Summary
Curta descrição visual da técnica cirúrgica e um dispositivo usado para a entrega de gene (e celular) terapias para a medula espinhal. A técnica é demonstrada no animal, mas é completamente traduzíveis e sendo utilizado para a aplicação em seres humanos.
Abstract
Esta é a descrição compacta visual de uma combinação da técnica cirúrgica e um dispositivo para a entrega de gene (e celular) terapias para a medula espinhal. Embora a técnica é demonstrada no animal, o procedimento é aprovado pelo FDA e actualmente utilizados para o transplante de células-tronco em medula espinal de pacientes com ELA. Embora a FDA tenha reconhecido à prova de princípio, os dados sobre a eficácia terapêutica em modelos de roedores altamente caracterizados, o uso de animais de grande porte é considerado crítico para a validação da combinação de um procedimento cirúrgico, um dispositivo, e a segurança de uma terapia definitiva para uso humano . O tamanho, anatomia e vulnerabilidade geral da coluna vertebral e medula espinhal dos suínos são reconhecidos para melhor o modelo humano. Além disso, o processo cirúrgico e manipulação de expor a medula espinal, bem como o fechamento da ferida na gusa é virtualmente indistinguível do humano. Nós acreditamos que o modelo de porco saudável representa uma crítical primeiro passo do estudo de segurança processual.
Protocol
1. Uso de Animais
Procedimentos demonstrados aqui foram aprovados pelo Animal Care Institucional da Universidade Emory e Uso Comissão (IACUC). Minipigs Feminino Göttingen pesando aproximadamente 15-20 kg são utilizados.
2. Anestesia
Os animais estão em jejum de aproximadamente 12 horas antes da cirurgia. Sedação e indução da anestesia de animais constituído por uma mistura de cetamina por via intramuscular (35 mg / kg), acepromazina (1,1 mg / kg) e atropina (0,04 mg / kg). Os animais são então intubados e mantidos com oxigénio e 1-3% de isoflurano anestesia geral. Neste ponto, a parte de trás da cabeça e de cada animal é raspada. Profundidade da anestesia é monitorada pelo pessoal veterinário. Ausência de reflexos interdigitais, da córnea e da pálpebra, bem como freqüência cardíaca e respiratória, oximetria de pulso, direta / indireta da pressão arterial, o fim-de maré medições de dióxido de carbono, e tônus muscular / resposta a estímulos nocivos são usados para monitorar a profundidade da anestesia.
3. Posicionamento
Os animais são levados para a sala de cirurgia e colocado em uma posição de bruços em um costume quadro projetado para imitar posicionamento do paciente na mesa cirúrgica Jackson espinhal. O quadro utiliza correias ajustáveis que são colocados sob o peito e pélvis do animal, permitindo que o abdómen para pendurar livre e, portanto, minimizar a pressão no abdómen e no tórax e consequente sangramento venoso epidural (Figura 1). O quadro também fornece a imobilização externa da coluna para o procedimento 1.
Além disso, os animais são colocados numa almofada de recirculação aquecida para manter a temperatura do corpo e uma veia marginal da orelha cateterizada para a administração do fluido e qualquer administração de fármaco necessária durante uma cirurgia. Finalmente, o campo cirúrgico está preparada com álcool e solução Chlorhexadine ou Betadine e campos cirúrgicos são colocados no campo cirúrgico.
le "> Laminectomia 4.Uma incisão na pele aproximadamente 10-15 cm é feita e da musculatura paraespinhal é dissecado para fora da coluna vertebral bilateralmente. Em seguida, uma laminectomia dorsal de níveis múltiplos será realizada. Os processos da lâmina e espinhoso de três sobrejacente vértebras C3-C5 ou L2-L4 segmentos são removidos usando fórceps e uma broca cirúrgica.
5. Colocação do Derrick Spinal
Chamamos Derrick Spinal o dispositivo concebido para a entrega do gene e (célula) terapias para o 2-5 da medula espinhal. Discussão detalhada sobre a concepção e evolução deste dispositivo pode ser encontrado no Riley et al., 2011. 4
Para fixar o dispositivo ao paciente, mensagens percutâneas são colocadas através de incisões na pele um centímetro acima e abaixo da incisão principal e montado com a lâmina acima e abaixo da incisão primária.
Em seguida, dois afastadores integrados estão ligados ao four percutâneas mensagens acima e abaixo do local de incisão para expor a área da coluna vertebral que foi submetido a laminectomia.
6. Abertura da dura-máter
Com o auxílio de uma ferramenta de Woodson dental e uma lâmina 11, a incisão de 2,5 cm é feita através da dura-máter, expondo a medula espinhal. A dura-máter é reflectida para longe da camada pial usando sutura 4-0 e Nurolon fixada à musculatura paraespinhal profundo.
Patties cirúrgicos são colocados nos extremos rostral e caudal da abertura. Estes proporcionam uma barreira parcial para o fluxo de fluido cerebrospinal, e também proporcionar um alvo seguro para os cirurgiões para colocar ventosas sem danificar o fio. Nos seres humanos, sob a ampliação do microscópio cirúrgico, a superfície pial é dissecado a este ponto. Devido a limitações técnicas, este procedimento não é necessário ou viável em animais.
7. Spinal Cord Injeções e deslocamento lateral da torre Spinal para injeção adicionals
Imediatamente antes da injecção, um bolus de metilprednisolona (125 mg, IV) é administrado para evitar inchaço da medula espinhal.
Neste ponto, o sistema de trilho da plataforma está ligado e os trilhos laterais estão ajustadas para o comprimento apropriado. A gôndola é top-carregados nos 2 bares e a unidade Z é montado na junta universal. A seguir, a cânula carregado é colocado no microdrive. Usando a junta universal sobre a plataforma de microinjecção, os ângulos coronal e sagital são ajustadas para assegurar uma trajetória ortogonal à superfície das injecções espinais seguir a colocação da cânula. A agulha é posicionada em conformidade com a zona medial da raiz dorsal de entrada (DREZ). O DREZ é identificado com a ampliação de 3,5 X lupa cirúrgica e penetrou numa trajectória ortogonal à superfície do cabo num ponto <1 mm medialmente.
Nos seres humanos, uma MRI pré-operatória fornece uma linha de base de avaliação of espinal medula dimensões para o planejamento operacional. Além disso, a espessura da medula espinal é medido para determinar a profundidade alvo do corno ventral.
A suspensão é administrada a uma profundidade de 4 mm do contacto pial. A flange feita de plástico Ultem serve como um batente na superfície pia para evitar que a agulha avança mais profundamente do que o desejado. Uma vez que a ponta da agulha está posicionado no alvo, a manga metálica rígida exterior é puxado para cima, deixando a tubagem flexível exposto. Uma vez que a injecção está terminada, a agulha é deixada no local durante um adicional de 1 min para prevenir o refluxo de células acima do trato de injecção de uma cânula.
Cuidado é tomado para evitar a vasculatura superfície por ajustando levemente o microdrive ou lateralidade ou rostro-caudalmente. Alguns locais de hemorragia a partir de penetração pode ocorrer. Quando o sangramento como é encontrado, patties micro são colocadas sobre o local da punção sangramento e a sucção é aplicada a eles a pavio sangue para fora da cânula penetrção local e evitar o acúmulo na medula. Isto permite de forma confiável para que o sangue coagule. Cauterização é evitado como é a pressão direta.
Após a remoção da agulha, o aparelho estereotáxico é deslocado para o local alvo ao lado ao longo do eixo rostro-caudal, separados por 2 ou 4 mm, ou conforme necessário, para evitar vasos sanguíneos visíveis sobre a superfície dorsal da medula espinhal. Este processo é repetido tantas vezes como proposto em um determinado estudo.
8. Cânula flutuante
A cânula de infusão personalizado de diâmetro estreito é usado para administrar as injecções. A cânula é constituída por uma agulha de calibre 30 chanfrada de comprimento fixo ligado a uma tubagem de calibre 30 silastic flexível de comprimento variável. A extremidade distai é equipado com um luer lock Hamilton que está ligado a uma bomba de microinjector. O tubo de silastic proximal é ensheathed dentro de uma cânula de calibre 24 exterior rígida que assentos na extremidade proximal da flange da agulha de injecção. Este flange dois bancosa cânula exterior e serve como um batente de profundidade para a agulha de injecção. Para cada injecção, o volume apropriado da suspensão de terapêutica é administrada por um. Usando um pré-calibrado Minj-PD microinjector bomba (Tritech Research, Inc., Los Angeles, CA) a um caudal de 5 ul por minuto
9. Fecho
Uma vez que todas as injecções foram feitas, a torre de perfuração vertebral é suavemente removido e as incisões são fechadas em quatro camadas. A dura-máter é fechado com um 4,0 Nurolon ponto, de uma forma estanque. 0 sutura Vicryl é usado para a camada mais profunda muscular. Fáscia é então fechada com sutura Vicryl 0 também de uma forma estanque. A camada dérmica é finalmente fechada com Vicryl 2,0, com um ponto de funcionamento. Fechamento da pele é concluída com fio de náilon 3-0.
10. Recuperação e Tratamento da Dor
Os animais são extubados e monitorados para a recuperação da anestesia 2 horas seguintes. Em seguida, os animais são transferidos para c indivíduoidades e monitorizados pelo menos uma vez por dia para o consumo de alimentos, a defecação, micção e.
Para a gestão da dor, um emplastro transdérmico de fentanilo (75 mcg) são grampeadas nas costas dos animais, durante três dias de pós-operatório, a analgesia. Além disso, a buprenorfina (0,05 mg / kg, BID, IM) também pode ser administrado durante um a três dias de pós-operatório.
11. Resultados e Resultados Representante
As observações clínicas e comportamento são realizadas antes da cirurgia e depois gravados nos Dias 1 a 7 e semanalmente até ponto final de acordo com o desenho do estudo. Os dados comportamentais são coletadas para avaliar morbidade neurológica, como descrito anteriormente 6. Função sensorial é avaliada pela presença ou ausência de uma resposta de retirada do estímulo mecânico para os dedos dos membros anteriores e posteriores. Função motora segue o índice de Tarlov (Tabela 1): 0 - Paralisia, nenhum movimento; 1 - Tônus perceptível nas patas traseiras, m ligeiraovement; 2 - Movimento nas patas traseiras, mas incapaz de se sentar ou ficar; 3 - Capacidade de ficar de pé e andar, mas atáxica e por períodos curtos, 4 - A recuperação completa, a função motora normal.
Segurança do processo é determinada pela capacidade de um animal para retornar à linha de base pré-cirúrgica. Déficits neurológicos transitórios deve principalmente resolver entre pós-operatórias dias 1 e 7, com algumas variações dependendo das raças animais e procedimento (número de injeções, entre outros parâmetros). Morbidade permanente é definida pela duração défices neurológicos que não se resolvem no momento em que os animais atingem ponto de extremidade padrão IACUC (Figura 2).
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Representative Results
| Pontuação Tarlov | |
| 0 | Paralisia, nenhum movimento |
| 1 | Tônus perceptível nos membros posteriores, o movimento ligeiro |
| 2 | Movimento nas patas traseiras, mas incapaz de se sentar ou ficar |
| 3 | Capacidade de ficar de pé e andar, mas atáxica e por curtos períodos |
| 4 | A recuperação completa, a função normal do motor |
Tabela 1. Pontuação Tarlov. Morbidade neurológica e de recuperação é avaliado pela pontuação da função motora do animal.
Figura Posicionamento Tabela 1. Para procedure. Os animais são colocados em decúbito ventral sobre uma armação personalizado criado para simular posicionamento do paciente na mesa cirúrgica Jackson espinhal. O quadro utiliza correias ajustáveis que são colocados sob o peito e pélvis do animal, permitindo que o abdómen para pendurar livre e, portanto, minimizar a pressão no abdómen e no tórax e consequente sangramento venoso epidural. O quadro também fornece a imobilização externa da coluna para o procedimento.
Figura 2. Avaliação da Função Motora e resultados representativos. Animais submetidos a um exame neurológico geral antes da cirurgia e em uma base regular, após a recuperação completa do procedimento. Marcha e função motora são avaliados de acordo com o índice de Tarlov. Esta escala fornece critérios objetivos avaliar a capacidade dos animais de deambular como um surromedida portão da função motora. Segurança do processo é determinada pela capacidade de um animal para retornar à linha de base pré-cirúrgica. Déficits neurológicos transitórios deve principalmente resolver entre pós-operatórias dias 1 e 7, com algumas variações dependendo das raças animais e procedimento (número de injeções, entre outros parâmetros). Morbidade permanente é definida pela duração de déficits neurológicos que não se resolvem pelo tempo animais atingem ponto de extremidade padrão IACUC.
Suplementar
No caso das terapias celulares, antes do laminectomia e sob anestesia, um cateter da veia jugular crónica 10F (tecnologias de acesso, CCPS072106A) está colocado para a administração intravenosa de imunossupressores para a duração do estudo. O pescoço do animal é preparado e coberto. A veia jugular interna é exposta cirurgicamente e canulada com o cateter, o qual é fixado com um laço de seda 3-0. A extremidade proximal da veia jugular interna é an ligada com uma gravata de seda 3-0. Em seguida, o cateter é canalizado para fora da pele dorsal do pescoço e presa com 3-0 pontos de nylon. Finalmente, a ferida é irrigada e fechou com um ponto de nylon execução 3-0. Este procedimento não é necessário nos seres humanos.
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Discussion
Apesar da aprovação para prosseguir com a técnica descrita em humanos 7-9, questões críticas ainda precisam ser respondidas para que terapias da medula espinhal para o sucesso. A compreensão rigorosa de tolerância da medula espinhal para injeção intraparenquimatosa é necessária para permitir o planejamento ea execução de ensaios de desenvolvimento de terapias para desmielinizante, degenerativa e doença medular traumática. Actualmente, não existe uma compreensão clara do número de injecções que o cabo de mamíferos grandes espinhal pode tolerar sem morbidade transitória e permanente. De modo semelhante, o espaçamento das injecções é susceptível de afectar a morbidade. Além disso, macroscópicos (por exemplo, ventilação ou relacionadas com o movimento do paciente involuntário) e microscópica (ou seja, a oscilação tanto com ventilação e pulso cardíaco), os movimentos da medula espinhal representar riscos para a medula espinhal durante a injeção. Uma compreensão do limite de morbidade em um modelo animal de grande porte vai ajudardosagem cálculos para todos os programas de terapia da medula espinhal. Nosso translacional medula espinhal transplante laboratório está disponível para ajudar os programas de desenvolvimento pré-clínicos de todas as equipes atualmente projetar ensaios para a aplicação da medula espinhal.
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Disclosures
Dr. Boulis é o inventor de dispositivos que permitem a injecção segura e precisa da medula espinhal humana. Neuralstem, Inc. adquiriu uma licença exclusiva para essa tecnologia. Dr. Boulis recebeu partes um inventários de esta taxa, e tem os direitos sobre o pagamento de royalties para a distribuição desta tecnologia. Outros autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Divisão de Emory University of Animal equipe recursos para a assistência veterinária. Fontes de financiamento incluem: ALS Association, Departamento de Defesa, e Neuralstem, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spinal Derrick | Neuralstem, Inc. | Neuralstem, Inc. has purchased an exclusive license to this technology | |
| MINJ-PD Microinjector pump | Tritech Research, Inc. | Customized for this specific application | |
| Floating Cannula | Neuralstem, Inc. | Custom-designed for this specific application |
References
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- Riley, J., et al. Targeted spinal cord therapeutics delivery: stabilized platform and microelectrode recording guidance validation. Stereotact. Funct. Neurosurg. 86, 67-74 (2008).
- Federici, T., Riley, J., Park, J., Bain, M., Boulis, N. Preclinical safety validation of a stabilized viral vector direct injection approach to the cervical spinal cord. Clin. Transl. Sci. 2, 165-167 (2009).
- Riley, J. P., Raore, B., Taub, J. S., Federici, T., Boulis, N. M. Platform and Cannula Design Improvements for Spinal Cord Therapeutics Delivery. Neurosurgery. 69, 147-154 (2011).
- Riley, J., et al. Cervical spinal cord therapeutics delivery: preclinical safety validation of a stabilized microinjection platform. Neurosurgery. 65, 754-761 (2009).
- Raore, B., et al. Cervical multilevel intraspinal stem cell therapy: assessment of surgical risks in Gottingen minipigs. Spine. 36, 164-171 (2011).
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