Summary
Kort visuel beskrivelse af den kirurgiske teknik og apparatet til levering af (gen og celle) terapier ind i rygmarven. Teknikken er påvist i dyret, men er helt forskydelig og i øjeblikket bliver brugt til anvendelse til mennesker.
Abstract
Dette er en kompakt visuel beskrivelse af en kombination af kirurgisk teknik og en indretning til levering af (gen og celle) terapier ind i rygmarven. Mens teknik viser sig i dyret, fremgangsmåden er FDA-godkendt, og i øjeblikket anvendes til stamcelletransplantation ind i rygmarven hos patienter med ALS. Mens FDA har anerkendt proof-of-principle oplysninger om den terapeutiske virkning i stærkt præget gnavermodeller er brugen af store dyr betragtes som kritisk til validering af kombinationen af en kirurgisk procedure, en enhed, og sikkerheden for en endelig behandling til human brug . Størrelsen, anatomi, og generel sårbarhed af rygsøjlen og rygmarven af svin indregnes til bedre model af det menneskelige. Desuden den kirurgiske proces med at eksponere og manipulering af rygmarven samt lukning af såret i grisen er næsten ikke skelnes fra den humane. Vi mener, at sunde gris model repræsenterer et kritiskcal første skridt i studiet af proceduremæssige sikkerhed.
Protocol
1. Animal Use
Procedurer demonstrerede heri er blevet godkendt af Emory University Institutional Animal Care og Use Committee (IACUC). Kvinde Göttingen minigrise vejer cirka 15-20 kg anvendes.
2. Anæstesi
Dyrene fastes omkring 12 timer forud for kirurgi. Animal sedation og narkosemiddel består af en cocktail af intramuskulær ketamin (35 mg / kg), acepromazin (1,1 mg / kg) og Atropin (0,04 mg / kg). Dyrene derefter intuberet og vedligeholdes på oxygen og 1-3% isofluran generel anæstesi. På dette tidspunkt er bagsiden og leder af hvert dyr barberes. Anæstesidybden overvåges af det veterinære personale. Fravær af interdigitale, hornhinde og øjenlågenes reflekser samt hjerte og respirationsfrekvens, pulsoximetri, direkte / indirekte blodtryk, End-tidal kuldioxid-målinger, og muskeltonus / respons på skadelige stimuli anvendes til at overvåge dybde af anæstesi.
3. Positionering
Dyrene er taget til operationsstuen og anbringes i en udsat position på en ramme custom designet til at efterligne patienter placering på en Jackson spinal kirurgisk bord. Rammen udnytter justerbare stropper, der er placeret under brystet og bækkenet af dyret, så maven til at hænge frit, og derfor minimerer tryk på maven og brystet og efterfølgende epidural venøs blødning (figur 1). Rammen tilvejebringer også ekstern immobilisering af rygsøjlen for proceduren 1.
Derudover er dyr anbringes på en opvarmet recirkulerende pude for at opretholde legemstemperatur, og en marginal ørevene kateteriseres til fluid administration og eventuelle nødvendige lægemiddelafgivelse under kirurgi. Endelig er det kirurgiske område prepped med alkohol og chlorhexadin eller Betadine-opløsning og kirurgiske klæder er placeret på det kirurgiske område.
le "> 4. laminektomiEt ca 10-15 cm skin incision udføres, og den paraspinal muskulatur dissekeres væk fra rygsøjlen bilateralt. Dernæst er en dorsal flere niveauer laminektomi udføres. Den tynde plade og torntappe af tre hvirvler overliggende C3-C5 eller L2-L4 segmenter fjernes med rongeurs og en kirurgisk bor.
5. Placering af Spinal Derrick
Vi kalder Spinal Derrick anordningen udformet til afgivelse af (gen og celle) terapier i rygmarven 2-5. Detaljeret diskussion om udformningen og udviklingen af denne enhed kan findes på Riley et al., 2011. 4
At fastgøre indretningen til patienten, er perkutane stillinger placeret ved 1 cm snit i huden over og under det primære indsnit og monteret på hinden over og under det primære indsnit.
Dernæst to integrerede retraktorer fastgjort til four perkutane stillinger over og under incisionssted at eksponere den del af rygsøjlen, der har undergået laminektomi.
6. Dural Opening
Ved hjælp af en Woodson dental værktøj og en 11 vinge, er en 2,5 cm snit gennem dura, udsætter rygmarven. Dura reflekteres bort fra pial lag ved anvendelse af 4-0 Nurolon sutur og fastgjort til den dybe paraspinal muskulatur.
Kirurgiske patties er placeret i den rostrale og caudale ender af åbningen. Disse giver en delvis barriere for cerebrospinalvæske flow og også give en sikker mål for kirurger at placere suckers uden at beskadige ledningen. Hos mennesker, under kirurgisk mikroskop forstørrelse er det pial overflade dissekeret på dette tidspunkt. På grund af tekniske begrænsninger, er denne procedure ikke nødvendig eller gennemførlig i dyr.
7. Spinal Cord injektioner og lateral forskydning af Spinal Derrick for yderligere injektions
Umiddelbart forud for injektioner, er en bolus af methylprednisolon (125 mg, IV) gives for at forhindre rygmarv hævelse.
På dette tidspunkt er platformen jernbanesystem fastgjort og sideskinnerne er tilpasses til den passende længde. Gondolen er top-fyldt på de to søjler, og Z-drevet er monteret på kardanled. Dernæst fyldte kanyle anbringes på mikrodrevet. Universalkoblingen anvendes på mikroinjektion platformen er de koronale og sagittale vinkler justeres for at sikre en bane vinkelret på overfladen af de spinale Injektioner følger placeringen af kanylen. Nålen er anbragt i overensstemmelse hermed medialt for den dorsale indgangszonen (DREZ). Den DREZ er identificeret under 3.5x kirurgisk lup forstørrelse og trængte på en ortogonal bane til snoren overflade i et punkt <1 mm medialt.
Hos mennesker giver en præoperativ MRI a basisvurdering of rygmarv dimensioner for operativ planlægning. Endvidere er tykkelsen af rygmarven måles for at bestemme måldybde af den ventrale horn.
Suspensionen infunderes i en dybde på 4 mm fra pial kontakt. En flange af Ultem plast tjener som prop på pia overflade for at forhindre nålen i at fremme dybere end ønsket. Når nålespidsen er placeret ved målet, er den stive metal ydre muffe trukket op, forlader den fleksible slange eksponeret. Når injektionen er fuldført, er nålen efterladt på stedet i yderligere 1 minut for at forhindre cell tilbagesvaling indtil kanylens injektion tarmkanalen.
Care er taget for at undgå overflade vaskulatur med lidt justere mikrodrevet enten lateralitet eller Rostro-caudalt. Nogle blødning fra indtrængning sites kan forekomme. Når en sådan blødning er stødt på, er mikro bøffer placeret over den blødende punkturstedet og sugning dem at opsuge blod ud af kanylen penetration websted og forhindre oprustning i ledningen. Dette pålideligt tillader blodet til at koagulere. Cautery undgås som er direkte pres.
Efter nålen af, er stereotaktisk apparat flyttet til den næste målsted langs Rostro-caudale akse, adskilt af 2 eller 4 mm eller som er nødvendige for at undgå synlige blodkar på den dorsale overflade af rygmarven. Denne proces gentages så mange gange som foreslået i en given undersøgelse.
8. Flydende Kanyle
Et brugerdefineret infusionskanyle af snævre diameter bruges til injektionerne. Kanylen består af en 30-gauge skrå nål af fast længde forbundet med en 30-gauge fleksible silastic-rør af forskellig længde. Den distale ende er forsynet med en Hamilton luer lock, der er fastgjort til en microinjector pumpe. Den proximale silastic-rør er ensheathed indenfor en 24-gauge stive ydre kanyle at pladser på den proximale ende af kanylen flange. Denne flange begge sæderden ydre kanyle og fungerer som dybdestop for kanylen. For hver indsprøjtning, er den passende volumen af en terapeutisk suspension infunderes ved en hjælp af en præ-kalibreret Minj-PD microINJECTOR pumpe (TriTech Research, Inc., Los Angeles, CA) med en hastighed på 5 pi per minut.
9. Lukning
Når alle injektioner er foretaget, er det spinale bommen forsigtigt fjernet, og indsnittene lukkes med fire lag. Dura er lukket ved hjælp af en 4,0 Nurolon søm, i en vandtæt måde. 0 Vicryl sutur anvendes til dybe muskulære lag. Fascia lukkes derefter med 0 Vicryl sutur også i en vandtæt måde. Det dermale lag endeligt lukket med 2,0 Vicryl, med en kørende søm. Hudlukning er afsluttet med en 3-0 Nylon sutur.
10. Inddrivelse og Pain Management
Dyr extubated og overvåges i 2 timer efter anæstesi opsving. Dernæst dyr overføres til individuelle caldre og kontrolleres mindst en gang dagligt i fødevareforbruget, afføring, og vandladning.
Til smertebehandling, er et transdermalt fentanylplaster (75 mcg) hæftet på bagsiden af dyrene til tre dages postoperativ analgesi. Desuden kan Buprenorphin (0,05 mg / kg, BID, IM) også gives i op til tre dage efter operation.
11. Resultater og Repræsentative Resultater
Kliniske og adfærd observationer udføres før operation og derefter indspillet på dag 1 til 7 og ugentligt indtil endpoint ifølge undersøgelsen design. Adfærdsmæssige data indsamles og vurdere neurologisk sygelighed som tidligere beskrevet 6. Sensorisk funktion vurderes ved tilstedeværelse eller fravær af en tilbagetrækning respons på mekanisk stimulering af tæerne af front-og bagben. Motorisk funktion følger Tarlov score (tabel 1): 0 - Lammelse, ingen bevægelse, 1 - opfattes, tonus i bagbenene, let movement, 2 - Bevægelser i bagbenene, men ude af stand til at sidde eller stå, 3 - Evne til at stå og gå, men ataxic og i korte perioder, 4 - Complete genopretning, normal motorisk funktion.
Sikkerheden af proceduren bestemmes ved evnen af et dyr at vende tilbage til præoperativ baseline. Forbigående neurologiske underskud bør det meste løse mellem postoperative dag 1 og 7, med visse variationer afhængigt af dyrenes racer og procedure (antal injektioner, blandt andre parametre). Permanent morbiditet er defineret ved vedvarende neurologiske mangler, der ikke løser det tidspunkt dyrene når IACUC standard endpoint (figur 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
| Tarlov Score | |
| 0 | Lammelse, ingen bevægelse |
| 1 | Mærkbare tonus i bagbenene, lille bevægelse |
| 2 | Bevægelse i bagbenene, men ude af stand til at sidde eller stå |
| 3 | Evne til at stå og gå, men ataxic og i korte perioder |
| 4 | Komplet genopretning, normal motorik |
Tabel 1. Tarlov Score. Neurologisk morbiditet og inddrivelse vurderes ved at score dyrets motorik.
Fig. 1. Tabel Positionering for Procedure. Dyrene placeres i liggende stilling på en ramme specialdesignet til at efterligne patienter placering på en Jackson spinal operationsbordet. Rammen udnytter justerbare stropper, der er placeret under brystet og bækkenet af dyret, så maven til at hænge frit, og derfor minimerer tryk på maven og brystet og efterfølgende epidural venøs blødning. Rammen tilvejebringer også ekstern immobilisering af rygsøjlen for proceduren.
Figur 2. Motorik Vurdering og repræsentative resultater. Dyrene underkastes en generel neurologisk undersøgelse før operationen og på regelmæssig basis efter fuldstændig helbredelse fra proceduren. Gait og motorisk funktion vurderes i henhold til Tarlov score. Denne skala giver objektive kriterier vurdere dyrenes evne til at ambulate som surrogate mål for motorisk funktion. Sikkerheden af proceduren bestemmes ved evnen af et dyr at vende tilbage til præoperativ baseline. Forbigående neurologiske underskud bør det meste løse mellem postoperative dag 1 og 7, med visse variationer afhængigt af dyrenes racer og procedure (antal injektioner, blandt andre parametre). Permanent sygelighed defineres af varige neurologiske underskud, som ikke løser det tidspunkt dyrene nå IACUC standard endpoint.
Supplerende
I tilfælde af celleterapi, før laminektomi og under bedøvelse, en halsvene 10F kronisk kateter (adgangsteknologier, CCPS072106A) er placeret til intravenøs administration af immunosuppressiva under hele undersøgelsen. Halsen på dyret prepped og draperes. Den indre halsvene er blotlagt kirurgisk, og kanyleret med kateteret, som er fastgjort med en 3-0 silke slips. Den proximale ende af den indre halsvene er denn ligeret med en 3-0 silke slips. Dernæst kateteret tunnel af halsskindet dorsalt og sikret med 3-0 nylon sting. Endelig er såret vandede og lukket med en kørende 3-0 nylon søm. En sådan procedure er ikke nødvendig hos mennesker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trods godkendelse til at fortsætte med den beskrevne teknik hos mennesker 7-9, stadig kritiske spørgsmål, der skal besvares, for rygmarv terapier til at lykkes. En stringent forståelse af rygmarven tolerance over intraparenchymal injektion er påkrævet for at gøre det muligt for planlægning og gennemførelse af forsøg udvikle behandlinger for demyeliniserende, degenerative og traumatiske rygmarv sygdom. I øjeblikket er der ingen klar forståelse af antallet af injektioner, som det store pattedyr rygmarven kan tåle uden forbigående og permanent morbiditet. Tilsvarende afstand af injektioner vil kunne påvirke sygelighed. Desuden makroskopiske (f.eks ventilation-relaterede eller utilsigtet patient bevægelse) og mikroskopiske (dvs. oscillation med både ventilation og hjerte-puls) rygmarven bevægelser udgøre en risiko for rygmarven under injektion. En forståelse af tærsklen for sygelighed i en stor dyremodel vil hjælpedosering beregninger for alle rygmarv terapi programmer. Vores translationel rygmarv transplantation laboratorium er klar til at hjælpe prækliniske programmer for udvikling af alle hold i øjeblikket designe forsøg med rygmarven ansøgning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Boulis er opfinderen af anordninger for at muliggøre sikker og præcis indsprøjtning af den menneskelige rygmarv. Neuralstem, Inc. har købt en eksklusiv licens til denne teknologi. Dr. Boulis modtaget en varebeholdninger andel af dette gebyr, og har rettighederne til royaltybetalinger for distribution af denne teknologi. Andre forfattere har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Emory University Division of Animal Resources personale til dyrlægebehandling. Finansieringskilder omfatter: ALS Association, Department of Defense, og Neuralstem, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spinal Derrick | Neuralstem, Inc. | Neuralstem, Inc. has purchased an exclusive license to this technology | |
| MINJ-PD Microinjector pump | Tritech Research, Inc. | Customized for this specific application | |
| Floating Cannula | Neuralstem, Inc. | Custom-designed for this specific application |
References
- Usvald, D., et al. Analysis of dosing regimen and reproducibility of intraspinal grafting of human spinal stem cells in immunosuppressed minipigs. Cell Transplant. 19, 1103-1122 (2010).
- Riley, J., et al. Targeted spinal cord therapeutics delivery: stabilized platform and microelectrode recording guidance validation. Stereotact. Funct. Neurosurg. 86, 67-74 (2008).
- Federici, T., Riley, J., Park, J., Bain, M., Boulis, N. Preclinical safety validation of a stabilized viral vector direct injection approach to the cervical spinal cord. Clin. Transl. Sci. 2, 165-167 (2009).
- Riley, J. P., Raore, B., Taub, J. S., Federici, T., Boulis, N. M. Platform and Cannula Design Improvements for Spinal Cord Therapeutics Delivery. Neurosurgery. 69, 147-154 (2011).
- Riley, J., et al. Cervical spinal cord therapeutics delivery: preclinical safety validation of a stabilized microinjection platform. Neurosurgery. 65, 754-761 (2009).
- Raore, B., et al. Cervical multilevel intraspinal stem cell therapy: assessment of surgical risks in Gottingen minipigs. Spine. 36, 164-171 (2011).
- Boulis, N. M., et al. Translational stem cell therapy for amyotrophic lateral sclerosis. Nat. Rev. Neurol. , (2011).
- Riley, J., et al. Intraspinal Stem Cell Transplantation in ALS: A Phase I Safety Trial, Technical Note & Interim Safety Outcomes. Neurosurgery. 71 (2), 405-416 (2012).
- Boulis, N. M., et al. Lumbar intraspinal injection of neural stem cells in patients with ALS: results of a Phase I trial in 12 patients. Stem Cells. 30 (6), 1144-1151 (2012).
