibiotici e contiene molti predetto AcrB / Mex-tipo RND multidrug sistemi di efflusso 10.
Il metodo utilizzato fase stazionaria batteri Gram-negativi a vita libera (P. aeruginosa ceppo PAO1), coltivate in Luria Broth (LB) medio esposto a Q-switched e / o CW laser con e senza l'aggiunta del gentamicina antibiotico. La vitalità cellulare è stata determinata in punti temporali diversi. I risultati ottenuti hanno mostrato che il trattamento laser da solo non ha ridotto la vitalità cellulare rispetto al controllo non trattato e che il trattamento gentamicina sola solo portato a una riduzione 0,5 log nella conta vitale per P. aeruginosa. Il laser combinato e trattamento gentamicina, tuttavia, hanno comportato un effetto sinergico e la vitalità di P. aeruginosa è stato ridotto di 8 log di.
Il metodo proposto può essere ulteriormente attuaretato attraverso lo sviluppo di catetere come dispositivo in grado di iniettare una soluzione di antibiotico nell'organo infetto mentre simultaneamente illuminando la zona con luce.
Protocol
1. Coltura batterica
- P. Gram-negativi aeruginosa ceppo PAO1 sono state coltivate in Luria Broth (LB) a 37 ° C per 18 hr.
- La coltura di cellule è stato quindi centrifugato a 7500 rpm (giri al minuto) per 5 minuti e il surnatante è stato rimosso.
- I batteri sono stati risospesi in 10% LB e ri-crescere per un altro 2 ore per permettere alla cultura di rientrare fase stazionaria.
- La sospensione batterica è stata poi divisa in due gruppi: nel primo gruppo (2 tubi) sono stati aggiunti nessun antibiotico, nel secondo gruppo abbiamo aggiunto l'antibiotico gentamicina (50 mcg / ml).
2. Determinazione delle unità formanti colonie (CFU)
- Per determinare la vitalità cellulare 20 campioni microlitri sono stati prelevati da l'esperimento ogni 2 ore circa entro il termine di 24 ore. Diluizioni seriali dei campioni sono state fatte e placcato su piastre di LB agar ed incubata per una notte a 37 ° C.
- Per ciascun trattamento, i CFU per ogni piattaformae stata determinata e stato effettuato un confronto tra i periodi di tempo e vari trattamenti. La riduzione login CFU è stato calcolato come descritto in Eq. (1):
Entra riduzione = Logu-logC [CFU / ml]
Dove U è il valore delle unità formanti colonie ad ogni tempo; CFU è l'unità formanti colonie mentre le unità di CFU / ml pari a:
CFU / ml = (numero di colonie x fattore di diluizione) / (volume inoculato)
E C è la CFU individuata nel campione controllo in fase di avviamento. U notare che designa il formanti colonia Fattore all'istante di misura. - Il fattore di diluizione è il numero di diluizioni mentre in ciascuna di esse la concentrazione dei batteri è stata ridotta di un fattore 10. Il volume inoculato era sempre 200 microlitri ed è relativo alla dimensione della nostra provetta.
Quindi per riassumere il punto di vista di concentrazione, la gentamicina antibiotico era a concentrazione di 50 ug / ml. Per quanto riguarda i batteri, fino alla fine delil processo che abbiamo avuto complessivamente 8 diluizioni. Ogni diluizione era di un fattore 10 ed è stato fatto in tubi da 200 microlitri. Il punto di partenza era di 20 pl di campioni aggiunti nel tubo 200 microlitri (e quindi la concentrazione iniziale era 20/200C 0 = 0.1C0 con C 0 è la concentrazione iniziale in 20 pl di campioni) e la concentrazione finale è stato ridotto di 8 ordini di grandezza a causa delle diluizioni 8.
3. Illuminazione
- CW laser Nd: YAG (lunghezza d'onda di 532 nm e potenza ottica media di 200 mW) è stata suddivisa in due percorsi ottici con ottica 50% / 50% divisore di fascio. Il diametro del raggio era di circa 10 mm. La durata di esposizione era di 24 ore.
- Q-switched pulsato Nd: YAG laser (lunghezza d'onda di 532 nm, potenza media di 300 mW e potenza ottica massima di 2,5 MW) è stato diviso in due percorsi ottici utilizzando 50% / 50% divisore di fascio. Il diametro dello spot è di 6 mm. La larghezza degli impulsi del laser Q-switched era 6 nsec e la frequenza di ripetizione era 15Hz. Glidensità di potenza media era di 106 mW / cm 2 e la densità di potenza di picco era 8,83 kW / mm 2. La durata di esposizione era di 24 ore.
Si noti che la sospensione batterica agitata durante l'irraggiamento e fu mantenuta in condizioni di coltura appropriati per una crescita batterica (in tutte le provette c'era Luria Broth mezzo per permettere ai batteri di crescere).
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Representative Results
La configurazione basata laser viene presentata schematicamente nella figura 1. La prima condizione sperimentale utilizzato un CW laser Nd: YAG avente lunghezza d'onda di 532 nm (la seconda armonica della Nd: YAG) e della potenza ottica media di 200 mW. Questo fascio è stato diviso in due percorsi ottici utilizzando ottica 50% / 50% divisore di fascio tale che ciascun fascio scissione aveva potenza di 100 mW. Il diametro del raggio era di circa 10 mm e quindi la densità di potenza era di circa 100 mW / cm 2. La durata di esposizione era di 24 ore. Sebbene la potenza di illuminazione è relativamente elevato, non è sufficiente a causare il riscaldamento del campione.
La seconda condizione sperimentale utilizzato un ND Q-switched pulsato: YAG con lunghezza d'onda di 532 nm (seconda armonica) e diametro del punto di 6 mm. La potenza media è stata di 300 MW e potenza di picco ottico di 2,5 MW. La larghezza degli impulsi del laser Q-switched era 6 nsec e la frequenza di ripetizione era 15Hz. Questo fascio è stato inoltre diviso in due percorsi ottici usando50% / 50% divisore di fascio. La densità di potenza media era di circa 100 mW / cm 2 e la densità di potenza di picco era di 8,83 kW / mm 2. Questa densità di potenza di picco è equivalente all'energia fluidità di 88,3 μJ / mm 2 per impulso come ogni impulso era di 10 nsec lunga nel dominio del tempo. La durata di esposizione era di 24 ore. Entrambi gli esperimenti sono stati condotti in condizioni di crescita simili con l'esposizione non-luce (cioè con e senza gentamicina) che fungeva da controllo.
Nelle figure 2 (a) e 2 (b) l'effetto ottenuto grazie alla illuminazione dei campioni con luce laser CW e con Q-switched laser rispettivamente con e senza antibiotico su P. aeruginosa è presentato.
Nei campioni che non sono stati esposti alla luce (cioè il controllo) c'era alcuna riduzione della vitalità cellulare con o senza trattamento gentamicina. Questo risultato suggerisce che i batteri sono resistenti al trattamento gentamicina, mimandola situazione spesso incontrate nella clinica.
La luce laser da solo, inoltre, non ha indotto alcuna uccisione sia. Tuttavia, la combinazione di luce laser e gentamicina ridotto batteri redditività di diversi ordini di grandezza. L'effetto più importante è stata misurata dopo 24 ore in cui la combinazione di CW o Q-switched laser riduce la vitalità di 8 ordini di grandezza rispetto alle misure ottenute nel gruppo di controllo (antibiotico solo o sola luce).
Un risultato importante che può suggerire una soluzione di trattamento per questo tipo di batteri resistenti agli antibiotici. Il fatto che sono necessarie diverse ore per ottenere uccisione efficace dei batteri non riduce il potenziale clinico di questo approccio in quanto il trattamento proposto può essere incorporata in cateteri e altri dispositivi utilizzati in ospedale. Per esempio in figura 3 viene presentato un esempio di un catetere progettato in cui in aggiuntazione al canale di iniezione del liquido esistono pluralità di fori per consentire a diffondere simultaneamente illuminazione adeguata nell'organo infetto.
Il numero di campioni utilizzati per le statistiche è stato di 6 (c'era uno o due casi di alcuni dei tubi che sono stati accidentalmente contaminati e poi sono stati portati fuori delle statistiche). Il valore di p era inferiore 0.05.
Si noti che non ci ripetiamo i nostri esperimenti per i diversi livelli di concentrazione degli antibiotici. In tutti i nostri esperimenti concentrazione era molto alto. La ragione di ciò era di dimostrare meglio la forza del nostro approccio, come se nella più alta concentrazione dei batteri non era ancora influenzato dagli antibiotici senza illuminazione ed è stato distrutto con l'illuminazione, sarà ovviamente accadere per concentrazioni più basse.
Una delle motivazioni per la scelta della lunghezza d'onda di illuminazione è stato quello di scegliere una lunghezza d'onda per il quale il batteriologichea e gli antibiotici sono trasparenti. Questo è dimostrato in figura 4. Motivazione aggiuntiva utilizzando il laser 532 nm era dovuta alla sua disponibilità nel nostro laboratorio e per il fatto che essa ha permesso inoltre di ottenere maggiore potenza di illuminazione (rispetto al normale sorgente di luce bianca con filtri spettrali) e possibilità di regolazione per l' alimentazione e per il comportamento temporale della illuminazione.
Figura 1. . Batteri installazione illuminazione Il laser era o CW laser Nd: YAG Q-switched o pulsata laser Nd: YAG. Sulla sinistra si può vedere l'immagine della configurazione sperimentale in cui il laser è diviso tra due tubi, uno con antibiotici ed una senza, per illuminare entrambi in condizioni identiche. Entrambi i tubi sono posizione ed un agitatore. Schizzo schematico dell'apparato sperimentale è visto nella parte destra della figura.
Figura 2. (A). Effetto della CW-laser e gentamicina su P. aeruginosa. Campioni sono stati illuminati con una luce laser CW (potenza di 100 mW) con e senza gentamicina (50 mcg / ml). La media di tre esperimenti è presentato. (B). Effetto del laser Q-Switched e gentamicina su P. aeruginosa. I campioni sono stati illuminati con Q-switched laser luce (1,65 MW) con e senza gentamicina (50 mg / ml) su P. aeruginosa vitalità. La media di tre esperimenti è presentato.
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Figura 3. Il dispositivo basato catetere proposto per il trattamento biomedico contro P. aeruginosa. I punti della figura rappresentano punti di dispersione della luce causando la luce sia diffusa nel tessuto trattato.
Figura 4 Lo spettro di assorbimento (in au) intorno lunghezza d'onda di 532 nm per:. (A). I batteri, (b). La gentamicina. Clicca qui per ingrandire la figura .
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Discussion
La fototerapia è stata un campo di ricerca multidisciplinare avanzata negli ultimi anni emergono come un approccio promettente per il trattamento di numerose malattie. In questo contesto l'uso della luce nella gamma visibile è stata ampiamente studiata. Per esempio, si è scoperto che le ferite infette possono essere guariti più efficacemente esponendoli a luce intensa per scopi di sterilizzazione. Il meccanismo di azione di questo approccio è stato dimostrato di essere attraverso l'induzione di radicali dell'ossigeno indotti dalla luce (ROS) che uccidono i batteri 11.
Studi precedenti hanno dimostrato 6 quantità molto più elevate di ROS nei batteri illuminato con luce blu di quelli indotti dalla luce infrarossa rossa e vicino. Questo spiega perché la maggior evidenza nella letteratura concentra sull'effetto battericida di luce blu.
Un altro recente esempio per l'uso di luce laser per combattere batteri resistenti è stato dimostrato da KrespI et al. 12. In questo studio laser generato tecnologia shockwave è stata utilizzata per sradicare biofilm. Utilizzando una miniatura Q-switched Nd: YAG e fibre sottili, sonde speciali generati formazione di plasma che ha prodotto effetto shockwave. Gli autori hanno dimostrato che questo metodo è stato in grado di distruggere efficacemente P. biofilm aeruginosa in vitro.
L'approccio che abbiamo presentato in questo studio è stato un po 'diverso 13 come abbiamo cercato di aumentare l'efficacia della non-fotosensibilizzante agente antimicrobico utilizzando la luce laser. I nostri risultati suggeriscono che combinando trattamento antibiotico con illuminazione, l'attività antimicrobica può essere aumentata drammaticamente.
In effetti, da un fenotipo completamente resistente, osservata nei soli antibiotico i batteri sono diventati sensibili alla presenza di trattamento antibiotico e di luce. Il meccanismo di azione di questo effetto non è chiara e richiederà ulteriore investigatione. Tuttavia, nella risonanza elettrone-paramagnetici (EPR) misurazioni che abbiamo eseguito per esaminare se ROS sono generati durante il trattamento, nessuna differenza significativa tra i diversi trattamenti è stato ottenuto 13. Questi risultati suggeriscono che l'effetto del trattamento combinato non comprendono la produzione di ROS e meccanismi diversi devono essere considerati. Si può ipotizzare che il trattamento luce altera la permeabilità della membrana ed eventualmente gli antibiotici permette di penetrare nella cellula batterica cedendo sua uccisione.
Sebbene il meccanismo di funzionamento non è completamente esplorata, il nostro approccio evidenziare il potenziale della terapia combinata di luce con antibiotico commerciale che può essere stato scartato a causa della resistenza antimicrobica mentre applicando questa combinazione può ora essere riutilizzato efficacemente in cliniche.
Ovviamente, come sottolineato nel manoscritto, illuminazione di diverse ore è necessaria al fine di en hance l'efficacia degli antibiotici. Questo è davvero uno svantaggio dell'approccio proposto. La realizzazione di un tale illuminazione può essere ottenuto ad esempio installando la sorgente di illuminazione interna cateteri (come proposto dalla Figura 3). In aggiunta a ciò, se la ferita è esterno bendaggio speciale come intonaco con sorgente di illuminazione può essere messo in cima alla ferita e illuminarlo per diverse ore per esempio mentre il paziente sta dormendo alla notte. Se l'infezione è interna e il paziente è ospedalizzato e lui / lei è collegato a sacca di infusione per diverse ore, per alcuni organi un canale di illuminazione come un endoscopio o una fibra speciale può essere accostata al organo e illuminano costantemente (con l' applicato un trattamento antibiotico) mentre il paziente è ospedalizzato (esattamente come la sacca per infusione è collegato al paziente per molte ore). Siamo pienamente d'accordo che l'approccio non è buono per il trattamento di organi generalmente infettato.
nt "> Si noti che in questo manoscritto vi mostriamo il vantaggio della tecnica proposta per l'applicazione veloce e pratico, ma al fine di raggiungere questo obiettivo sono necessari altri studi, come esperimenti in vivo. lo studio di tossicità sui fibroblasti o cellule epiteliali sarà utile anche come sono necessari gli studi che dimostreranno il meccanismo della terapia proposta in cellule batteriche. Inoltre in questo lavoro abbiamo ipotizzato che i cambiamenti indotti luce della membrana batterica che hanno reso più permeabile alla antibiotico. Ovviamente le cose saranno diverse in un . contesto clinico in cui le infezioni batteriche sono dovute a biofilm Poi ci sono due problemi principali:. batteri biofilm sarà più resistente rispetto ai loro omologhi planctonici e la penetrazione di antimicrobici nella massa biofilm sarà limitato Pertanto, esplorando gli effetti di luce e gentamicina su un modello di biofilm da P. aeruginosa è lo scopo del nostro studio futuro.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lauria Broth | Difco | 241420 | |
| Gentamycin | Sigma | G1914 | |
| Bacto Agar | Difco | 231710 |
References
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