Summary
척수로 (유전자 및 세포) 요법의 전달에 사용되는 수술 기술과 장치의 짧은 영상 설명입니다. 이 기술은 동물에 보여하지만, 완전히 번역 현재 인간 응용 프로그램에 사용되는입니다.
Abstract
이것은 척추에 (유전자 및 세포) 요법의 제공을위한 수술 기법 및 장치의 조합의 소형 시각적 설명입니다. 기술은 동물에서 증명되는 동안 절차는 FDA가 승인 한 현재 ALS 환자의 척수 코드에 줄기 세포 이식에 사용되는 것입니다. FDA가 높은 특징을 쥐 모델에서 치료 효과에 대한 증명 원리 데이터를 인식하지만, 큰 동물의 사용은 수술의 결합, 장치 및 인간의 사용에 대한 최종 치료의 안전을 확인을위한 중요 간주됩니다 . 크기, 해부학, 그리고 돼지의 척추와 척추의 일반적인 문제는 더 나은 모델 인간을로 인정 받고 있습니다. 또한, 노출 및 조작 척수를뿐만 아니라 돼지에 상처를 폐쇄의 수술 과정은 인간의 거의 구분할 수 있습니다. 우리는 건강한 돼지 모델 criti를 나타냅니다 생각절차 안전 연구에 칼 첫 걸음.
Protocol
1. 동물 사용
여기 증명 절차에 모리 대학 기관 동물 케어 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다. 약 15~20킬로그램 무게 여성 괴팅겐의 minipigs이 사용됩니다.
2. 마취
동물 수술하기 전에 약 12 시간을 금식하고 있습니다. 동물 진정 작용과 마취 유도는 근육 케타민 (35 MG / kg), Acepromazine (1.1 밀리그램 / kg) 및 아트로핀 (0.04 밀리그램 / kg)의 칵테일로 구성되어 있습니다. 동물 그런 다음 intubated와 산소와 1-3% isoflurane 전신 마취에 유지됩니다. 이 시점에서, 다시 각 동물의 머리는 면도 있습니다. 마취 심도는 수의학 직원에 의해 모니터링된다. , interdigital 각막과 palpebral 반사뿐만 아니라, 심장, 호흡, 펄스 oximetry, 간접 / 직접 혈압, 최종 갯벌 탄소 이산화탄소 측정 및 근육 톤 / 유해 자극에 대한 반응의 부재는 깊이를 모니터링하는 데 사용됩니다 마취의.
3. 위치
동물은 수술실로 이동하고 잭슨 척추 수술 테이블에 환자 위치를 모방하기위한 프레임 사용자 정의에 발생하기 쉬운 위치로 배치됩니다. 프레임은 복부와 가슴 못하여 경막 외 정맥 출혈 (그림 1)에 압력을 최소화 따라서, 복부 무료 교수형 할 수 있으며, 동물의 가슴과 골반 아래 위치하게된다 조절 slings을 활용합니다. 프레임은 또한 절차 1 척추의 외부 고정을 제공합니다.
또한, 동물 몸의 온도와 유체 관리 및 수술 중에 필요한 약물 전달을위한 catheterized 한계 귀 정맥을 유지하기 위해 온수 다시 순환 패드에 게재됩니다. 마지막으로, 수술 필드가 알코올 및 Chlorhexadine 또는 Betadine 솔루션을 준비하고 있으며, 수술 커튼은 수술 현장에 배치되어 있습니다.
르 "> 4. Laminectomy약 10-15센티미터 피부 절개가 수행되고 paraspinal의 근육은 양자 척추를 해부하고 있습니다. 다음 등쪽의 다중 레벨 laminectomy이 수행됩니다. 세 척추 놓인 C3-C5 또는 L2-L4 세그먼트의 얇은 판과 spinous 프로세스 rongeurs과 수술 드릴을 사용하여 제거됩니다.
5. 척수 데릭의 위치
우리는 척수 데릭 척수 2-5로 (유전자 및 세포) 요법의 전달을위한 장치 전화하십시오. 이 장치의 설계 및 진화에 대한 자세한 논의는 라일리 외., 2011에서 찾을 수 있습니다. 4
환자에 장치를 확보하려면, percutaneous 게시물은 기본 절개 위 아래 1cm 피부 절개를 통해 위치와 주요 절개 위 아래의 얇은 판에 장착되어 있습니다.
다음 두 개의 통합 견인기는 강한에 부착된다절개 사이트 위 아래 UR percutaneous는 게시물 laminectomy를 마쳤습니다 척추의 영역을 표시합니다.
6. 경질 막 개관
우드 슨 치과 도구의 도움과 11 블레이드로 2.5 cm의 절개는 척수를 노출 경질을 통해 이루어집니다. 경질은 4-0 Nurolon의 봉합을 사용하여 pial 층에서 떨어져 반영하고 깊은 paraspinal 근육에 고정된다.
수술 패티는 개방의 뱃 부리 장식이있는과 꼬리 극단에 배치됩니다. 이러한 뇌척수 흐름에 일부 장벽을 제공하고 또한 코드를 손상시키지 않고 스폰지를 삽입 할 수있는 의사의 안전한 대상을 제공합니다. 인간에서 수술 현미경 배율 아래에있는 pial 표면은이 시점에서 해부하고 있습니다. 기술적 인 제한으로 인해이 절차가 필요이나 동물에 적합하지 않을 수 있습니다.
7. 척추 주사 및 추가 주입을위한 척수 데릭의 측면 변위에스
주사 직전에, Methylprednisolone (125 MG, IV)의 bolus이 붓기 척수를 방지하기 위해 제공됩니다.
이 시점에서, 플랫폼 레일 시스템은 장착되어 있으며 측면 레일은 적절한 길이에 맞게 조정됩니다. 곤돌라는 2 개의 바에 최고로드와 Z 드라이브는 보편적 공동에 장착되어 있습니다. 다음로드의 캐뉼라는 microdrive에 배치됩니다. microinjection 플랫폼에서 범용 공동을 사용하여 코로나와 화살 각도는 척추 주사의 캐뉼라의 위치를 따라 표면에 대해 수직 궤적을 보장하기 위해 조정됩니다. 바늘은 등쪽 루트 항목 영역 (DREZ)에 따라 중간 위치입니다. DREZ는 3.5X 수술 루페 배율에서 확인하고 지점 코드 표면에 수직 궤적 <medially 1mm에 침투하고 있습니다.
인간에 미리 수술 MRI는 기본 평가 O를 제공합니다수술 계획을위한 F 척추 크기. 또한, 척추의 두께는 복부 뿔의 대상 깊이를 결정하기 위해 측정됩니다.
정지는 pial 접촉에서 4 mm의 깊이에 주입합니다. ultem 플라스틱으로 만든 플랜지 원하는보다 훨씬 발전에서 바늘을 방지하기 위해 피아 표면에 스토퍼 역할을합니다. 바늘 끝이 목표 지점에 위치하고되면 단단한 금속 바깥 쪽 슬리브는 유연한 튜브가 노출 남겨두고 체포된다. 주입이 완료되면, 바늘은 캐뉼라 주입 기관을 백업 세포 역류를 방지하기 위해 추가 1 분에 장소에 남아 있습니다.
케어가 약간 microdrive laterality 또는 rostro - caudally 중 하나를 조정하여 표면 vasculature을 피하기 위해 이루어집니다. 침투 사이트의 일부 출혈이 발생할 수 있습니다. 이러한 출혈이 발생하는 경우, 마이크로 패티는 출혈이 주사 부위에 배치되어 있으며 흡입은 캐뉼라 penetr의 피를 등심하도록 적용됩니다ation 사이트 및 코드를 축적되지 않도록합니다. 이 안정적으로 응고하는 혈액 할 수 있습니다. 직접 압력이 그대로 소작을 피할 수 있습니다.
바늘 제거 후, stereotaxic 장치는 척추의 등 표면에 보이는 혈관을 피하기 위해 필요한 2 또는 4 mm 또는로 구분하여 rostro - 꼬리 축을 따라 다음 대상 사이트로 이전합니다. 주어진 연구에서 제안으로이 과정은 많은 시간을 반복하고 있습니다.
8. 플로팅 정맥
좁은 직경의 사용자 지정 주입 캐뉼라는 주사에 사용됩니다. 캐뉼라는 가변 길이의 30 게이지 유연한 silastic 튜브에 연결 고정 길이의 30 게이지 바늘 beveled로 구성되어 있습니다. 말단부는 microinjector 펌프에 부착되어있는 해밀턴 luer 자물쇠가 장착되어 있습니다. 근위 silastic 튜브는 24 게이지 경질의 외부 캐뉼라 내 ensheathed되는 주입 바늘 플랜지의 근위 끝 석. 이 플랜지 두 석외부 캐뉼라하고 주사 바늘에 대한 깊이 정류장 역할을합니다. 각각의 주입 들어, 치료 중지의 적절한 볼륨으로 주입하는 분 당 5 μl의 비율로 미리 교정 MINJ-PD microINJECTOR 펌프 (Tritech 연구, 주식회사, 로스 앤젤레스, CA)를 사용하여.
9. 폐쇄
모든 주사이 완료되면 척추 데릭은 부드럽게 제거하고 절개은 네 층으로 폐쇄됩니다. 경질은 방수 방식으로, 4.0 Nurolon 스티치를 사용하여 문을 닫습니다. 0 Vicryl의 봉합이 깊은 근육 층에 사용됩니다. 근막은 다음 방수 방식도 0 Vicryl의 봉합과 함께 폐쇄됩니다. 피부 층은 드디어 실행 스티치와 함께, 2.0 Vicryl으로 문을 닫습니다. 피부 폐쇄는 3-0 나일론 봉합사를 사용하여 완료됩니다.
10. 복구 및 통증 관리
동물은 2 시간 다음 마취 복구를 위해 extubated하고 모니터링합니다. 다음, 동물은 개별 C으로 전송됩니다연령과 식품 소비, 깨끗하게 함, 그리고 방뇨 최소 하루에 한 번씩 모니터.
통증 관리를 들어, transdermal 펜타 패치 (75 mcg)는 수술 진통제 3 일 동안 동물의 뒷면에 잘라 있습니다. 또한, Buprenorphine는 (0.05 밀리그램 / kg, BID, IM)는 최대 사후 operatively 3 일에 제공 될 수 있습니다.
11. 결과 및 대표 성과
임상과 행동 관찰은 연구 설계에 따라 엔드 포인트까지 수술 전에 수행 한 후 일 1 일까지 7 일에 녹화하고 주 단위로되어 있습니다. 행동 데이터는 이전 6에 설명 된대로 신경 병적 상태를 평가하기 위해 수집됩니다. 감각 기능은 전면과 두 다리의 발끝에 기계적 자극에 탈퇴 응답의 유무에 의해 평가된다. -; 1 - 두 다리에 지각 tonus, 약간의 m 마비, 아니 운동 0 : 모터 기능은 Tarlov 점수 (표 1) 다음ovement, 2 - 두 다리의 운동 만 앉거나 서서 할 수없는, 3 - 서서하지만 ataxic 짧은 기간 동안 도보로하는 능력, 4 - 전체 복구, 정상적인 운동 기능.
절차의 안전은 미리 수술 기본으로 돌아가려면 동물의 능력에 의해 결정됩니다. 과도 신경 결손은 주로 동물의 품종과 절차에 따라 몇 가지 변화 (주사 수, 다른 매개 변수들)과 수술 일 1과 7 사이에 해결됩니다. 영구 병적는 동물 IACUC 기본 끝점 (그림 2)에 도달 때까지 해결되지 않는 지속적인 신경 결손에 의해 정의됩니다.
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Representative Results
| Tarlov 평가 점수 | |
| 0 | 마비, 아니 운동 |
| 1 | 두 다리에 지각 tonus, 약간의 운동 |
| 이 | 두 다리의 운동 만 앉거나 서서 할 수 없습니다 |
| 3 | 하지만 ataxic 짧은 기간 동안을 서서 걸어 할 수있는 능력 |
| 4 | 완전한 복구, 정상적인 운동 기능 |
표 1. Tarlov 점수. 신경 병적 상태 및 복구는 동물의 운동 기능 점수를하여 평가된다.
Procedur에 대한 그림 1. 테이블 위치5. 동물 잭슨 척추 수술 테이블에 환자 위치를 모방하기위한 프레임 사용자 정의에 발생하기 쉬운 위치로 배치됩니다. 프레임은 복부는 복부와 가슴 못하여 경막 외 정맥 출혈에 압력을 최소화 따라서, 무료 만나서 할 수 있습니다 동물의 가슴과 골반 아래 위치하게된다 조절 slings을 활용합니다. 프레임은 프로 시저에 대한 척추의 외부 고정을 제공합니다.
그림 2. 운동 기능 평가 및 대표 성과. 동물은 수술 전과 절차에서 완전히 회복에 따라 정기적으로 일반적인 신경 검사를 거칩니다. 보행 및 운동 기능은 Tarlov 평가 점수에 따라 평가됩니다. 이 규모는 surro로 ambulate 할 수있는 동물의 능력을 평가하는 객관적인 기준을 제공합니다모터 기능의 게이트 측정. 절차의 안전은 미리 수술 기본으로 돌아가려면 동물의 능력에 의해 결정됩니다. 과도 신경 결손은 주로 동물의 품종과 절차에 따라 몇 가지 변화 (주사 수, 다른 매개 변수들)과 수술 일 1과 7 사이에 해결됩니다. 영구 병적는 동물 IACUC 기본 끝점에 도달 할 때까지 해결되지 않는 지속적인 신경 결손에 의해 정의됩니다.
보충하는
세포 치료 전에 laminectomy과 마취하에 목 정맥 10 층 만성 카테 테르 (액세스 기술, CCPS072106A)의 경우는 연구 기간 동안 면역 억제제의 정맥 주사 관리를 위해 배치됩니다. 동물의 목을 준비하고 장식되어 있습니다. 속목 정맥은 수술 노출 3-0 실크 넥타이 고정되어있는 카테터와 cannulated 있습니다. 속목의 근위 끝n은 3-0 실크 넥타이 출혈도 잡았. 다음, 카테터는 dorsally 목 피부에서 터널링과 3-0 나일론 바늘로 고정된다. 마지막으로, 상처가 실행중인 3-0 나일론 스티치와 irrigated하고 문을 닫습니다. 이러한 절차는 인간에 필요하지 않습니다.
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Discussion
인간 7-9에 설명 된 기술을 계속 진행하기 위해 승인에도 불구하고, 중요한 질문은 성공 척추 요법에 대한 순서로 답변을 할 수 남아 있습니다. intraparenchymal 주사로 척추 허용의 엄격한 이해, 퇴행성 demyelinating 및 외상성 척추 질환에 대한 치료를 개발하는 실험의 계획 및 실행을 사용하도록 설정해야합니다. 현재 대형 포유류의 척추가 과도하고 영구적 인 질병없이 용인 할 수있는 주사의 수 더 명확한 이해가 없습니다. 마찬가지로, 주사의 간격은 병적에 영향을 미칠 가능성이 높습니다. 또한, 매크로 (예를 들면, 환기 관련 또는 부주의 환자의 움직임)과 미세 (즉, 환기 및 심장 맥박이 모두 진동) 척추의 움직임은 분사 동안 척수 위험을 가지고 있습니다. 큰 동물 모델에서 질병에 대한 임계 값에 대한 이해가 도움이 될모든 척추 치료 프로그램에 계산을 주입. 우리 병진 척추 이식 연구소는 현재 척추 응용 프로그램에 대한 재판을 디자인하는 모든 팀의 잠복기 개발 프로그램 도움을 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
박사 Boulis는 인간 척추의 안전하고 정확한 주사를 사용하려면 장치의 발명가이다. Neuralstem, Inc는이 기술에 대한 독점적 인 사용권을 구입했다. 박사 Boulis이 요금의 invento의 점유율을받은이 기술의 배포에 대한 로열티 지불에 대한 권리가 있습니다. 다른 저자 공개는 아무 상관이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 동물 치료 동물 자원 직원의에 모리 대학 본부 감사드립니다. 자금 출처는 다음과 같습니다 ALS 협회, 국방부, 그리고 Neuralstem, 주식회사
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spinal Derrick | Neuralstem, Inc. | Neuralstem, Inc. has purchased an exclusive license to this technology | |
| MINJ-PD Microinjector pump | Tritech Research, Inc. | Customized for this specific application | |
| Floating Cannula | Neuralstem, Inc. | Custom-designed for this specific application |
References
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