Summary
Kort visuell beskrivelse av kirurgiske teknikk og apparat for levering av (gen og celle) terapi i ryggmargen. Teknikken er demonstrert i dyret, men er helt oversettbare og tiden blir brukt for menneskelig anvendelse.
Abstract
Dette er en kompakt visuell beskrivelse av en kombinasjon av kirurgisk teknikk og anordning for levering av (gen og celle) terapi i ryggmargen. Mens teknikken demonstreres i dyret, er prosedyren FDA-godkjent og i øyeblikket anvendes for stamcelletransplantasjon inn ryggmargen til pasienter med ALS. Mens FDA har anerkjent proof-of-prinsippet data på terapeutisk effekt hos sterkt preget gnagermodeller, er bruken av store dyr som kritisk for å validere kombinasjonen av en kirurgisk prosedyre, en enhet, og sikkerheten av en endelig behandling for menneskelig bruk . Størrelsen, anatomi og generell sårbarhet av ryggraden og ryggmargen av svin er anerkjent for å bedre modell det menneskelige. Videre, er den kirurgiske prosess eksponere og manipulere ryggmargen samt lukke såret i grisen nesten ikke skilles fra den menneskelige. Vi tror at den sunne gris modellen representerer en kritikkcal første skritt i studiet av prosessuelle sikkerhet.
Protocol
1. Animal Bruk
Prosedyrer demonstrerte her har blitt godkjent av Emory University Institutional Animal Care og bruk komité (IACUC). Kvinne Göttingen minigriser veier ca 15-20 kg er brukt.
2. Anestesi
Dyr er fastet ca 12 timers før operasjonen. Animal sedasjon og anestesi induksjon består av en cocktail av intramuskulær Ketamine (35 mg / kg), acepromazin (1,1 mg / kg), og atropin (0,04 mg / kg). Dyr blir deretter intubert og vedlikeholdt på oksygen og 1-3% isofluran narkose. På dette punktet, er baksiden og leder av hvert dyr barbert. Anestesidybden overvåkes av veterinær ansatte. Fravær av interdigitale, korneal og palpebral reflekser samt hjerte og respirasjonsfrekvens, pulsoksymetri, direkte / indirekte blodtrykk, en ende-tidal karbondioksidutslipp målinger, og muskeltonus / respons på skadelige stimuli brukes til å overvåke dybden av anestesi.
3. Posisjonering
Dyr er tatt til operasjonsstuen og legges i en utsatt posisjon på en ramme tilpasset designet for å etterligne pasienter posisjonering på en Jackson spinal kirurgi bord. Rammen benytter justerbare stropper som er plassert under brystet og bekkenet av dyret, slik at buken å henge fritt og derfor minimalisere trykk mot underlivet og bryst og påfølgende epidural venøs blødning (figur 1). Rammen gir også ekstern immobilisering av ryggraden for prosedyren 1.
Tillegg er dyrene plassert på et oppvarmet resirkulerende pad for å opprettholde kroppstemperaturen og en marginal øre vene kateteriseres for væske administrasjon og nødvendig for levering av legemidler under operasjonen. Endelig, er det kirurgiske feltet preparert med alkohol og Chlorhexadine eller Betadine løsning og operasjonsduker plasseres på kirurgiske feltet.
le "> 4. laminektomiEn ca 10-15 cm hud innsnitt er utført og paraspinal muskulaturen er dissekert av ryggraden bilateralt. Deretter ble en dorsal flere nivåer laminektomi utført. Lamina og spinous prosesser av tre ryggvirvler overliggende C3-C5 eller L2-L4 segmenter er fjernet ved hjelp Rongeurs og en kirurgisk drill.
5. Plassering av Spinal Derrick
Vi kaller Spinal Derrick enheten utformet for levering av (gen og celle) terapi i ryggmargen 2-5. Detaljert beskrivelse av design og utvikling av denne enheten kan bli funnet på Riley et al., 2011. 4
Å feste enheten til pasienten, er perkutane innlegg plassert gjennom 1cm huden incisions over og under den primære snitt og montert til lamina over og under den primære innsnitt.
Deretter blir to integrerte retractors festet til four perkutane innlegg over og under innsnitt området for å avsløre område av ryggraden som har gjennomgått laminektomi.
6. Dural Åpning
Ved hjelp av en dental Woodson verktøyet og en 11 blad, er en 2,5 cm innsnitt gjort gjennom dura, utsette ryggmargen. Dura reflekteres bort fra pial lag bruker 4-0 Nurolon sutur og festet til den dype paraspinal muskulatur.
Kirurgiske patties plasseres i rostral og kaudale ytterligheter av åpningen. Disse gir en delvis barriere mot cerebrospinalvæsken flyt og også gi en trygg mål for kirurger å plassere suckers uten å skade ledningen. Hos mennesker, under kirurgisk mikroskop forstørrelse blir pial overflaten dissekerte på dette punktet. På grunn av tekniske begrensninger, er denne prosedyren ikke nødvendig eller mulig i dyr.
7. Ryggmargen injeksjoner og lateral forskyvning av Spinal Derrick for ekstra Injections
Umiddelbart før injeksjoner, en bolus av Metylprednisolon (125 mg, IV) gis for å hindre ryggmargen hevelse.
På dette punktet, er plattformen jernbanesystem knyttet og sideskinnene er justert for å passe til passende lengde. Gondolen er top-lastet inn de 2 barene og Z-stasjonen er montert på universalledd. Deretter blir den innlastede kanyle plassert på Microdrive. Bruke universalleddet på mikroinjeksjon plattformen, blir den koronale og sagittale vinkler justeres for å sikre en bane vinkelrett på overflaten av spinal Injeksjoner følger plasseringen av kanylen. Nålen er plassert tilsvarende mediale til dorsal root entry zone (DREZ). Den DREZ er identifisert under 3.5X kirurgisk lupe forstørrelse og trengt på en ortogonal bane på ledningen overflaten på et punkt <1 mm medialt.
Hos mennesker, gir en pre-operative MR en baseline vurdering of ryggmargen dimensjoner for operativ planlegging. Videre er tykkelsen av ryggmargen måles for å bestemme måldybden av ventrale horn.
Suspensjonen infusert med en dybde på 4 mm fra pial kontakt. En flens er laget av Ultem plast tjener som en stopper på pia overflate for å hindre at nålen fremrykkende dypere enn ønsket. Når nålespissen er plassert på målet, er den stive metall ytterhylse trakk opp, forlater den fleksible slangen utsatt. Når injeksjonen er avsluttet, er nålen igjen på plass i ytterligere 1 min for å hindre celle reflux opp kanylen injeksjon tarmkanalen.
Omsorg er tatt for å unngå overflaten blodkar med litt justering av Microdrive enten laterality eller Rostro-caudally. Noe blødning fra penetrasjon nettsteder kan forekomme. Når slik blødning er oppstått, er mikro patties plassert over blødningen punksjonsstedet og sug påføres dem å veken blod ut av kanylen penetrasjon området og hindre oppbygging i ledningen. Dette tillater pålitelig for blodet å koagulere. Cautery unngås som er direkte press.
Etter nålen fjerning, er det stereotaksiske anordningen flyttet til neste målstedet langs Rostro-caudal aksen, atskilt med to eller 4 mm, eller ved behov for å unngå synlige blodkar på framsiden av ryggmargen. Denne prosessen gjentas så mange ganger som foreslått i en gitt studie.
8. Flytende Kanyle
En tilpasset infusjon kanyle av smale diameter brukes for injeksjoner. Kanylen består av en 30-gauge nål skråskårne av fast lengde som er koblet til en 30-gauge fleksibel silastic rør med variabel lengde. Den distale ende er utstyrt med en Hamilton luerlås som er festet til en microinjector pumpe. Den proksimale silastic slangen er ensheathed innenfor en 24-gauge stive ytre kanylen som seter på den proksimale enden av nålen flens. Denne flensen begge seterden ytre kanylen og tjener som dybdeanslag for injeksjonsnålen. For hver injeksjon, blir den riktige mengde av en terapeutisk suspensjon infunderes ved en hjelp av en pre-kalibrert Minj-PD microINJECTOR pumpe (Tritech Research, Inc., Los Angeles, CA) med en hastighet på 5 pl per minutt.
9. Closure
Når alle injeksjoner har blitt gjort, er spinal boretårn forsiktig fjernet og snittene er stengt i fire lag. Dura er stengt ved hjelp av en 4,0 Nurolon sømmen i en vanntett måte. 0 Vicryl sutur er brukt for den dype muskulære laget. Konseptet er så lukket med 0 Vicryl suture også i en vanntett måte. Dermal laget er endelig avsluttet med 2,0 Vicryl, med en løpende sting. Skin nedleggelse er gjennomført ved hjelp av en 3-0 nylon sutur.
10. Recovery og Pain Management
Dyr er extubated og overvåkes i 2 timer etter anestesi utvinning. Deretter blir dyrene overføres til individuell caldre og kontrollert minst en gang daglig for mat forbruk, defecation, og vannlating.
For smertelindring, er en transdermal Fentanyl patch (75 mcg) stiftet på baksiden av dyrene for tre dager med postoperativ smertelindring. Tillegg kan Buprenorfin (0,05 mg / kg, to ganger daglig, IM) også gis for opp til tre dager postoperativt.
11. Resultater og Representative Utfall
Kliniske og atferd observasjoner utføres før operasjonen og deretter registrert på dag 1 til 7 og ukentlig inntil endepunkt ifølge studien design. Adferdsdata samles for å vurdere nevrologiske sykelighet som tidligere beskrevet 6. Sensorisk funksjon er vurdert av tilstedeværelse eller fravær av en tilbaketrekking respons til mekanisk stimulans til tærne av front-og baklemmene. Motorisk funksjon følger Tarlov score (tabell 1): 0 - Lammelse, ingen bevegelse, 1 - Merkbar tonus i bakbena, liten movement, 2 - Bevegelse i baklemmene, men ute av stand til å sitte eller stå, 3 - Evne til å stå og gå, men ataxic og for korte perioder, 4 - Complete utvinning, normal motorisk funksjon.
Sikkerhet for prosedyren bestemmes ved evnen av et dyr for å gå tilbake til preoperativ grunnlinjen. Forbigående nevrologiske underskudd bør det meste løse mellom postoperative dag 1 og 7, med noen variasjoner avhengig dyrs raser og prosedyre (antall injeksjoner, blant andre parametere). Permanent morbiditet defineres av varige nevrologiske underskudd som ikke løse av tiden dyrene når IACUC standard endepunkt (figur 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
| Tarlov Resultat | |
| 0 | Lammelser, ingen bevegelse |
| 1 | Merkbare tonus i baklemmene, liten bevegelse |
| 2 | Bevegelse i bakbena, men ikke å sitte eller stå |
| 3 | Evne til å stå og gå, men ataxic og for korte perioder |
| 4 | Fullstendig gjenoppretting, normal motorikk |
Tabell 1. Tarlov Score. Nevrologisk sykelighet og gjenvinning vurderes ved å score dyrets motorisk funksjon.
Figur 1. Tabell Posisjonering for procedure. Dyrene plasseres i en utsatt stilling på en ramme tilpasset designet for å etterligne pasienter posisjonering på en Jackson spinal kirurgisk tabellen. Rammen benytter justerbare stropper som er plassert under brystet og bekkenet av dyret, slik at buken å henge fritt og derfor minimalisere trykk mot underlivet og bryst og påfølgende epidural venøs blødning. Rammen gir også ekstern immobilisering av ryggraden for prosedyren.
Figur 2. Motor Function Assessment and Representative Outcomes. Dyr gjennomgå en generell nevrologisk undersøkelse før operasjonen og på regelmessig basis etter fullstendig gjenoppretting fra prosedyren. Gangart og motorisk funksjon vurderes i henhold til Tarlov score. Denne skalaen gir objektive kriterier å vurdere dyrenes evne til å ambulate som surrogate mål på motorisk funksjon. Sikkerhet for prosedyren bestemmes ved evnen av et dyr for å gå tilbake til preoperativ grunnlinjen. Forbigående nevrologiske underskudd bør det meste løse mellom postoperative dag 1 og 7, med noen variasjoner avhengig dyrs raser og prosedyre (antall injeksjoner, blant andre parametere). Permanent sykelighet er definert av varige nevrologiske underskudd som ikke løse av den tiden dyrene nå IACUC standard endepunkt.
Supplerende
Ved cellen terapi, før laminektomi og under anestesi, en halsvene 10F kronisk kateter (aksessteknologier, CCPS072106A) plasseres for intravenøs administrering av immunosuppressiva for varigheten av undersøkelsen. Halsen på dyret prepped og drapert. Den indre halsvene er eksponert kirurgisk og kanylert med kateter, som er sikret med en 3-0 silke slips. Den proksimale ende av den interne jugular ern ligert med en 3-0 silkeslips. Deretter blir kateteret tunnelerte ut av halsen huden dorsalt og sikret med 3-0 nylon masker. Til slutt blir såret irrigert og lukket med en løpende 3-0 nylon søm. Prosedyre er ikke nødvendig i mennesker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Til tross for godkjenning for å fortsette med den beskrevne teknikken hos mennesker 7-9, kritiske spørsmål gjenstår å bli besvart for at ryggmargen terapi for å lykkes. En streng forståelse av ryggmargen toleranse for intraparenchymal injeksjon er nødvendig for å muliggjøre planlegging og gjennomføring av forsøk å utvikle terapier for demyeliniserende, degenerative og traumatisk ryggmargen sykdom. Foreløpig er det ingen klar forståelse av antall injeksjoner som den store pattedyr ryggmargen kan tolerere uten forbigående og permanent sykelighet. Tilsvarende er avstanden mellom injeksjoner sannsynligvis påvirke sykelighet. Videre makroskopiske (f.eks ventilasjon-relatert eller utilsiktet pasientbevegelse) og mikroskopiske (dvs. svingningen med både ventilasjon og hjertestans puls) ryggmargen bevegelser medføre fare for ryggmargen under injeksjon. En forståelse av terskelen for sykelighet i en stor dyremodell vil hjelpedosering beregninger for alle ryggmargslesjoner terapi programmer. Vår translasjonell ryggmargen transplantasjon laboratoriet er tilgjengelig for å hjelpe prekliniske utviklingsprogrammer av alle lagene i dag utforme studier for ryggmargen søknad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Boulis er oppfinneren av enheter for å muliggjøre sikker og nøyaktig injeksjon av den menneskelige ryggmargen. Neuralstem, Inc. har kjøpt en eksklusiv lisens til denne teknologien. Dr. Boulis fikk varelager andel av denne avgiften, og har rettigheter til royalty-betalinger for distribusjon av denne teknologien. Andre forfattere har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Emory University Division of Animal Resources ansatte for veterinær pleie. Finansieringskilder omfatter: ALS Association, Department of Defense, og Neuralstem, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spinal Derrick | Neuralstem, Inc. | Neuralstem, Inc. has purchased an exclusive license to this technology | |
| MINJ-PD Microinjector pump | Tritech Research, Inc. | Customized for this specific application | |
| Floating Cannula | Neuralstem, Inc. | Custom-designed for this specific application |
References
- Usvald, D., et al. Analysis of dosing regimen and reproducibility of intraspinal grafting of human spinal stem cells in immunosuppressed minipigs. Cell Transplant. 19, 1103-1122 (2010).
- Riley, J., et al. Targeted spinal cord therapeutics delivery: stabilized platform and microelectrode recording guidance validation. Stereotact. Funct. Neurosurg. 86, 67-74 (2008).
- Federici, T., Riley, J., Park, J., Bain, M., Boulis, N. Preclinical safety validation of a stabilized viral vector direct injection approach to the cervical spinal cord. Clin. Transl. Sci. 2, 165-167 (2009).
- Riley, J. P., Raore, B., Taub, J. S., Federici, T., Boulis, N. M. Platform and Cannula Design Improvements for Spinal Cord Therapeutics Delivery. Neurosurgery. 69, 147-154 (2011).
- Riley, J., et al. Cervical spinal cord therapeutics delivery: preclinical safety validation of a stabilized microinjection platform. Neurosurgery. 65, 754-761 (2009).
- Raore, B., et al. Cervical multilevel intraspinal stem cell therapy: assessment of surgical risks in Gottingen minipigs. Spine. 36, 164-171 (2011).
- Boulis, N. M., et al. Translational stem cell therapy for amyotrophic lateral sclerosis. Nat. Rev. Neurol. , (2011).
- Riley, J., et al. Intraspinal Stem Cell Transplantation in ALS: A Phase I Safety Trial, Technical Note & Interim Safety Outcomes. Neurosurgery. 71 (2), 405-416 (2012).
- Boulis, N. M., et al. Lumbar intraspinal injection of neural stem cells in patients with ALS: results of a Phase I trial in 12 patients. Stem Cells. 30 (6), 1144-1151 (2012).
