Summary
Mostra-se que um dispositivo biomédicas desenvolvida que envolve o tratamento a laser visível contínua ou pulsada que é combinado com o tratamento com antibióticos (gentamicina), resulta num efeito sinérgico significativo estatisticamente levando a uma redução da viabilidade da
Abstract
Recentemente houve várias publicações sobre o efeito bactericida da luz visível, a maioria deles alegando que parte azul do espectro (400 nm-500 nm) é responsável pela morte de vários patógenos 1-5. O efeito fototóxico de luz azul foi sugerida para ser uma sequência de espécies reactivas de oxigénio induzido pela luz (ROS) por formação bacterianas endógenas fotossensibilizadores que absorvem a luz na maior parte da região azul 4,6,7. Há também relatos de efeito biocida de vermelho e perto infra vermelho 8, bem como luz verde 9.
No presente estudo, foi desenvolvido um método que nos permitiu caracterizar o efeito da alta de energia verde (comprimento de onda de 532 nm) luz contínua (CW) e pulsou Q-switched (QS) em Pseudomonas aeruginosa. Usando este método, também foi estudado o efeito da luz verde combinado com o tratamento com antibióticos (gentamicina) sobre a viabilidade das bactérias. P aeruginosa é alternadaommon noscomial patógeno oportunista causando várias doenças. A tensão é bastante resistente a vários antibióticos e contém muitos previram tipo Mex AcrB / multidroga RND sistemas de efluxo 10.
O método utilizado fase estacionária bactérias livres-vivas gram-negativas (estirpe de P. aeruginosa PAO1), cultivada em Caldo de Luria (LB) exposto a Q comutado e / ou CW lasers com e sem a adição do antibiótico gentamicina. A viabilidade celular foi determinada em diferentes pontos no tempo. Os resultados obtidos mostraram que o tratamento com laser por si só, não reduziu a viabilidade das células em comparação com o controlo não tratado e que o tratamento com gentamicina sozinho resultou apenas em uma redução de 0,5 log na contagem viável de P. aeruginosa. O laser de tratamento combinado e gentamicina, no entanto, resultou num efeito sinérgico e a viabilidade de P. aeruginosa foi reduzido em 8 de log.
O método proposto pode ainda ser impletadas por meio do desenvolvimento de cateter como dispositivo capaz de injectar uma solução de antibiótico no órgão infectada simultaneamente iluminar a área com luz.
Protocol
1. Cultura bacteriana
- P. Gram-negativo aeruginosa PAO1 estirpe foram cultivadas em Caldo de Luria (LB) a 37 ° C durante 18 horas.
- A cultura de células foi então centrifugado a 7.500 rpm (rotações por minuto) durante 5 min e o sobrenadante foi removido.
- As bactérias foram ressuspensas em 10% de LB e re-cultivadas durante mais 2 horas para permitir que a cultura de reentrar fase estacionária.
- A suspensão de bactérias foi então dividida em dois grupos: no primeiro grupo (2 tubos) foram adicionados nenhum antibiótico, no segundo grupo a que adicionado o antibiótico gentamicina (50 ug / ml).
2. Determinação de unidades formadoras de colônias (UFC)
- Para determinar a viabilidade das células 20 ul amostras foram tomadas a partir do experimento de aproximadamente cada 2 horas dentro do período de tempo de 24 horas. Diluição em série das amostras foram feitas e semeadas em placas de agar LB e incubadas durante a noite a 37 ° C.
- Para cada tratamento, os UFCs por plate foi determinado e foi feita uma comparação entre os períodos de tempo e vários tratamentos. A redução log de CFU foi calculada como descrito na equação. (1):
Log redução = Logu-LogC [UFC / ml]
Quando L é o valor das unidades formadoras de colónias em cada ponto temporal; UFC é a unidade de formação de colónias, enquanto as unidades de UFC / ml igual a:
CFU / ml = (número de colónias factor de diluição x) / (volume do inoculado)
E C é o UFC encontradas na amostra de controlo no tempo de início. Note-se que U designa a formação de colónias fator de medição instantânea. - O factor de diluição é o número de diluições enquanto que em cada uma delas na concentração de bactérias foi reduzido por um factor de 10. O volume inoculado foi sempre de 200 micro litros e está relacionado com o tamanho do nosso tubo de ensaio.
Assim, para resumir o ponto de vista da concentração, o antibiótico gentamicina numa concentração foi de 50 ug / ml. Em relação às bactérias, até ao final doo processo tivemos total oito diluições. Cada diluição foi por um factor de 10 e foi realizado em tubos de 200 ul. O ponto de partida foi de 20 ul das amostras adicionados ao tubo 200 ul (e, portanto, a concentração inicial foi 20/200C 0 = 0.1C0 C com 0 sendo a concentração inicial em 20 ul das amostras) e a concentração final foi reduzido de 8 ordens de grandeza devido às oito diluições.
3. Iluminação
- CW laser Nd: YAG (comprimento de onda de 532 nm e potência óptica média de 200 mW) foi dividido em dois caminhos ópticos usando óptica 50% / 50% divisor de feixe. O diâmetro do feixe laser foi de cerca de 10 mm. O tempo de exposição foi de 24 horas.
- Q-switched pulsado Nd: YAG (comprimento de onda de 532 nm, potência média de 300 mW e pico de potência óptica de 2,5 MW) também foi dividido em dois caminhos usando óptica 50% / 50% divisor de feixe. O diâmetro do ponto era de 6 mm. A largura do pulso do laser Q-switched foi 6 nseg e a taxa de repetição foi de 15Hz. Odensidade de potência média foi de 106 mW / cm 2 ea densidade de potência de pico foi de 8,83 kW / mm 2. O tempo de exposição foi de 24 horas.
Note-se que a suspensão bacteriana foi agitada durante a irradiação e que foi mantido sob condições de cultura adequadas para o crescimento bacteriano (em todos os tubos não era Caldo Luria meio para permitir que as bactérias para crescer).
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Representative Results
A configuração da base de laser encontra-se esquematicamente apresentada na Figura 1. A primeira condição experimental utilizado CW um laser Nd: YAG tendo comprimento de onda de 532 nm (a segunda harmónica do Nd: YAG) e potência óptica média de 200 mW. Este feixe foi dividido em dois caminhos ópticos usando óptica 50% / 50% divisor de feixe de tal forma que cada raio dividido tinha potência de 100 mW. O diâmetro do feixe laser foi de cerca de 10 mm e, assim, a densidade de potência é de cerca de 100 mW / cm 2. O tempo de exposição foi de 24 horas. Embora a fonte de iluminação é relativamente elevado, não é suficientemente alta para causar o aquecimento da amostra.
A segunda condição experimental utilizou um Nd pulsado Q-switched: O laser de YAG com comprimento de onda de 532 nm (segundo harmônico) e diâmetro do ponto de 6 mm. A potência média foi de 300 mW e pico de potência óptica de 2,5 MW. A largura do pulso do laser Q-switched foi 6 nseg e a taxa de repetição foi de 15Hz. Este raio também foi dividido em dois caminhos usando óptica50% / 50% divisor de feixe. A densidade média de energia foi de cerca de 100 mW / cm 2 ea densidade de potência de pico foi de 8,83 kW / mm 2. Este pico de densidade de energia é equivalente à energia de fluência de 88,3 μJ / mm 2 por impulso como cada pulso foi de 10 nseg longa no domínio do tempo. O tempo de exposição foi de 24 horas. Ambas as experiências foram realizadas sob condições de crescimento semelhantes à exposição nenhuma luz (isto é, com e sem gentamicina), que serviu como controlo.
Nas Figuras 2 (a) e 2 (b) o efeito obtido devido à iluminação das amostras com luz laser CW e com laser Q-switched, respectivamente, com e sem antibiótico sobre P. aeruginosa é apresentado.
Nas amostras que não foram expostos à luz (ou seja, o controle) não houve redução da viabilidade celular, com ou sem tratamento de gentamicina. Este resultado sugere que as bactérias são resistentes ao tratamento de gentamicina, imitandoa situação frequentemente encontrados na prática clínica.
A luz laser sozinho também não induziu nenhum assassinato também. No entanto, a combinação de luz laser e gentamicina reduzida viabilidade bacteriana, em várias ordens de magnitude. O efeito mais proeminente foi medida após 24 horas em que a combinação de CW ou Q-switched laser reduziu a viabilidade em 8 ordens de grandeza em comparação com as medições obtidas no grupo de controlo (antibiótico sozinho ou leve isoladamente).
Este é um resultado importante, que pode sugerir uma solução de tratamento para este tipo de bactérias resistentes a antibióticos. O facto de que são necessárias várias horas para se obter matança eficaz das bactérias não reduz o potencial clínico desta abordagem uma vez que os tratamentos propostos podem ser incorporados em cateteres e outros dispositivos usados no hospital. Por exemplo, na Figura 3 apresenta-se um exemplo de um cateter concebido no qual, em adição para o canal de injecção de líquido, há pluralidade de furos que permitem a difusão simultaneamente iluminação apropriada no órgão infectado.
O número de amostras utilizadas para a estatística era de 6 (houve um ou dois casos de alguns dos tubos que foram acidentalmente contaminados e, em seguida, eles foram levados para fora das estatísticas). O valor de p foi inferior a 0,05.
Note-se que nós não repetir nossos experimentos para diferentes níveis de concentração dos antibióticos. Em todas as nossas experiências, a concentração foi muito elevada. A razão para isso foi a melhor demonstrar a força da nossa abordagem, como se na maior concentração da bactéria ainda não foi afetada a partir dos antibióticos sem iluminação e foi destruída com a iluminação, ele vai obviamente acontecer para concentrações mais baixas.
Um dos princípios para a escolha do comprimento de onda de iluminação foi de escolher um comprimento de onda para o qual o bactericidaum e os antibióticos são transparentes. Isto é demonstrado na Figura 4. Motivação adicional para utilizar o comprimento de onda do laser 532 nm, era devido à sua disponibilidade no nosso laboratório e devido ao facto de que nos permitiu também a obtenção de maior potência de iluminação (comparado a fonte de luz branca normal com filtros espectrais), bem como capacidade de sintonização para o potência e para o comportamento temporal da iluminação.
Figura 1. . Bactérias custos iluminação O laser era ou CW laser Nd: YAG ou Q-switched pulsado de Nd: YAG. À esquerda pode-se ver a imagem da configuração experimental, no qual o laser é dividida entre dois tubos, um com antibióticos e uma sem ela, a fim de iluminar ambos em condições idênticas. Ambos os tubos são posição ed num agitador. Esboço esquemático da montagem experimental é visto na parte direita da figura.
Figura 2. (A). Efeito da CW-laser e gentamicina em p aeruginosa. As amostras foram iluminadas com uma luz laser CW (potência de 100 mW), com e sem gentamicina (50 ug / ml). Apresenta-se a média de 3 experiências. (B). Efeito do laser Q-switched e gentamicina em P. aeruginosa. As amostras foram iluminadas com Q comutado luz laser (1,65 MW), com e sem gentamicina (50 ug / ml) em p viabilidade aeruginosa. Apresenta-se a média de 3 experiências.
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Figura 3. O dispositivo baseado em cateter proposto para o tratamento biomédico contra P. aeruginosa. Os pontos na figura representam pontos de espalhamento de luz a luz que causam a ser difundido no tecido tratado.
Figura 4 O espectro de absorção (em ua) em torno do comprimento de onda de 532 nm para:. (A). As bactérias, (b). A gentamicina. Clique aqui para ver a figura maior .
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Discussion
A fototerapia tem sido um campo de pesquisa multidisciplinar avançado nos últimos anos, surgindo como uma abordagem promissora para o tratamento de inúmeras doenças. Neste contexto, o uso de luz na gama do visível tem sido extensivamente estudada. Por exemplo, verificou-se que as feridas infectadas podem ser curadas de forma mais eficaz por expondo-os a luz intensa visível para fins de esterilização. O mecanismo de ação para esta abordagem foi provado ser através da indução de radicais de oxigênio induzido pela luz (ROS), que matam as bactérias 11.
Estudos anteriores demonstraram 6 quantidades muito mais elevadas de ROS em bactérias iluminados com luz azul do que as induzidas pela luz vermelha e infravermelha próxima. Isso explica por que a maioria das evidências na literatura concentra-se no efeito bactericida da luz azul.
Outro exemplo recente para o uso de luz laser para combater as bactérias resistentes foi demonstrada por Krespi et al. 12. Nesse estudo a laser tecnologia shockwave gerado foi utilizado para erradicar biofilmes. Usando um mini Q-switched Nd: YAG laser e fibras finas, sondas especiais gerados formação de plasma que produziu efeito shockwave. Os autores demonstraram que este método era capaz de interromper efectivamente P. biofilmes aeruginosa in vitro.
A abordagem que apresentamos neste estudo foi um pouco diferente 13 como tentamos aumentar a eficácia da não-fotossensibilizador agente antimicrobiano utilizando luz laser. Nossos resultados sugerem que o tratamento com antibióticos, combinando com a iluminação, a atividade antimicrobiana pode ser aumentado dramaticamente.
De facto, a partir de um fenótipo completamente resistentes, observada em que o antibiótico por si só as bactérias tornaram-se sensíveis na presença de tratamento com antibiótico e da luz. O mecanismo de ação deste efeito não é claro e vai precisar de mais investiíons. No entanto, nas ressonâncias (EPR) medições Electron-paramagnéticas que temos realizados para examinar se ROS são gerados durante o tratamento, não houve diferença significativa entre os diferentes tratamentos foi obtido 13. Estes resultados sugerem que o efeito do tratamento combinado não envolve a produção de ROS e mecanismos diferentes têm de ser considerados. Pode-se supor que o tratamento com luz altera a permeabilidade da membrana e, finalmente, permite que os antibióticos para penetrar na célula da bactéria produzindo a sua morte.
Embora o mecanismo de funcionamento não é totalmente explorado, a nossa abordagem destacar o potencial da terapia combinada da luz com antibiótico comercial, que pode ter sido descartado devido à resistência antimicrobiana enquanto aplicando esta combinação pode agora ser reutilizado de forma eficaz em clínicas.
Obviamente, como observado no manuscrito, é necessário iluminação de várias horas, a fim de en Hance a eficácia dos antibióticos. Esta é certamente uma desvantagem da abordagem proposta. A realização de um tal iluminação pode ser obtido por exemplo através da instalação da fonte de iluminação no interior de cateteres (tal como proposto pela Figura 3). Além disso, se a ferida for externa bandagem especial como fonte de iluminação com gesso pode ser colocada em cima da ferida e iluminar por várias horas, por exemplo, enquanto o paciente está a dormir durante a noite. Se a infecção é interna e o paciente é hospitalizada e ele / ela está ligado ao saco de infusão durante várias horas, por um canal de alguns órgãos de iluminação, tais como um endoscópio ou uma fibra especial pode ser aproximado ao órgão e constantemente iluminar (com a aplicado um tratamento antibiótico), enquanto o paciente está hospitalizado (exactamente como a bolsa de infusão é ligado ao paciente por várias horas). Concordamos plenamente que a abordagem não é bom para o tratamento de órgãos geralmente infectados.
nt "> Note que, neste artigo, procuramos mostrar a vantagem da técnica proposta para a aplicação rápida e prática, mas para atingir este outros estudos são necessários, tais como experimentos in vivo. Estudo de toxicidade em fibroblastos ou células epiteliais será útil também que sejam necessários os estudos que demonstram o mecanismo da terapia proposta em células bacterianas. Além disso neste documento, têm a hipótese de que as alterações induzidas de luz da membrana bacteriana que tornava mais permeável ao antibiótico. Obviamente, tudo será diferente numa . clínica onde as infecções bacterianas são devido a biofilmes Então há dois problemas principais:. bactérias biofilme será mais resistente em comparação com os seus homólogos planctônicas e penetração de agentes antimicrobianos na massa de biofilme serão limitadas, portanto, explorar os efeitos de luz e gentamicina em um modelo de biofilme por P. aeruginosa é o objetivo do nosso trabalho futuro.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lauria Broth | Difco | 241420 | |
| Gentamycin | Sigma | G1914 | |
| Bacto Agar | Difco | 231710 |
References
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