Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

العزلة، وتوصيف المقارن التمييز بين الخلايا الجذعية البشرية الأسنان اللب المستمدة من الأسنان الدائمة باستخدام طريقتين مختلفتين

Published: November 24, 2012 doi: 10.3791/4372
Automatic Translation
1, 1, 2
1Department of Stem Cells and Developmental Biology, Cell Science Research Center, Royan Institute for Stem Cell Biology and Technology, ACECR, Tehran, Iran, 2Department of Endocrinology & Female Infertility, Reproductive Biomedicine Center, Royan Institute for Reproductive Biomedicine, ACECR, Tehran, Iran

Summary

وصف طريقة العزلة وتوصيف الخلايا الجذعية البشرية الأسنان اللب (hDPSCs) باستخدام إما

Abstract

Introduction

الخلايا الجذعية هي خلايا مولد الرمع التي تمتلك اثنين من الميزات الرائعة، والمعروفة باسم قوة متعددة والتجديد الذاتي 15. بين جميع الخلايا الجذعية مع الفعاليات المختلفة تنسخي، وضعت الخلايا الجذعية الأسنان والخلايا الجذعية بعد الولادة الاهتمام في السنوات الأخيرة بسبب إمكانية الوصول إليها، اللدونة، وقدرة عالية التكاثري بالمقارنة مع غيرها من الخلايا الجذعية البالغة 16. مميز، على غرار الخلايا الجذعية الوسيطة، طب الأسنان الخلايا الجذعية هي لب الخلايا الملتصقة مولد الرمع التي لها قدرة التمايز متعددة في اللحمة المتوسطة و / أو غير اللحمة المتوسطة الأنساب، سواء في التجارب المختبرية والحية. يتم تحديد 1-8،17،18 DPSCs من قبل من التعبير السلبي للمستضدات المكونة للدم (مثل CD45، CD34، CD14)، والتعبير الإيجابي للCD90، CD29، CD73، CD105، CD44 وSTRO 1-. 19،20

من السهل الحصول عليها مع احتمال الألم والمرض جعل الحد الأدنى DPSCs الإنسان باعتبارها valuمصدر من اللجان الدائمة قادرة بالمقارنة مع مصادر العادية، مثل خلايا نخاع العظام الجذعية الوسيطة 21. بشكل عام، تم عزلها من قبل أي من DPSCs طريقة ثمرة، أي هجرة الخلايا الجذعية من الأنسجة إإكسبلنتس اللب (DPSC-OG) 22-24، و / أو عن طريق الهضم الأنزيمي (DPSC-ED) 4،6،25. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن طريقة العزل وظروف التربية يمكن أن تحدث السكان تحت الأنساب مختلفة أو في الممرات المختبر 26،27. في حالة الأسنان الدائمة (pDPSCs)، كشفت هوانغ آخرون أن الأنزيمية pDPSCs هضمها وارتفاع احتمال انتشار بالمقارنة مع DPSCs تجاوزت 26 وعلاوة على ذلك، في حالة الأسنان اللبنية (dDPSCs)، وقد تبين أن STRO-1 و CD34 وأعرب علامات اكثر في dDPSC-ED بالمقارنة مع dDPSC-OG. وبالإضافة إلى ذلك، عرض dDPSC-ED أعلى معدل تمعدن العظم في المتوسط ​​/ odonto تعريف 27 لذلك، ونظرا لإمكانية ممتازة من DPSCs في مجال البحثالطب egenerative، وسوف تكون هناك حاجة لمزيد من الدراسات لفهم أفضل لمختلف السكان المحتملة التي هي مستمدة من أساليب العزل المختلفة.

هنا، كان محاولة لإدخال طريقة سهلة لاستخراج اللب، وذلك باستخدام خطوة واحدة القرص الماس الأسنان لتسهيل عملية استخراج اللب. وعلاوة على ذلك، بعد عزل الخلايا الجذعية البشرية المستمدة من اللب من خلال تطبيق أساليب ED أو OG، كما تم بحث خصائص وقدرات عامة التفريق بين مجموعتين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الحل والمتوسطة إنزيم انتشار (PM)

  1. جعل نوع كولاجيناز I الحل: زن من نوع I كولاجيناز (12 ملغ / مل) وتذوب في 1 مل PBS باستخدام فلتر وحقنة ميكرون 0،2 التصفية. ثم ضع على بعد 15 مل أنبوب وابقائه في -20 درجة مئوية حتى الحاجة.
  2. جعل الحل dispase: زن من dispase (16 ملغ / مل) وتذوب في 1 مل PBS باستخدام فلتر وحقنة ميكرون 0،2 التصفية. ثم ضع على بعد 15 مل أنبوب ويبقيه عند 4 ° C لحين الحاجة إليها.
  3. جعل الحل انزيم: إضافة 1 مل كولاجيناز نوع I حلول (12 ملغ / مل) و 1 مل حلول dispase (16 ملغ / مل) في 2 مل العقيمة PBS تحتوي على 100 ​​ملغ / مل البنسلين، 100 ملغ / مل الستربتوميسين. يجب التركيز الكلي للdispase وكولاجيناز I في الحجم النهائي من 4 ملغ / مل و 3 ملغ / مل، receptively. ثم، قسامة في هذا المجلد إلى أربعة أنبوب 15 مل، تحتوي كل منها على انزيم 1 مل الحل. ويمكن استخدام كل أنبوب الهضم لولب 1.
  4. جعل غسل الحل: إضافة 100 ملغ / مل البنسلين، 100 ملغ / مل الستربتوميسين في برنامج تلفزيوني.
  5. جعل وسائل الإعلام الأساسية: ألفا تعديل النسر المتوسط ​​(α-MEM) تستكمل مع FBS 10٪ و 100 وحدة / مل البنسلين، 100 ملغ / مل الستربتوميسين.
  6. جعل وسائل الإعلام انتشار (PM): ألفا تعديل متوسطة النسر (α-MEM) تستكمل مع 10٪ FBS، 100 ميكرومتر L-حمض الاسكوربيك 2-الفوسفات، 2 مم L-الجلوتامين، 100 وحدة / البنسلين مل، 100 ملغ / مل الستربتوميسين، 0.25 ملغ / مل الأمفوتريسين B.
  7. جعل وسائل الإعلام سنية المنشأ: ألفا تعديل متوسطة النسر (α-MEM) تستكمل مع 10٪ FBS، 100 ميكرومتر L-حمض الاسكوربيك 2-الفوسفات، 2 مم L-الجلوتامين، 100 وحدة / البنسلين مل، 100 ملغ / الستربتوميسين مل، 0.01 ميكرومتر ديكساميثازون، 5 ملي β-الجلسرين الفوسفات، 1.8 ملي Monopotassium الفوسفات.

2. إعداد الإنسان الأنسجة لب الأسنان للأسنان اللب الجذعية Isolatio الخليوين

  1. تم جمع الرحى الثالثة العادية الإنسان من البالغين (21-29 عاما) في عيادة الأسنان من الإمام علي في إطار مجلس المراجعة المؤسساتي المعتمدة (IRB).
  2. وضعت الأسنان في وسط قاعدي (α-MEM تستكمل مع FBS 10٪) ونقلت إلى مختبر في C. ° 4
  3. تحت شرط العقيمة، والعمل داخل غطاء تدفق الصفحي بيولوجية، وانشاء يبذل أي 100 ملم أطباق بتري لكل الأسنان التي سيتم تجهيزها. تم تنظيف أسطح الأسنان من الايثانول 70٪.
  4. بينما كان يعمل في واحدة من الأطباق بيتري،، أبقى الأسنان عن طريق ملقط الأسنان، وكان يستخدم شفرة مشرط لتنظيف قبالة الرباط اللثة والحطام على الجذور.
  5. وقطعت ببطء الموصل المينائي الملاطي باستخدام قرص تعقيم الأسنان للكشف عن غرفة اللب. وينبغي النظر إلى أن يجب إجراء عملية القطع ببطء للحد من ارتفاع درجة حرارة الأنسجة الأسنان.
  6. تم فصل بلطف الأنسجة اللب من التاج والجذر. تم قطع الأنسجة اللب إلى قطع صغيرة مع المعونة من شفرة المشرط.

3. الإنسان عزل لب الأسنان

  1. خضع أنسجة اللب إما التفكك الأنزيمية من الأنسجة أو اللب المباشر ثمرة الخلية من الأنسجة إإكسبلنتس اللب لعزل hDPSCs.
  2. الأنزيمية تفكك النسيج اللب:
    1. تم نقل قطع صغيرة من أنسجة اللب إلى حل لإنزيم 1 ساعة في C. ° 37 دوامة كل 30 دقيقة للمساعدة في كسر الأنسجة.
    2. بعد ذلك، تم إزالة الركام الخلية الكبيرة والتي تم الحصول عليها وحيدة الخلية تعليق عن طريق تمرير الخلايا من خلال مصفاة الخلية 70-ميكرومتر.
    3. تم طرد وحيدة الخلية تعليق في 1200 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    4. وpipetted بعناية قبالة Supernatants وكان بيليه إعادة علقت في 1 مل انتشار المتوسطة (PM). (ملاحظة: FBS المتوسطة في انتشار إنهاء الأنزيمية ديستكوين الجمعيات.)
    5. كان المصنف وحيدة الخلية تعليق من لب الأسنان إلى 25 قارورة سم 2 مع الثقافة PM ثم حضنت في C ° 37 في 5٪ CO 2.
    6. تم تغيير ثقافة المتوسط ​​كل ثلاثة أيام حتى تم تحقيق confluency الخلية.
  3. ثمرة مباشرة من خلية الأنسجة إإكسبلنتس اللب:
    1. ومفروم الأنسجة اللب إلى 1-2-مم شظايا، ووضع كل قطعة في 25 سم، وقوارير الثقافة PM 2 مع وحضنت ثم في 37 ° C CO في 5٪ 2. وينبغي النظر إلى أن الحجم الكلي للPM ثمرة لخلية يجب أن يعتمد المرفق من قطع اللب للثمرة خلية أخرى (2-3 مل لكل دورق).
    2. تم تغيير المتوسطة لوحظ بعد ثمرة.
    3. كانت الخلايا تجاوزت في التقاء شبه مثقف في نسبة 1:4 (مرور 1).

4. المناعي الظاهري

  1. 250،000 خلية /وحضنت أنبوب من كلا النوعين من الخلايا في مرور 3 قبل PE أو FITC، مترافق المضادة للأضداد الإنسان مع isotypes لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية في مكان مظلم. (ملاحظة: تم تطبيق تركيز الأجسام المضادة وفقا لبروتوكول تصنيع)
  2. بعد فترة حضانة، وإضافة 100 ميكرولتر PBS أو التخفيف FACS حل لكل أنبوب الطرد المركزي في 1200 ودورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في مكان مظلم.
  3. تمت إزالة Supernatants وكانت الكريات إعادة علقت في 100 ميكرولتر PBS أو التخفيف FACS في مكان مظلم.
  4. وجرى تقييم علامات سطح المستهدفة (علامات CD) من قبل FACSCalibur BD.

5. تحريض من التمايز إلى خلايا DPSCs ممعدن وكميا الفحص الصبغ الأحمر الأحمر S

  1. كانت DPSCs التي تم الحصول عليها من قبل أي من التفكك الأنزيمية من الأنسجة اللب (المعروف باسم DPSC-ED)، أو ثمرة مباشرة من خلية الأنسجة إإكسبلنتس اللب (DPSC-OG) شبه مثقف لمدة 3 مقاطع.
  2. Aور مرور 3، البذور الخلايا في لوحة 6 جيدا في 5،000 خلية / جيدا.
  3. في التقاء 60٪، استعيض سنية المنشأ المتوسط ​​عن طريق PM التقليدية. وبقيت ثلاثة آبار كعنصر تحكم سلبية بإضافة المتوسطة النمو.
  4. متوسطة تغيير كل 3 أيام حتى 21 يوما.
  5. في يوم 21، تم غسلها مع خلايا PBS وكانت ثابتة بنسبة 1 مل / 10٪ بارافورمالدهيد جيدا لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  6. ثم تم إيقاف pipetted بارافورمالدهيد، وكانت تغسل بعناية الخلايا 3 مرات (5-10 دقيقة في كل مرة) مع المقطر O. 2 H (ملاحظة: تجنب تعكير أحادي الطبقة.)
  7. بعد الغسيل، وأضيفت 1 مل / S جيدا الصبغ الأحمر الأحمر لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  8. تم غسلها من قبل خلايا منزوع الأيونات H 2 O أربع مرات (5 دقائق في كل مرة مع هزاز لطيف) لإزالة أي الصبغ الأحمر أحمر إضافية.
  9. تم إضافة 1 مل / O 2 H جيدا لمنع الخلايا من التجفيف.
  10. كان يفترض لوحات لانس البصريةpection و / أو الحصول على الصور.
  11. لفحص الصبغ الأحمر الأحمر الكمي S، تم استبدال H 2 O بنسبة 1 حمض الخليك مل 10٪ إلى كل بئر من لوحة 6 جيدا واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز.
  12. ثم، كان أحادي الطبقة خلية / جيدا كشط ونقلت كل من حامض الخليك والخلايا في أنابيب منفصلة 1،5 مل الطرد المركزي الصغيرة. (ملاحظة: يجب أن يكون كل بئر نقل إلى أنبوب منفصل الآبار أي اختبار الثلاث والآبار الثلاث لمراقبة لكل الجماعات ED & OG)
  13. وvortexed أنابيب بقوة لمدة 30 ثانية.
  14. الحرارة إلى 85 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. (ملاحظة: لتجنب التبخر، تم اغلاق أنابيب مع parafilm.)
  15. بعد التسخين، تم نقل الأنابيب إلى الجليد لمدة 5 دقائق. (ملاحظة: يجب أن لا يتم فتح أنابيب حتى تصبح تبريده.)
  16. تم طرد وعجائن 20000 XG في مدة 15 دقيقة. بينما الطرد المركزي، أدلى الصبغ الأحمر معايير الأحمرحتى.

تم إعداد معيار الأليزارين الأحمر S من تمييع لأول مرة العازلة تخفيف وتستخدم لصنع أضعاف التخفيفات 2-المسلسل استنادا إلى الجدول.

ارتفاع تركيز مجموعة من صبغ انخفاض تركيز مجموعة من صبغ
2 مم 1 ملم 500 ميكرومتر 250 ميكرون 125 ميكرومتر 62،5 ميكرومتر 31،3 ميكرومتر 15،6 ميكرومتر 7،8 ميكرومتر 3،9 ميكرومتر 1،9 ميكرومتر 0،9 ميكرومتر 0.4 ميكرومتر فراغ
  1. بعد الطرد المركزي، تم نقل 1 مل من طاف / أنبوب جديد مستقل في الدقيقة 1،5 أنابيب الطرد المركزي مل.
  2. تم تحييد الحموضة مع ميكرولتر 375 ~ 10٪ هيدروكسيد الأمونيوم في الأنبوب. (ملاحظة: يجب أن تكون درجة الحموضة 4،1-4،5 الغضب.)
  3. وأضيفت 150 ميكرولتر من ستاندرد آند عينات (بما في ذلك اختبارات منفصلة والضوابط) إلى أسفل، مبهمة الجدران شفافة 96-وحة جيدا.
  4. تم قراءة الامتصاصية في 405 نانومتر وتمت مقارنة القيم OD من عينات قياسية مع مؤامرة لمزيد من التحليل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

  1. وتظهر DPSCs التي تم الحصول عليها من التفكك الأنزيمية (DPSC-ED) هنا في يوم 10، 15،18 (الشكل 1). المستعمرات بدأت لتشكيل تقريبا على 3 إلى 5 أيام بعد العزلة.
  2. وتظهر DPSCs تجاوزت (DPSC-OG) في الشكل 2 في يوم 5، 10، 13 و 18. الخلايا الليفية مثل الخلايا بدأت تهاجر من الأنسجة اللب في القارورة عن طريق طلب موازية بنحو 5 أيام بعد البذر.
  3. وترد في DPSCs مرور 3 باستخدام كلتا الطريقتين في الشكل 3. كلا النوعين من DPSCs كانت تقريبا في نفس الحجم والتشكل.
  4. المناعي الظاهري النتائج في DPSC-ED وDPSC-OG (الشكل 4). وأشارت هذه النتائج وجود علامات الوسيطة الخلايا الجذعية في مثل CD44، CD105، CD73 و CD90، وعدم وجود علامات المكونة للدم والبطانية مثل CD45، CD34 و CD11b . كانت تعابير وCD105 CD146 (حول الأوعية علامة) أكثر في DPSC-OG بالمقارنة مع DPSC-ED.كان STRO-1 السلبي في كلا المجموعتين. (ويشار إلى مجموعة خطوط زرقاء OG، في حين الخطوط الحمراء المشار إليها ED واحد، الخطوط الصفراء تشير isotypes.)
  5. وتظهر التشكل الأليزارين الأحمر S & نتائج القياس الكمي لتقييم تكوين الأنسجة المعدنية في DPSC-ED وDPSC OG-في يوم 21 في الشكل 5. اللون الأحمر أكثر امتصاص الكالسيوم أكثر ترسب. هذه النتائج تشير إلى مزيد من ترسب الكالسيوم في DPSC متباينة-ED (د) مقارنة مع DPSC-OG (ج). (ثلاث نسخ مكررات التقنية) الكمي للالصبغ الأحمر الأحمر S أشارت أيضا كبيرة (*) أعلى تركيز الصبغة بين DPSC-ED بالمقارنة مع مجموعات OG. (تركيز صبغ كما زادت بشكل ملحوظ (**، ***) بين الاختبارات وضوابط كل مجموعة (ED أو OG) التي أشارت ترسب الكالسيوم بعد عملية التمايز)

(ملاحظات: تم استخدام اختبار T-تقرن تحليل لتحديد الاختلافات فيتنتج كمية من المعادن مصفوفة ED OG والجماعات بعد تحريض تمايز. وأعرب عن النتائج على النحو يعني ± SEM. (المفترض لأهمية P <0.05)

  1. النتائج QPCR من التعبير عن الجينات ذات الصلة odontoblast والمعادن-(DSPP) و (MEPE، ALP)، على التوالي، في متباينة تظهر DPSC-ED وDPSC OG-في الشكل 6. أشارت هذه النتائج الهامة ما يصل تنظيم ALP وMEPE بعد التفريق بين الجماعات وOG ED. وفي الوقت نفسه، كانت ALP وMEPE تعبيرات متباينة أعلى بكثير في DPSC-ED مقارنة OG-DPSC متباينة. ومع ذلك، ليس هناك فرق في التعبير عن DSPP في الخلايا المتمايزة بين المجموعتين (الجينات التدبير المنزلي: 3-monooxygenase/tryptophan التيروسين 5-أكسيجيناز أحادية البروتين تفعيل (YWHAZ)) 28

(ملاحظة: تم تحليل البيانات باستخدام طريقة QPCR CT المقارنة A السلطة الفلسطينية تم استخدام اختبار T-IRED تحليل لتحديد الاختلافات في التعبير الجيني بين الجماعات وED OG قبل وبعد التمايز، وكذلك بين الخلايا المتمايزة للمجموعتين. وأعرب عن النتائج على النحو يعني ± SEM. (المفترض لأهمية P <0.05) (ثلاث نسخ مكررات التقنية)

الشكل 1
الشكل 1. DPSC فصل الأنزيمية (DPSC-ED) في يوم 10 و 15 و 18. شريط التكبير = 200 ميكرومتر.

الشكل 2
الشكل 2. DPSCs نامي أكثر من (DPSC-OG) في يوم 5، 10، 13 و 18. شريط التكبير = 200 ميكرومتر.

load/4372/4372fig3highres.jpg "/>
الشكل 3. DPSCs نامي أكثر من (DPSC-OG) والأنزيمية DPSCs هضمها (DPSC-ED) في الأشكال التضاريسية مرور 3. شريط التكبير = 200 ميكرومتر. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 4
الشكل 4. الرسم البياني مضافين من نتائج المناعي الظاهري في DPSC-ED (الأحمر الداكن) وDPSC-OG (الأزرق). (خطوط صفراء تمثل isotypes). اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

hres.jpg "/>
نتائج تلطيخ الشكل 5. الصبغ الأحمر الأحمر S متباينة في DPSC-OG (ج)، ومتباينة DPSC-ED (د) (أ) و (ب) المشار إليها عناصر التحكم. الكمي لفحص الصبغ الأحمر الأحمر S تظهر الصبغة في امتصاص أكثر متباينة DPSC-ED بالمقارنة مع مجموعة متباينة OG (ه). اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 6
الشكل 6. النتائج QPCR من التعبير عن الجينات ذات الصلة odontoblast والمعادن-(DSPP) و (MEPE، ALP)، على التوالي، في DPSC متباينة-ED وDPSC OG-. التعبير عن MEPE، ALP، وDSPP في الخلايا المتمايزة مقارنة لسيطرة أكد التفريق بين المجموعتين في odontoblast (AC). هذه صوأشار إلى esults كبيرة تصل تنظيم ALP وMEPE بعد التفريق بين الجماعات وED OG (أ و ب). وفي الوقت نفسه، كانت ALP وMEPE تعبيرات متباينة أعلى بكثير في DPSC-ED مقارنة OG-DPSC متباينة (أ و ب). ومع ذلك، ليس هناك فرق في التعبير عن DSPP في خلايا متباينة من كلا المجموعتين (ج) (الجينات التدبير المنزلي: 3-monooxygenase/tryptophan التيروسين 5-أكسيجيناز أحادية البروتين التنشيط؛ YWHAZ). اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هذا البروتوكول يصف عملية عزل وتوصيف hDPSCs من لب الأسنان باستخدام طريقتين، والتفكك الأنزيمية ثمرة مباشرة للخلايا الجذعية من الأنسجة إإكسبلنتس اللب. وبالإضافة إلى ذلك، في تمايز المختبر من هذه الخلايا في odontoblasts، تم تقييم من قبل فحص كمية الصبغ الأحمر الأحمر S & QPCR.

وقد استخدمت البروتوكولات القائمة على عزل الأنسجة اللب من الأسنان صكوك مختلفة مثل كماشة (ملقط العظام) 9، استئصال إبرة 29، مجرفة Gracey 30، الأزيز الأسنان الشق 4، الخ وهذه الأساليب هي مضيعة للوقت، في حين تنظر انخفاض مستوى ارتفاع درجة حرارة اللب عن طريق إضافة المياه بشكل مستمر. ومع ذلك، في تقنية الحالي، يتم استخدام الأسنان القرص الماس لعزل الأنسجة اللب، والذي هو وسيلة سريعة لخفض تلوث الأسنان مع الحد الأدنى من خطوة واحدة في العملية، ويقلل من ارتفاع درجة حرارة اللب أثناء عملية القطع. وعلاوة على ذلك، وhDPSCsإعادة متباينة أخيرا في odontoblasts التي تم أبدا مقارنة في حالة الأسنان الدائمة من قبل الإنسان بهدف مناقشتها. وأشار تقييم مقارن للhDPSCs متباينة (ED & OG مجموعات) من مقايسة الكمية الصبغ الأحمر الأحمر S إمكانات أعلى من تمعدن hDPSC-ED بالمقارنة مع مجموعة OG. هذه النتائج أكدت أيضا QPCR. DSPP، ALP وMEPE كما تمعدن وضع العلامات حتى التنظيم بعد التمايز العاج في كلا المجموعتين. من ناحية أخرى، كانت تعبيرات وMEPE ALP في أعلى متباينة hDPSC-ED مقارنة بالكنترول. في اتفاق مع دراسة سابقة حول الأسنان اللبنية 27، الخلايا الجذعية المشتقة من الأسنان الدائمة باستخدام أساليب العزلة أو ED OG أيضا يحمل السلوكيات التمايز مماثلة تحت نفس الظروف. وعلاوة على ذلك، لتقييم أفضل المقارنة، في هذه الدراسة، تم عزل كل من hDPSC-ED وhDPSC OG-من نفس الأفراد.

التعبير عن وضع العلامات على MSCد عدم وجود علامات heamatopietic / البطانية تحديد كلا النوعين من hDPSCs والخلايا الجذعية الوسيطة. من ناحية أخرى، كانت CD 105/146 CD أعلى في DPSC-OG بالمقارنة مع مجموعات ED. على الرغم من الأدلة القائمة وفقا لوجود STRO-1 في DPSCs 31، وأظهرت نتائجنا لا التعبير عن STRO-1 في كلا المجموعتين. ومع ذلك، قد تنوع كبير في التعبير علامة السطحية في دراسات مختلفة أن يكون نتيجة للظروف إما زراعة مثل رقم مرور وتكوينها من وسائل الإعلام، وما إلى ذلك الاختلافات بين الأفراد أو بين مختلف الجهات المانحة. قد عدم وجود STRO-1 في كل من المجموعتين إلى أن التعبير عن هذه العلامة قد لا تؤثر بشكل مباشر على إمكانات odontoblast التمايز (لا يظهر في الفيديو).

قد تختلف حالة العزلة hDPSCs جلب مختلف القدرات التمايز. قد تكون هذه الاختلافات بسبب وجود مجموعات سكانية مختلفة في أنسجة اللب. وهكذا، من طراز ميغ طرق اختيار العزلةHT تكون مفيدة لإصلاح الأنسجة المستهدفة، وتجديد محددة لنهج السريرية في المستقبل. وأشارت النتائج التي توصلنا قدرة أعلى من تمعدن الأنزيمية DPSC هضمها مقارنة مع تلك التي تجاوزت. ومع ذلك، هناك حاجة لدراسات إضافية، مثل تقييم لتشكيل هيكل أنبوبي في الجسم الحي في المختبر و، لتحديد أي من هاتين العمليتين ينطبق على العاج وظيفية / العلاجات اللب تجديد الأنسجة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نحن نعترف بامتنان الدكتورة ليلى شاكري والدكتور عارف Dournaei لرمي انتقاداتهم والسيد محمد رضا شريف خادم للدعم الفني له.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-MEM GIBCO 11900-073
Collagenase type I Sigma-Aldrich C0130-100MG
Dispase GIBCO 17105-041
Penicillin/streptomycin GIBCO 15140-122
Amphotericin B GIBCO 15290-018
Fetal Bovine serum defined (FBS) HyClone SH30070.03
L-ascorbic acid 2-phosphate Sigma A8960-5G
L-glutamine GIBCO 25030-024
Dexamethasone Sigma D4902
β-Glycerol phosphate disodium salt hydrate, BioUltra Sigma G9422-100G
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655
Osteogenesis Assay Kit Millipore PS01802031
Mouse IgG2b-PE isotype control BD pharmingen 50808088029
FITC mouse IgG2b isotype control BD pharmingen 559532
FITC mouse IgG1 κ isotype BD pharmingen 11471471
FITC/PE mouse anti-human CD34/CD45 BD pharmingen 341071
PE anti-human CD146 BD pharmingen 550315
Monoclonal mouse anti-human CD90/FITC Daka 00034418
PE mouse anti-human CD73 BD pharmingen 550257
Anti-h CD105/Endoglin PE BD pharmingen FAB10971P
PE mouse anti-human CD11b/Mac1 BD pharmingen 5553888
CD44 PE mouse anti human BD pharmingen 555479
Phosphate buffer Solution (PBS) GIBCO 003000
70-μm cell strainer Falcon 352360
0.2 μm syringe filter Millex-GV SLGV033RB
25 cm2 culture flask Sigma-Aldrich Z707481
EQUIPMENT
BD FACSCalibur BD 342975
multiskan microplate spectrophotometer Thermo scientific 51119200
Fleurcense Microscope Olympus
Flowing Software version 2.3.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Volponi, A. A., Pang, Y., Sharpe, P. T. Stem cell-based biological tooth repair and regeneration. Trends Cell Biol. 20, 715-722 (2010).
  2. Nosrat, I. V., Widenfalk, J., Olson, L., Nosrat, C. A. Dental pulp cells produce neurotrophic factors, interact with trigeminal neurons in vitro, and rescue motoneurons after spinal cord injury. Dev. Biol. 238, 120-132 (2001).
  3. Gandia, C., et al. Human dental pulp stem cells improve left ventricular function, induce angiogenesis, and reduce infarct size in rats with acute myocardial infarction. Stem Cells. 26, 638-645 (2008).
  4. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.. 97, 13625-13630 (2000).
  5. Graziano, A., d'Aquino, R., Laino, G., Papaccio, G. Dental pulp stem cells: a promising tool for bone regeneration. Stem Cell Rev. 4, 21-26 (2008).
  6. Kerkis, I., et al. Early transplantation of human immature dental pulp stem cells from baby teeth to golden retriever muscular dystrophy (GRMD) dogs: Local or systemic. J. Transl. Med. 6, 35 (2008).
  7. Onyekwelu, O., Seppala, M., Zoupa, M., Cobourne, M. T. Tooth development: 2. Regenerating teeth in the laboratory. Dent. Update. 34, 20-29 (2007).
  8. Cordeiro, M. M., et al. Dental pulp tissue engineering with stem cells from exfoliated deciduous teeth. J. Endod. 34 (08), 962-969 (2008).
  9. Pierdomenico, L., et al. Multipotent mesenchymal stem cells with immunosuppressive activity can be easily isolated from dental pulp. Transplantation. 80, 836-842 (2005).
  10. de Mendonca Costa, A., et al. Reconstruction of large cranial defects in nonimmunosuppressed experimental design with human dental pulp stem cells. J. Craniofac. Surg. 19, 204-210 (2008).
  11. Tirino, V., et al. Methods for the identification, characterization and banking of human DPSCs: current strategies and perspectives. Stem Cell Rev. 7, 608-615 (2011).
  12. Tirino, V., Paino, F., De Rosa, A., Papaccio, G. Identification, isolation, characterization, and banking of human dental pulp stem cells. Methods Mol. Biol. 879, 443-463 (2012).
  13. Eslaminejad, M. B., Vahabi, S., Shariati, M., Nazarian, H. In vitro Growth and Characterization of Stem Cells from Human Dental Pulp of Deciduous Versus Permanent Teeth. J. Dent. (Tehran). 7, 185-195 (2010).
  14. Wei, X., Ling, J., Wu, L., Liu, L., Xiao, Y. Expression of mineralization markers in dental pulp cells. J. Endod. 33, 703-708 (2007).
  15. Nombela-Arrieta, C., Ritz, J., Silberstein, L. E. The elusive nature and function of mesenchymal stem cells. Nat. Rev. Mol Cell Biol. 12, 126-131 (2011).
  16. Huang, G. T., Gronthos, S., Shi, S. Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs. those from other sources: their biology and role in regenerative medicine. J. Dent. Res. 88, 792-806 (2009).
  17. Graziano, A., et al. Scaffold's surface geometry significantly affects human stem cell bone tissue engineering. J. Cell Physiol. 214, 166-172 (2008).
  18. d'Aquino, R., et al. Human dental pulp stem cells: from biology to clinical applications. J. Exp. Zool. B. Mol. Dev. Evol. 312, 408-415 (2009).
  19. Mitsiadis, T. A., Feki, A., Papaccio, G., Caton, J. Dental pulp stem cells, niches, and notch signaling in tooth injury. Adv. Dent. Res. 23, 275-279 (2011).
  20. Shi, S., Gronthos, S. Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp. J. Bone Miner. Res. 18, 696-704 (2003).
  21. Tomic, S., et al. Immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells derived from dental pulp and dental follicle are susceptible to activation by toll-like receptor agonists. Stem Cells Dev. 20, 695-708 (2011).
  22. Tsukamoto, Y., et al. Mineralized nodule formation by cultures of human dental pulp-derived fibroblasts. Arch. Oral Biol. 37, 1045-1055 (1992).
  23. About, I., et al. Human dentin production in vitro. Exp. Cell Res. 258, 33-41 (2000).
  24. Couble, M. L., et al. Odontoblast differentiation of human dental pulp cells in explant cultures. Calcif. Tissue Int. 66, 129-138 (2000).
  25. Onishi, T., Kinoshita, S., Shintani, S., Sobue, S., Ooshima, T. Stimulation of proliferation and differentiation of dog dental pulp cells in serum-free culture medium by insulin-like growth factor. Arch. Oral Biol. 44 (99), 361-371 (1999).
  26. Huang, G. T., Sonoyama, W., Chen, J., Park, S. H. In vitro characterization of human dental pulp cells: various isolation methods and culturing environments. Cell Tissue Res. 324, 225-236 (2006).
  27. Bakopoulou, A., et al. Assessment of the impact of two different isolation methods on the osteo/odontogenic differentiation potential of human dental stem cells derived from deciduous teeth. Calcif. Tissue Int. 88, 130-141 (2011).
  28. Curtis, K. M., et al. EF1alpha and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells. BMC Mol. Biol. 11, 61 (2010).
  29. Suchanek, J., et al. Dental pulp stem cells and their characterization. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech Repub. 153, 31-35 (2009).
  30. d'Aquino, R., et al. Human postnatal dental pulp cells co-differentiate into osteoblasts and endotheliocytes: a pivotal synergy leading to adult bone tissue formation. Cell Death Differ. 14, 1162-1171 (2007).
  31. Atari, M., et al. Isolation of pluripotent stem cells from human third molar dental pulp. Histol. Histopathol. 26, 1057-1070 (2011).

Tags

بيولوجيا الخلايا الجذعية، العدد 69، الطب، والبيولوجيا التطورية، علم الأحياء الخلوي، الهندسة الحيوية، طب الأسنان اللب الأنسجة، الرحى الثالثة الإنسان، الإنسان الجذعية خلايا لب الأسنان، hDPSC، Odontoblasts، نامي أكثر من الخلايا الجذعية، MSC، والتمايز
العزلة، وتوصيف المقارن التمييز بين الخلايا الجذعية البشرية الأسنان اللب المستمدة من الأسنان الدائمة باستخدام طريقتين مختلفتين
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Karamzadeh, R., Eslaminejad, M. B.,… More

Karamzadeh, R., Eslaminejad, M. B., Aflatoonian, R. Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods. J. Vis. Exp. (69), e4372, doi:10.3791/4372 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter