Summary
我々は、抗生物質治療（ゲンタマイシン）と組み合わされて、連続またはパルス可視レーザーベースの治療を含むその発達生物医学装置の生存率の減少につながる統計的に有意な相乗効果で結果を表示する
Abstract
最近では、可視光の殺菌効果に関するいくつかの出版物、それらのほとんどは、スペクトルのその青の部分を主張があった（400 NM-500 nm）の様々な病原体1-5を殺すために責任があります。青色光の光毒性効果は、光誘起反応性酸素種（ROS）主に青色領域4,6,7の光を吸収する内因性光感受性物質、細菌による形成の結果であることが示唆された。赤と近赤外8と同様に緑色の光9の殺菌効果の報告もあります。
本研究では、我々は我々が緑膿菌での高出力緑色（波長532nm）の連続（CW）とパルスQスイッチ（QS）光の影響を特徴づけるために許可された方法を開発した。この方法を用いて、我々はまた、細菌の生存に抗生物質治療（ゲンタマイシン）と組み合わせて緑色の光の効果を検討した。P.緑膿菌は、ACですommon noscomial日和見病原体は、様々な疾患を引き起こす。株は、様々な抗生物質に対してかなり耐性があり、多くの予測AcrB /メックス型RND排出システム10を多剤が含まれています。
この方法は、抗生物質、ゲンタマイシンを加えてとせずにQスイッチおよび/ またはCWレーザに露出ルリアブロス（LB）培地中で増殖させ、（ 緑膿菌株 PAO1）自由生活固定相グラム陰性菌を利用した。細胞生存率は、異なる時点で測定した。得られた結果は、それだけでレーザー治療が唯一のPの生菌数は0.5 log減少をもたらした未処理の制御とそれだけでゲンタマイシン治療に比べて細胞の生存率を減少させなかった示した緑膿菌 。合成レーザおよびゲンタマイシン処理は、しかしながら、P.の相乗効果及び生存率をもたらし緑膿菌は、8ログの減少した。
提案手法では、さらに実装することができます同時に光で面積を照射しながら感染臓器に抗生物質溶液を注入することができる装置のようなカテーテルの開発を介しmented。
Protocol
1。細菌培養物
- グラム陰性P.緑膿菌株PAO1は、18時間37℃でルリアブロス（LB）中で増殖させた。
- 細胞の培養物を5分間、7,500 rpmで（毎分ラウンド）で遠心分離し、上清を除去した。
- 細菌を、10％LBに再懸濁し、培養が定常期を再入力することを可能にする別の2時間のために再成長させた。
- 細菌懸濁液は、2つのグループに分けた：最初のグループ（2本）のない抗生物質我々はゲンタマイシン抗生物質（50μgの/ ml）を添加番目のグループに加えた。
2。コロニー形成単位の判定（CFU）
- 細胞生存率を決定するために、20μlのサンプルを、24時間の時間枠内でおよそ2時間の実験から採取した。サンプルの連続希釈が行われ、めっきさLB寒天プレート上、37℃で一晩インキュベートした。
- プラットフォームごとのCFUを各治療のため電子を測定し、比較する期間、様々な処置の間で行われた。式で説明したようCFUにおける対数減少を算出した。 （1）：
ログイン削減= LOGU-LogC [CFU / mlの]
ここで、Uは、各時点で単位値をコロニー形成であり、CFUに等しいCFU / mlの単位中にコロニー形成単位である。
CFU / mlの=（コロニーのx希釈係数の数）/（体積接種）
及びCは、開始時にコントロールサンプルにおいて見出さCFUである。 Uは、測定時点で要因を形成するコロニーを指定することに注意してください。 - それらのそれぞれの中の細菌の濃度が10分の1に減少しながら希釈係数は、希釈液の数である。接種量は常に200マイクロリットルであり、それは、我々の試験管のサイズに関係している。
したがって、ビューの濃度点を要約する、ゲンタマイシン抗生物質、50μgの/ mlの濃度であった。の終わりまで、細菌に関してプロセスは、我々は全体の8希釈していた。各希釈は10倍であり、それは、200μlにチューブ内で行われていた。出発点は、200μlのチューブに入れたサンプル20μlのだった（その結果、初期濃度は20/200C 0だったC 0と= 0.1C0サンプルを20μlの初期濃度である）、最終濃度が8減少した8希釈に起因桁違い。
3。照明
- CWのNd：YAGレーザー（532 nmおよび200 mWの平均光パワーの波長）の光、50％/ 50％ビームスプリッタを使用して二つの光路に分割された。ビーム径は約10mmであった。露出時間は24時間であった。
- QスイッチパルスNd：YAGレーザー（波長532nm、300mWの2.5 MWの光ピークパワーの平均電力）が、光の50％/ 50％ビームスプリッタを用いて2つの経路に分割された。スポット径は6であった。 Qスイッチレーザのパルス幅は6ナノ秒であり、繰り返しレートが15Hzのであった。ザ平均電力密度は106 MW / cm 2であった、ピークパワー密度は8.83キロワット/ mm 2であった。露出時間は24時間であった。
細菌懸濁液は、照射中に攪拌し、それが細菌の増殖（全てのチューブに細菌が成長できるようにするルリアのブロス培地があった）のために適切な培養条件下で維持されたことに注意してください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
レーザーベースのセットアップを図1に概略的に示されている。第1実験条件は、CWのNd利用：とは200mWの平均光パワー：YAGレーザは、波長532nmの（YAGのNdの第2高調波）を有する。このビームは、各分割ビームが100mWでのパワーを持っていたこのような光の50％/ 50％ビームスプリッタを使用して二つの光路に分割された。ビーム径は約10mmであったため、電力密度は、約100mWの/ cm 2であった。露出時間は24時間であった。光力が相対的に高いが、それは試料の加熱を引き起こすほど高くない。
QスイッチパルスNdを利用した第二の実験条件：YAGレーザは532nmの（第二高調波）と6mmのスポット径の波長を有する。平均電力は300 mWで、2.5 MWの光ピークパワーだった。 Qスイッチレーザのパルス幅は6ナノ秒であり、繰り返しレートが15Hzのであった。このビームは、光使って2つの経路に分割されました50％/ 50％ビームスプリッタ。平均電力密度は約100mW / cm 2とし、ピークパワー密度は8.83キロワット/ mm 2であった。各パルスは、時間領域で10ナノ秒長かったように、このピークパワー密度はパルスあたり88.3μJ/ mm 2での流暢エネルギーに相当します。露出時間は24時間であった。両方の実験は、対照として非露光（ゲンタマイシンの有無にかかわらず、すなわち ）と同様の成長条件で行った。
図2（a）及び図2（b）の効果がP上の抗生物質とせずに、それぞれCWレーザ光 とQスイッチレーザによる試料の照射により得られた緑膿菌が提示される。
（ すなわちコントロール）光に曝露されなかった試料中のゲンタマイシン治療の有無にかかわらず、細胞生存率の低下は認められなかった。この結果は、模倣、細菌がゲンタマイシン治療に耐性があることを示唆している状況がしばしば診療で遭遇。
単独のレーザー光もどちらか任意の殺害を誘発しなかった。しかし、レーザ光およびゲンタマイシンの組み合わせは、数桁の細菌の生存率を減少させた。最も顕著な効果は、CW又はQスイッチレーザのいずれかの組み合わせは、対照群（抗生物質単独または光単独）で得られた測定結果に比べて大きさの8桁生存率を低減した24時間後に測定した。
これは、抗生物質耐性菌、この種の治療の解決策を示唆する重要な結果である。提案された治療は、カテーテル、病院で使用される他のデバイスに組み込むことができるので、数時間、細菌の殺傷効果的に得るために必要とされるという事実は、この方法の臨床的可能性を減少させない。 図3のインスタンスのために私達はADDI内で設計されたカテーテルの例を提示同時に感染した器官内に適切な照明を拡散させることができる複数の孔が存在する液体噴射チャネルにる。
統計に使用されるサンプルの数は、（誤って汚染され、次いでそれらは統計から取り出したチューブの一部の1つまたは2つのケースがありました）6であった。 p値は 0.05以下であった。
我々は抗生物質の異なる濃度レベルのため我々の実験を繰り返していないことに注意してください。我々の実験の全てにおいて濃度が非常に高かった。理由は、より良いバクテリアがまだ照明なしで抗生物質からの影響を受けなかったと照明で破壊された最高濃度であれば、それは明らかに低い濃度のために起こるのだろうと我々のアプローチの強さを示すことでした。
照明波長を選択するための根拠の一つは、波長を選択することであったためbacteriと抗生物質は透明です。これは、 図4に示されている。 532nmの波長のレーザーを使用するための追加的な動機は、私たちの研究室での在庫状況により、それがより高い照明電力（スペクトルフィルタとの定期的な白色光源と比較して）と同様のチューニング機能を得るために、私たちも許可という事実によるものであった電源と照明の時間的挙動のために。
図1。 。細菌照明セットアップレーザーはどちらCW、WAS ND：YAGレーザーやQスイッチパルスNd：YAGレーザー。左のは、同一の条件でそれらの両方を照らすために、レーザーを2つの管、抗生物質と1とそれのないものとの間で分割されている実験の画像が表示される場合があります。両方のチューブが位置であるスターラーでED。実験装置の概略図は、図の右側の部分に見られる。
図2（a）に 。 P.でCW-レーザーとゲンタマイシンの影響緑膿菌 。サンプルはゲンタマイシンとないCWレーザ光（100 mWでのパワー）（50μgの/ ml）で照射した。 3回の実験の平均値が提示される。（b）に示す 。 緑膿菌にQスイッチレーザーとゲンタマイシンの影響。サンプルはPにゲンタマイシンとないQスイッチレーザー光（1.65 MW）（50μgの/ ml）で照射した緑膿菌の生存率。 3回の実験の平均値が提示される。
4370/4370fig3highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/4370/4370fig3.jpg "/>
図3。 P.に対する医学的治療のために提案されたカテーテルベースのデバイス緑膿菌 。図中のドットが光を処理した組織内に拡散させる光散乱点を表す。
図4波長532nm付近の吸収スペクトル（オー）であって、以下：（a）。細菌と、（b）。ゲンタマイシンは大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
光線療法は、治療多くの疾患のための有望なアプローチとして浮上し、近年では先進的な学際的研究分野となっています。この文脈において、可視領域の光の使用が広く研究されている。例えば、感染した創傷を殺菌のために、強い可視光にさらすことによって、より効果的に治癒することができることが見出された。このアプローチのための作用機構は、細菌を殺す11光誘起酸素ラジカルの誘発（ROS）を介してであることが証明された。
6以前の研究は、赤色および近赤外光によって誘導されるものよりも青色光を照射細菌においてROSはるかに高い金額を実証している。文学の中で最も証拠は青色光の殺菌効果に集中これはなぜ説明しています。
耐性菌と戦うために、レーザー光を使用するための別の最近の例はKrespにより証明された私ら 12。その研究のレーザで生成された衝撃波技術がバイオフィルムを根絶するために利用された。 YAGレーザや細い繊維、衝撃波効果を生じプラズマ形成を生成し、特別なプローブ：小型QスイッチNdを使用する。著者らは、この方法は効果的にP.を妨害することができたことを示したin vitroでの緑膿菌バイオフィルム。
我々は、レーザー光を用いた非光増感剤抗菌剤の効力を増加させる試みたように我々はこの研究で示されているアプローチは、13多少異なっていた。我々の結果は、照明との抗生物質治療を組み合わせることによって、抗菌活性を飛躍的に高めることができることを示唆している。
実際には、単独の抗生物質で観察された完全に耐性表現型から、細菌は抗生物質と光治療の存在下で敏感になった。この効果の作用機序は明らかではないが、さらなるinvestigatを必要とするイオン。しかし、我々は、ROSは、治療中に生成されるかどうかを調べるために実施したことを電子-常磁性共鳴（EPR）測定では、異なる治療の間に有意差が13を得られなかった。これらの結果は、組み合わせ処置の効果はROS産生を伴わないと異なる機構を考慮する必要があることを示唆している。なお、光処理は膜透過性を変更し、最終的に抗生物質がその殺害を得た細菌細胞に浸透することができるという仮説ができる。
操作のメカニズムは完全に探求されていませんが、我々のアプローチは、この組み合わせを適用することにより、今では診療所で効果的に再利用することができながら、抗菌薬耐性のために破棄されている可能性があり、商用抗生物質と光の併用療法の可能性を強調する。
原稿に記載されているように明らかに、数時間の照明が専用するために必要とされる抗生物質の有効性をハンス。これは確かに提案されたアプローチの欠点である。このような照明の実現はカテーテル（ 図3によって提案された）内部の照明源をインストールすることで、例えば得ることができる。傷が外部の場合に加えて、照明光源とプラスターとしてバンディング特別は、創傷の上に置くことができ、患者は夜寝ている間など 、いくつかの時間のためにそれを照らす。感染が内部にあり、いくつかの臓器のために、数時間のために、患者が入院されており、彼は/彼女は輸液バッグに接続されている場合は、内視鏡や特殊繊維などの照明チャネルはオルガンに近づいて、常に（とそれを照らすことができます患者（輸液バッグは、多くの時間のために患者に接続されているとおりに）入院している間）抗生物質治療を適用した。我々は完全にアプローチは、一般的に感染した臓器の治療のために良くないことに同意します。
NTは"この原稿に我々は、高速かつ実用的なアプリケーションのために、提案手法の優位性を示すことが、この他の研究は、このようなin vivo実験として必要である達成するためである。>注意線維芽細胞や上皮細胞上の毒性試験では、同様に有用であろう細菌の細胞内で提案された治療法のメカニズムを実証する研究が必要であるとして、本論文でまた私たちは、抗生物質には、より透過性に細菌膜の光誘起される変化が。明らかに物事がで異なるであろうという仮説を立てている。細菌感染がバイオフィルムに起因している臨床設定では、2つの大きな問題があります。バイオフィルム細菌が制限されるバイオフィルムの質量の抗菌剤のそれらのプランクトンの対応と浸透に比べてより耐性になるので、上の光とゲンタマイシンの影響を探る緑膿菌のバイオフィルムモデルでは、我々の今後の研究の目的である。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
利害の衝突は宣言されていない。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lauria Broth | Difco | 241420 | |
| Gentamycin | Sigma | G1914 | |
| Bacto Agar | Difco | 231710 |
References
- Feuerstein, O., Persman, N., Weiss, E. I. Phototoxic Effect of Visible Light on Porphyromonas gingivalis and Fusobacterium nucleatum: An In Vitro Study. Photochemistry and Photobiology. 80, 412-415 (2004).
- Enwemeka, C. S., Williams, D., Enwemeka, S. K., Hollosi, S., Yens, D. Blue 470-nm light kills methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in vitro. Photomed. Laser Surg. 27, 221-226 (2009).
- Guffey, J. S., Wilborn, J. In vitro bactericidal effects of 405-nm and 470-nm. Photomed. Laser Surg. 24, 684-688 (2006).
- Lipovsky, A., Nitzan, Y., Friedman, H., Lubart, R. Sensitivity of Staphylococcus aureus strains to broadband visible light. Photochem. Photobiol. 85, 255-260 (2008).
- Lipovsky, A., Nitzan, Y., Lubart, R. A possible Mechanism for visible light induced wound healing. Lasers in Surgery and Medicine. 40, 509-514 (2008).
- Lipovsky, A., Nitzan, Y., Gedanken, A., Lubart, R. Visible light-induced killing of bacteria as a function of wavelength: Implication for wound healing. Lasers in Surgery and Medicine. 42, 467-472 (2010).
- Feuerstein, O., Ginsburg, I., Dayan, E., Veler, D., Weiss, E. Mechanism of Visible Light Phototoxicity on Porphyromonas gingiwalis and Fusobacferium nucleaturn. Photochemistry and Photobiology. 81, 1186-1189 (2005).
- Nussbaum, E. L., Lilge, L., Mazzulli, T. Effects of 630-, 660-, 810-, and 905-nm laser irradiation delivering radiant exposure of 1-50 J/cm2 on three species of bacteria in vitro. J. Clin. Laser Med. Surg. 20, 325-333 (2002).
- Dadras, S., Mohajerani, E., Eftekhar, F., Hosseini, M. Different Photoresponses of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa to 514, 532, and 633 nm Low Level Lasers In Vitro. Current Microbiology. 53, 282-286 (2006).
- Stover, C. K., Pham, X. Q., Erwin, A. L. Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen. Nature. 406, 952-964 (2000).
- Hamblin, M. R., Demidova, T. N. Mechanisms of low level light therapy. Proc. SPIE. 6140, 1-12 (2006).
- Krespi, Y. P., Stoodley, P., Hall-Stoodley, L. Laser disruption of biofilm. Laryngoscope. 118, 1168-1173 (2008).
- Reznick, Y., Banin, E., Lipovsky, A., Lubart, R., Zalevsky, Z. Direct laser light enhancement of susceptibility of bacteria to gentamycin antibiotic. Opt. Commun. 284, 5501-5507 (2011).
