Summary
Короткие визуальное описание хирургической техники и устройств, используемых для доставки (генной и клеточной) терапии в спинной мозг. Методика демонстрируется на животных, но вполне переводимые и в настоящее время используются для человека приложений.
Abstract
Это компактное визуальное описание комбинация хирургического метода и устройства для доставки (генной и клеточной) терапии в спинной мозг. Хотя этот метод показал у животных, процедура FDA одобрен и в настоящее время используются для трансплантации стволовых клеток в спинной мозг пациентов с БАС. В то время как FDA признало доказательством правильности принципа данные о терапевтической эффективности в сильно отличаются модели грызунов, использования крупных животных считается критическим для проверки сочетание хирургической процедуры, устройства и безопасности окончательное терапия для человека . Размер, анатомии и общей уязвимостью позвоночника и спинного мозга свиньи признаны лучшей моделью человека. Кроме того, хирургический процесс выявления и манипулирования спинного мозга, а также закрытие ран у свиней практически не отличается от человеческого. Мы считаем, что здоровая модель свиньи представляет собой критическоекал первым шагом в исследовании процессуальных безопасности.
Protocol
1. Использование животных
Процедуры показано здесь были одобрены Университета Эмори Институциональные уходу и использованию животных комитета (IACUC). Женский Геттингене minipigs весом примерно 15-20 кг используются.
2. Анестезия
Животные голодали около 12 часов до операции. Седации и анестезии животных индукции состоит из коктейля из внутримышечных кетамина (35 мг / кг), Ацепромазин (1,1 мг / кг) и атропин (0,04 мг / кг). Животные то интубации и поддерживается на кислород и 1-3% изофлурана общим наркозом. На данный момент, спину и голову каждого животного побрился. Глубина наркоза под наблюдением ветеринарного персонала. Отсутствие межпальцевые, роговицы и глазных рефлексов, а также сердца и частоты дыхания, пульсоксиметрии, прямое / косвенное давление, в конце выдоха углекислый газ измерений, и мышечный тонус / ответ на вредные стимулы используются, чтобы контролировать глубину анестезии.
3. Позиционирование
Животные взяты в операционный зал и помещают в положении лежа на раме специально созданных для имитации пациентов позиционирования на Джексона спинного операционном столе. Кадр используется регулируемая стропа, которые размещаются под грудью и таза животного, позволяя животу свободно свисать и, следовательно, снижая давление на живот и грудь, и, как следствие венозного кровотечения эпидуральной (рис. 1). Рама также обеспечивает внешнюю иммобилизацию позвоночника для процедуры 1.
Кроме того, животные размещаются на нагретой рециркуляции площадку для поддержания температуры тела и краевую вену уха катетер для жидкости администрация и все необходимые доставки лекарственных средств во время операции. И, наконец, хирургическое поле нацелен с алкоголем и Chlorhexadine или Бетадин раствор и хирургические простыни находятся на операционном поле.
ле "> 4. ЛаминэктомияПримерно 10-15 см разрез кожи выполняется, и мускулатура параспинальных рассечена от позвоночника на двусторонней основе. Далее, спинной многоуровневый ламинэктомия не выполняется. Пластинки и остистого отростка позвонка из трех вышележащих С3-С5 или L2-L4 сегментов удаляются с помощью rongeurs и хирургической дрели.
5. Размещение спинного Derrick
Мы призываем спинного Derrick устройство, предназначенное для доставки (генной и клеточной) терапии в спинной 2-5 мозга. Детальное обсуждение по проектированию и эволюции этого устройства можно найти на Райли и соавт., 2011 4.
Для обеспечения безопасности устройство для пациента, чрескожная сообщения размещаются по 1 см разрез кожи выше и ниже основной разрез и крепится к пластинке выше и ниже основной разрез.
Далее, два встроенных ретракторы крепятся к лУра чрескожной сообщений выше и ниже разреза, чтобы открыть область позвоночника, который претерпел ламинэктомия.
6. Открытие Dural
С помощью Вудсон стоматологических инструментов и 11 лезвие, 2,5 см надрез через твердую мозговую оболочку, обнажив спинного мозга. Длительность отражается от мягкой мозговой оболочки 4-0 слоя с помощью шовного Nurolon и крепится к глубокой параспинальных мускулатуры.
Хирургическое пирожки помещаются в ростральной и каудальной крайности открытия. Они обеспечивают частичный барьер для потока цереброспинальной жидкости, а также обеспечить безопасную мишень для хирургов, чтобы разместить присоски без повреждения мозга. В людях, в хирургическое увеличение микроскопа, мягкой мозговой оболочки поверхность расчленена на данный момент. Из-за технических ограничений, эта процедура не требуется, или возможно у животных.
7. Инъекции спинного мозга и бокового смещения спинного Derrick для дополнительных инъекцийс
Непосредственно перед инъекциями, болюс метилпреднизолона (125 мг, IV) дается, чтобы предотвратить отек спинного мозга.
На данный момент, система железнодорожных платформ крепится и боковые направляющие регулируются по размеру соответствующей длины. Гондолы верхний загружены на 2 бара и дисков Z устанавливается на универсальный шарнир. Далее, канюли загруженных помещается на Microdrive. Используя универсальный шарнир на микроинъекции платформы, корональной и сагиттальной углы корректируются для обеспечения траектории ортогональных поверхности спинного инъекций следуют размещение канюли. Игла расположена соответственно медиальным к спинной зоне ввода корневого (DREZ). DREZ определяется в 3,5 раза хирургическое увеличение лупы и проникли на ортогональные траектории к поверхности кабеля в точке <1 мм медиально.
У людей, дооперационной МРТ обеспечивает базовую оценку оF спинного размеры шнур для оперативного планирования. Кроме того, толщина спинного мозга измеряется для определения глубины цели вентральной рога.
Подвеска вливается на глубине 4 мм от мягкой мозговой оболочки контакт. Фланец из пластика Ultem служит пробкой на поверхность мягкой, чтобы игла от продвижения глубже, чем хотелось бы. Как только кончик иглы расположен на цель, жесткой наружной металлической втулки остановился, оставив гибкий шланг подвергается. После инъекции завершен, игла остается на месте еще в течение 1 мин, чтобы предотвратить клетки рефлюкса до урочища инъекции канюли.
Принимаются меры, чтобы избежать поверхности сосудистой, слегка регулировки Microdrive либо асимметрия или ростро-каудально. Некоторое кровотечение от проникновения сайтов может произойти. Когда такое кровотечение встречается, микро котлеты кладут на место прокола кровотечения и всасывания к ним применяется для отвода крови из канюли penetrСайт ATION и предотвратить накопление в мозге. Это надежно позволяет крови свертываться. Прижигание можно избежать как прямое давление.
После удаления игл, стереотаксического аппарата перемещается на следующий участок мишени вдоль ростро-каудальной оси, разделенных на 2 или 4 мм или по мере необходимости, чтобы избежать видимых кровеносных сосудов на дорсальной поверхности спинного мозга. Этот процесс повторяется столько раз, сколько предложенная в данном исследовании.
8. Плавающие Канюля
Пользовательские канюли вливания узкого диаметра используются для инъекций. Канюля состоит из 30-калибровочного скошенной иглой фиксированной длины подключенного к 30-калибровочного гибкие силиконовые трубки переменной длины. Дистального конца оснащено замком Luer Гамильтон, который присоединен к насосу микроинъектор. Проксимального силиконовые Трубки ensheathed в течение 24-калибровочного жесткой наружной канюли, что места на ближнем конце фланец иглы для инъекций. Этот фланец оба сиденьявнешней канюли и служит ограничителем глубины для инъекционной иглой. Для каждой инъекции, соответствующий объем терапевтических подвески учитывающей использованием предварительно калиброванного Minj-PD микроинъектор насоса (Tritech Research, Inc, Лос-Анджелес, Калифорния) со скоростью 5 мкл в минуту.
9. Закрытие
После того как все инъекции были сделаны, спинной вышки мягко удаляют и разрезы закрыты в четыре слоя. Оболочки закрывают на 4,0 Nurolon стежок, в моде водонепроницаемыми. 0 Викрил шов используется для глубокого мышечного слоя. Фасции затем закрывается с 0 Викрил шва также в моде водонепроницаемыми. Кожный слой окончательно закрыта с 2,0 Викрил, с запущенным строчки. Кожа закрытие выполняется с использованием 3-0 нейлоновые нити.
10. Восстановление и лечения боли
Животные экстубации и контролируется в течение 2 ч после восстановления анестезии. Затем животных перевели в отдельных Свозрастов и мониторинг по крайней мере, один раз в день для употребления в пищу, дефекация, и мочеиспускание.
Для лечения боли, пластырь фентанила (75 мкг) сшивается на задней животных в течение трех дней послеоперационного обезболивания. Кроме того, бупренорфин (0,05 мг / кг, BID, IM) также может быть предоставлена на срок до трех дней после операции.
11. Результаты и представитель результаты
Клинические наблюдения и поведения осуществляется до операции и затем записываются в дни с 1 по 7 и еженедельно до конечной точки в соответствии с дизайном исследования. Поведенческие сбор данных для оценки неврологических заболеваний, как описано выше 6. Сенсорная функция оценивается по наличию или отсутствию выводу ответ на механическое стимулом для ног передних и задних конечностей. Двигательная функция следит за счет Tarlov (табл. 1): 0 - Паралич, никакого движения, 1 - заметный тонуса в задних конечностях, легкое мovement, 2 - движение в задних конечностях, но не в состоянии сидеть или стоять, 3 - способность стоять и ходить, но атаксическая и для коротких периодов; 4 - Полное восстановление нормального функционирования двигателя.
Безопасность процедуры определяется способностью животного, чтобы вернуться в дооперационном линии. Переходный неврологического дефицита должно главным образом решить между послеоперационных дней 1 и 7, с некоторыми вариациями в зависимости от животных породы и процедуры (количество инъекций, среди прочих параметров). Постоянный заболеваемости определяется прочного неврологические дефициты, которые не разрешить по времени животные достигают IACUC конечной точки по умолчанию (рис. 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
| Оценка Tarlov | |
| 0 | Паралич, никакого движения |
| 1 | Заметный тонуса в задних конечностях, легкое движение |
| 2 | Движение в задних конечностях, но не в состоянии сидеть или стоять |
| 3 | Возможность стоять и ходить, но атаксическая и в течение короткого периода |
| 4 | Полное восстановление нормального функционирования двигателя |
Таблица 1. Tarlov оценка. Неврологической заболеваемости и восстановления оценивается, забив двигательной функции животных.
Рисунок 1. Таблица позиционирования для Procedurе. Животных помещали в положении лежа на раме специально созданных для имитации пациентов позиционирования на Джексона спинного операционном столе. Кадр используется регулируемая стропа, которые размещаются под грудью и таза животного, позволяя животу свободно свисать и, следовательно, снижая давление на живот и грудь, и, как следствие эпидуральной кровотечение вен. Рама также обеспечивает внешнюю иммобилизацию позвоночника для данной процедуры.
Рисунок 2. Motor оценки функций и представитель результатов. Животные проходят общие неврологическое обследование перед операцией и на регулярной основе после полного восстановления после процедуры. Походка и моторной функции оцениваются по шкале Tarlov. Эта шкала дает объективные критерии оценки способности животных к передвигаться в качестве суррогатныхВорота меру двигательной функции. Безопасность процедуры определяется способностью животного, чтобы вернуться в дооперационном линии. Переходный неврологического дефицита должно главным образом решить между послеоперационных дней 1 и 7, с некоторыми вариациями в зависимости от животных породы и процедуры (количество инъекций, среди прочих параметров). Постоянный заболеваемости определяется прочного неврологические дефициты, которые не разрешить по времени животные достигают IACUC конечной точки по умолчанию.
Дополнительный
В случае клеточной терапии, до ламинэктомии и под наркозом, яремную вену катетер 10F хронический (Access Technologies, CCPS072106A) помещают для внутривенного введения иммунодепрессантов в течение всего срока исследования. Шее животного нацелен и задрапированы. Внутренней яремной вены подвергается хирургическим путем и канюли с катетером, который крепится с 3-0 шелковый галстук. Проксимального конца внутренней яремной являетсяп лигировали с 3-0 шелковый галстук. Затем катетер туннель из кожи шеи сверху и закрепляется 3-0 нейлоновые швы. Наконец, рана орошаемых и закрылся с запущенным 3-0 нейлона строчки. Такая процедура не требуется в людях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Несмотря на утверждения приступить к описанной методики в организме человека 7-9, важные вопросы остаются без ответа для того, чтобы спинного терапии шнур для достижения успеха. Строгое понимание толерантности спинного шнур к интрапаренхимальные инъекции необходимы для обеспечения планирования и выполнения испытаний для разработки методов лечения демиелинизирующих, дегенеративных и травматических болезни спинного мозга. В настоящее время нет четкого понимания количества инъекций, что большая млекопитающих спинного мозга могут терпеть без преходящих и постоянных заболеваемости. Кроме того, расстояние между инъекциями может повлиять заболеваемости. Кроме того, макроскопические (например, вентиляции или косвенно связанные с непреднамеренным перемещением пациента) и микроскопические (т. е. колебаний с обеих вентиляции и сердечного импульса) спинного движения шнура представлять угрозу для спинного мозга во время инъекции. Понимание порог заболеваемости в большой модели животных поможетдозирования расчеты для всех программ терапии спинного мозга. Наше поступательное спинного мозга трансплантации лаборатории доступны, чтобы помочь доклинических программ развития всех команд в настоящее время разрабатывает испытаний для спинного применение шнура.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Доктор Boulis является изобретателем устройства для обеспечения безопасного и точного введения спинного мозга человека. Neuralstem, Inc приобрела эксклюзивную лицензию на эту технологию. Доктор Boulis получил долю Invento в этой платы, и имеет право на роялти за распространение этой технологии. Другие авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Эмори отдела университета сотрудники животных ресурсов для ветеринарной помощи. Источники финансирования включают в себя: ALS ассоциации, министерства обороны, и Neuralstem, Inc
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spinal Derrick | Neuralstem, Inc. | Neuralstem, Inc. has purchased an exclusive license to this technology | |
| MINJ-PD Microinjector pump | Tritech Research, Inc. | Customized for this specific application | |
| Floating Cannula | Neuralstem, Inc. | Custom-designed for this specific application |
References
- Usvald, D., et al. Analysis of dosing regimen and reproducibility of intraspinal grafting of human spinal stem cells in immunosuppressed minipigs. Cell Transplant. 19, 1103-1122 (2010).
- Riley, J., et al. Targeted spinal cord therapeutics delivery: stabilized platform and microelectrode recording guidance validation. Stereotact. Funct. Neurosurg. 86, 67-74 (2008).
- Federici, T., Riley, J., Park, J., Bain, M., Boulis, N. Preclinical safety validation of a stabilized viral vector direct injection approach to the cervical spinal cord. Clin. Transl. Sci. 2, 165-167 (2009).
- Riley, J. P., Raore, B., Taub, J. S., Federici, T., Boulis, N. M. Platform and Cannula Design Improvements for Spinal Cord Therapeutics Delivery. Neurosurgery. 69, 147-154 (2011).
- Riley, J., et al. Cervical spinal cord therapeutics delivery: preclinical safety validation of a stabilized microinjection platform. Neurosurgery. 65, 754-761 (2009).
- Raore, B., et al. Cervical multilevel intraspinal stem cell therapy: assessment of surgical risks in Gottingen minipigs. Spine. 36, 164-171 (2011).
- Boulis, N. M., et al. Translational stem cell therapy for amyotrophic lateral sclerosis. Nat. Rev. Neurol. , (2011).
- Riley, J., et al. Intraspinal Stem Cell Transplantation in ALS: A Phase I Safety Trial, Technical Note & Interim Safety Outcomes. Neurosurgery. 71 (2), 405-416 (2012).
- Boulis, N. M., et al. Lumbar intraspinal injection of neural stem cells in patients with ALS: results of a Phase I trial in 12 patients. Stem Cells. 30 (6), 1144-1151 (2012).
