Summary
Fremgangsmåden beskrevet isolering og karakterisering af humane dental pulp stamceller (hDPSCs) ved anvendelse af enten
Abstract
Introduction
Stamceller er klonogene celler, som besidder to bemærkelsesværdige features, kendt som multi-potens og selvfornyelse 15. Blandt alle stamceller med forskellige replikative kræfter, har dental stamceller som de postnatale stamceller henledt opmærksomheden i de senere år på grund af deres tilgængelighed, plasticitet og høj proliferativ evne i sammenligning med andre voksne stamceller 16. Karakteristisk lighed med de mesenkymale stamceller, dental pulp stamceller er adhærente klonogene celler, der har multiple differentiering kapacitet til mesenkym-og / eller ikke-mesenchym linier, både in vitro og in vivo. 1-8,17,18 DPSCs identificeres ved deres negative udtryk for hæmatopoietiske antigener (f.eks CD45, CD34, CD14), og positivt udtryk for CD90, CD29, CD73, CD105, CD44 og STRO-1. 19,20
Nem opnåede potentiale med mindst smerte & sygelighed stille menneskelige DPSCs som et værdifuldtstand kilde MSC'er sammenlignet med de almindelige kilder, såsom knoglemarv mesenchymstamceller 21. Generelt er DPSCs blevet isoleret enten ved udvækst metode, dvs, migration af stamceller fra pulpavæv eksplantater (dpsc-OG) 22-24 og / eller ved enzymatisk nedbrydning (dpsc-ED) 4,6,25. Tidligere undersøgelser har vist, at isoleringsmetoden og dyrkningsbetingelser kan fremkalde forskellige populationer eller slægter under in vitro passager 26,27. I tilfælde af blivende tænder (pDPSCs), afslørede Huang et al, at enzymatiske fordøjede pDPSCs har højere proliferation potentiale sammenlignet med de outgrown DPSCs. 26 endvidere i tilfælde af løvfældende tænder (dDPSCs), blev det påvist, STRO-1 og CD34 markører udtrykt mere i dDPSC-ED sammenlignet med dDPSC-OG. Desuden viste dDPSC-ED højere mineraliseringsgrad i definerede osteo / odonto medium. 27 På grund af den enestående potentiale DPSCs i regenerative medicin, vil flere ikke være påkrævet for bedre forståelse af mulige forskellige populationer som er afledt af forskellige isoleringsmetoder.
Her var forsøg på at indføre nem måde af papirmasse ekstraktion, ved hjælp af en-trins dental diamant disk for at lette processen med pulp ekstraktion. Endvidere, efter isolering af humane pulp-afledte stamceller ved at anvende ED eller OG metoder, blev generelle egenskaber og differentiering kapacitet mellem to grupper også undersøgt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forbered enzymopløsningen og spredning Medium (PM)
- Gør Collagenase Type I Løsning: Afvej collagenase type I (12 mg / ml) og opløses i 1 ml PBS og filtreres under anvendelse af en 0,2 um sprøjtefilter. Derefter placere det 15 ml rør og holde det ved -20 ° C indtil brug.
- Gør dispase Løsning: Afvej dispase (16 mg / ml) og opløses i 1 ml PBS og filtreres under anvendelse af en 0,2 um sprøjtefilter. Derefter placere det 15 ml rør og holde det ved 4 ° C indtil brug.
- Gør enzymopløsning: Tilsæt 1 ml collagenase type I opløsninger (12 mg / ml) og 1 ml dispase opløsninger (16 mg / ml) i 2 ml sterilt PBS indeholdende 100 mg / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin. Total koncentration af dispase og collagenase I i slutvolumen bør være 4 mg / ml og 3 mg / ml, receptively. Derefter alikvot dette volumen til fire 15 ml rør, som hver indeholder 1 ml enzymopløsning. Hvert rør kan anvendes til en papirmasse fordøjelse.
- Gør vaskeopløsning: Der tilsættes 100 mg / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin i PBS.
- Gøre basiske medier: Alpha modifikation af Eagles medium (α-MEM) suppleret med 10% FBS og 100 enheder / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin.
- Gøre spredning Media (PM): Alpha modifikation af Eagles medium (α-MEM) suppleret med 10% FBS, 100 uM L-ascorbinsyre-2-phosphat, 2 mM L-glutamin, 100 enheder / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin, 0,25 mg / ml amphotericin B.
- Gøre odontogene medier: Alpha modifikation af Eagles medium (α-MEM) suppleret med 10% FBS, 100 uM L-ascorbinsyre-2-phosphat, 2 mM L-glutamin, 100 enheder / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin, 0,01 uM Dexamethason, 5 mM β-glycerolphosphat, 1,8 mM Monokaliumphosphat.
2. Forbered Humant Dental pulpavæv for Dental Pulp Stem Cell Isolation
- Normale humane tredje molarer blev indsamlet fra voksne (21-29 år) på Dental Clinic af Imam Ali under godkendte Institutional Review Board (IRB).
- Tænderne blev anbragt i det basale medium (α-MEM suppleret med 10% FBS) og blev overført til laboratoriet ved 4 ° C.
- Under sterile betingelser, i en biologisk laminar strømningshætte arbejder, set-up blev udført en 100 mm petriskåle for hver tand, der skal behandles. Tandoverflader blev renset med 70% ethanol.
- Mens du arbejder i en af de petriskåle blev tand holdt ved dental pincet og en skalpel blev brugt til at rense ud snavs og parodontal ligament på rødderne.
- Cemento-emalje krydset blev langsomt skåret ved hjælp af steriliseret dental disk for at afsløre pulpakammeret. Det bør tages i betragtning, at opskæringen skal udføres langsomt for at reducere overophedning af den dentale væv.
- Pulpavæv blev forsigtigt adskilt fra kronen og roden. Pulpavæv blev skåret i små stykker ved hjælp af et skalpelblad.
3. Humant Dental Pulp Isolation
- Pulp væv undergik enten enzymatisk dissociation af papirmasse væv eller direkte celleudgroning fra pulpavæv eksplantater til isolering af hDPSCs.
- Enzymatisk dissociation af pulpavæv:
- Små stykker af papirmasse væv blev overført til enzymopløsning i 1 time ved 37 ° C. Vortex hver 30 min for at hjælpe med opbrydning væv.
- Derefter blev store celleaggregater fjernet, og enkeltcelle-suspensioner blev fremstillet ved at lede celler gennem en 70-pM cell strainer.
- Enkelt-cellesuspensioner blev centrifugeret ved 1200 rpm i 5 min ved stuetemperatur.
- Supernatanter blev omhyggeligt pipetteret fra og pellet blev resuspenderet i 1 ml proliferationsmedium (PM). (Bemærk: FBS i proliferation medium opsige enzymatisk disassociationen.)
- Enkelt-cellesuspensioner af dental pulp blev podet i 25 cm2 dyrkningskolbe med PM og derefter inkuberet ved 37 ° C i 5% CO2.
- Dyrkningsmediet blev skiftet hver tredje dag, indtil cellekonfluens blev opnået.
- Direkte celleudgroning fra pulpavæv eksplantater:
- Pulpavæv blev hakket i 1-2 mm stykker, og hvert stykke blev anbragt i 25-cm2 dyrkningskolber med PM og derefter inkuberet ved 37 ° C i 5% CO2. Det bør tages i betragtning, at den samlede mængde af PM for udvækst af celler skal støtte fastgørelsen af papirmasse stykker for yderligere celleudgroning (2-3 ml per kolbe).
- Mediet blev skiftet efter udvækst blev observeret.
- De vokset celler ved konfluens blev sub-dyrket ved forhold på 1:4 (passage 1).
4. Immunophenotyping
- 250.000 celler /rør af begge typer celler i passage 3 blev inkuberet med PE eller FITC-konjugerede anti-humane antistoffer med deres isotyper i 30 minutter ved 4 ° C i mørke. (Bemærk:. Koncentrationen af antistoffer blev anvendt i overensstemmelse med producentens protokol)
- Efter inkubationstiden blev 100 pi PBS eller FACS fortynding opløsning sættes til hvert rør og centrifugeret ved 1200 rpm i 5 minutter i mørke.
- Supernatanterne blev fjernet og pellets resuspenderet i 100 pi PBS eller FACS fortynding i mørke.
- Målrettede overflademarkører (CD markører) blev evalueret ved BD FACSCalibur.
5. Induktion af differentiering af DPSCs i mineraliseret Cells & Kvantificeret Alizarin red S Assay
- DPSCs, som blev opnået ved enten enzymatisk dissociation af pulpavæv (kendt som dpsc-ED) eller direkte celleudgroning fra pulpavæv eksplantater (dpsc-OG) var sub-dyrket i 3 passager.
- At passage 3, blev celler frø i en 6 brønds plade ved 5.000 celler / brønd.
- Ved konfluens på 60%, blev odontogen medium erstattet med konventionelle PM. Tre brønde blev holdt som negativ kontrol ved tilsætning af vækstmedium.
- Medium ændre hver 3 dage, indtil dag 21.
- På dag 21, blev cellerne vasket med PBS og blev fikseret med 1 ml / brønd 10% paraformaldehyd i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Derefter paraformaldehyd blev pipetteret fra, omhyggeligt og cellerne blev vasket 3 gange (5-10 min hver gang) med destilleret H 2 O. (Bemærk: Undgå at forstyrre monolag.)
- Efter vask blev 1 ml / brønd Alizarin red S tilsat i 20 minutter ved stuetemperatur.
- Celler blev vasket med deioniseret H 2 O fire gange (5 minutter hver gang med forsigtig vipning) for at fjerne eventuelle yderligere Alizarin red.
- 1 ml / brønd H2O blev tilsat for at forhindre cellerne i at tørre.
- Pladerne blev antaget til visuelle inspection og / eller billede erhvervelse.
- For Alizarin Red S kvantificering assay blev H2O erstattet med 1 ml 10% eddikesyre til hver brønd på 6-brønds plade og inkuberes i 30 min ved stuetemperatur med omrystning.
- Derefter cellemonolaget / brønd blev skrabe & både eddikesyre og celler blev overført til separate 1,5 ml mikro-centrifugerør. (Bemærk:. Hver brønd skal være overførsel til et separat rør hvilket er tre testbrønde & tre kontrolgrupper brønde for hver ED & OG grupper)
- Rørene blev hvirvelbehandlet kraftigt i 30 sek.
- Der opvarmes til 85 ° C i 10 minutter. (Bemærk: For at undgå fordampning blev rørene forseglet med parafilm.)
- Efter opvarmning blev rørene overført til is i 5 minutter. (Bemærk: Rør ikke bør åbnes før blive afkølet.)
- Opslæmningerne blev centrifugeret ved 20.000 x g i 15 minutter. Mens centrifugering blev Alizarin red standarder træffesop.
Alizarin red S standard blev fremstillet ved først at fortynde fortyndingspufferen og anvendes til fremstilling af to-fold seriefortyndinger baseret på bordet.
| High Range koncentration af farvestof | Lav Range koncentration af farvestof | ||||||||||||
| 2 mM | 1 mM | 500 pM | 250 pM | 125 uM | 62,5 uM | 31,3 uM | 15,6 uM | 7,8 uM | 3,9 uM | 1,9 uM | 0,9 uM | 0,4 uM | Blank |
- Efter centrifugering blev 1 ml supernatant / rør overført til nye separate 1,5 ml mikro-centrifugerør.
- PH-værdien blev neutraliseret med ~ 375 | jl 10% Ammoniumhydroxid per rør. (Bemærk: pH rage bør være 4,1-4,5.)
- 150 gl af standard og prøverne (herunder separate tests og kontroller) blev tilsat til en uigennemsigtig vægge, transparent bund 96 brønde.
- Absorbansen blev aflæst ved 405 nm, og OD-værdier fra prøver blev sammenlignet med standard plot til yderligere analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
- DPSCs, der blev opnået ved enzymatisk dissociation (dpsc-ED) er vist her på dag 10, 15,18 (fig. 1). Kolonierne indledt til dannelse på næsten 3-5 dage efter isolering.
- Vokset DPSCs (dpsc-OG) er vist i figur 2 på dag 5, 10, 13 & 18. Fibroblastlignende celler begyndte at migrere fra pulpavæv til kolben ved parallelle bestilling med næsten 5 dage efter podning.
- DPSCs ved passage 3 ved hjælp af begge fremgangsmåder er vist i figur 3.. Begge typer DPSCs var næsten i samme størrelse og morfologi.
- Immunophenotyping resulterer i dpsc-ED og dpsc-OG (fig. 4). Disse resultater indikerede tilstedeværelsen af mesenchymale stamceller er markører, såsom CD44, CD73, CD105 og CD90 og fraværet af hæmatopoietiske & endothelial markører, såsom CD34, CD45 og CD11b . De udtryk for CD105 og CD146 (perivaskulær markør) var mere i dpsc-OG sammenlignet med dpsc-ED.STRO-1 var negativ i begge grupper. (Blå linjer nævnt OG gruppe, mens røde linjer nævnt ED én, gule linjer angivet isotyper.)
- Alizarin red S morfologi og kvantificering resultater for evaluering af mineraliseret væv dannelse i dpsc-ED og dpsc-OG på dag 21 er vist i fig. 5. Jo mere absorberende røde farve på mere calcium deposition. Disse resultater viser mere calcium aflejring i opdelte dpsc-ED (d) i forhold til dpsc-OG (c). (Tredobbelte tekniske replikationer) kvantificering af Alizarin red S også indikerede signifikant (*) højere koncentration af farvestof mellem dpsc-ED i sammenligning med OL grupper. (Dye koncentration også signifikant (**, ***) mellem test og kontrol af hver gruppe (ED eller OG), der er angivet calcium deposition efter differentieringsprocessen)
(NB: En parret t-test-analyse blev anvendt til bestemmelse af forskellene imængde mineraliseret matrix producerede ED og OL grupper efter induktion af differentiering. Resultaterne blev udtrykt som gennemsnit ± SEM. (Størrelsen antaget for P <0,05)
- QPCR resultaterne af ekspressionen af odontoblast og mineraliseret-relaterede gener (DSPP) og (MEPE, ALP), med differentieret dpsc-ED & dpsc-OG er vist i fig. 6. Disse resultater indikerede signifikant opregulering af ALP & MEPE efter differentieringen af ED og OG grupper. I mellemtiden ALP og MEPE udtryk var signifikant højere i opdelte dpsc-ED sammenlignet med differentierede dpsc-OG. Der er imidlertid ingen forskel i ekspressionen af DSPP i differentierede celler mellem de to grupper (Housekeeping gene: Tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase aktiverede protein (YWHAZ)). 28
(Bemærk:. De qPCR blev analyseret under anvendelse sammenlignelig CT metode A pa IRED t-test-analyse blev anvendt til bestemmelse af forskellene i genekspression mellem ED & OL grupper før og efter differentiering og også mellem differentierede celler af to grupper. Resultaterne blev udtrykt som gennemsnit ± SEM. (Betydning antaget for P <0,05) (Tredobbelte tekniske replikationer)
Figur 1. Enzymatic dissocieret dpsc (dpsc-ED) på dag 10, 15 & 18. Forstørrelse bar = 200 um.
Figur 2. Vokset DPSCs (dpsc-OG) på dag 5, 10, 13 og 18 år. Forstørrelse bar = 200 um.
load/4372/4372fig3highres.jpg "/>
Figur 3. Vokset DPSCs (dpsc-OG) & enzymatiske fordøjede DPSCs (dpsc-ED) morfologier i passagen 3. Forstørrelse bar = 200 um. Klik her for at se større figur .
Figur 4. Overlejret Histogram af immunophenotyping resultater i dpsc-ED (mørk rød) og dpsc-OG (blå). (Gule linjer repræsenterer isotyper). Klik her for at se større figur .
hres.jpg "/>
Figur 5. Alizarin Red S farvning resulterer i differentierede dpsc-OG (c), og differentieret dpsc-ED (d). (A) & (b) nævnte kontrollerne. Kvantificering af Alizarin red S assay viser mere farve absorption i differentieret dpsc-ED sammenlignet med den differentierede OG gruppen (e). Klik her for at se større figur .
Figur 6. QPCR resultaterne af ekspressionen af odontoblast og mineraliseret-relaterede gener (DSPP) og (MEPE, ALP), med differentieret dpsc-ED & dpsc-OG. Ekspressionen af MEPE, ALP, og DSPP i differentierede celler sammenlignet med kontrollen bekræftede differentieringen af begge grupper i odontoblast (ac). Disse rESULTATER indikerede betydelig opregulering af ALP & MEPE efter differentieringen af ED og OG grupper (a & b). I mellemtiden ALP og MEPE udtryk var signifikant højere i opdelte dpsc-ED sammenlignet med differentierede dpsc-OG (a & b). Der er imidlertid ingen forskel i ekspressionen af DSPP i differentierede celler i begge grupper (c) (Housekeeping gene: Tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase aktiverede protein, YWHAZ). se større tal .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver processen med isolering og karakterisering af hDPSCs fra dental pulp ved hjælp af to metoder, enzymatisk dissociation og direkte udvækst af stamceller fra pulpavæv eksplantater. Desuden, in vitro differentiering af disse celler i odontoblasts blev vurderet ved kvantitativ Alizarin Red S assay og qPCR.
Eksisterende protokoller til isolering pulpavæv fra human tand var blevet brugt forskellige instrumenter, såsom tang (knogle tang) 9, udryddelse nål 29, Gracey curette 30, dental revne bor 4, osv. Disse metoder er tidskrævende, samtidig overveje lavt niveau overophedning af papirmasse ved tilsætning af vand kontinuerligt. I den nuværende teknik, er dental diamantskive anvendes til isolering af papirmasse væv, hvilket er en hurtig måde at skære tænder med minimal kontaminering i ettrinsproces, og minimerer overophedning af pulp under en skæreproces. Desuden hDPSCs enre endeligt differentierede til odontoblasts som er aldrig sammenlignet i forbindelse med humane blivende tænder ved diskuteret formål. Sammenlignende vurdering af differentierede hDPSCs (ED & OG grupper) ved kvantitativ Alizarin red S assay indikerede højere mineralisering potentiale hDPSC-ED i sammenligning med OL gruppe. Disse resultater bekræftes også af qPCR. DSPP, ALP og MEPE som mineralisering markører opreguleret efter odontoblast differentiering i begge grupper. På den anden side var udtryk for MEPE & ALP højere i opdelte hDPSC-ED sammenlignet med kontrollen. Efter aftale med tidligere undersøgelse om løvfældende tænder 27, også stamceller fra blivende tænder ved hjælp af ED eller OL isoleringsmetoder udviser lignende differentiering adfærd under de samme betingelser. Desuden, for bedre sammenlignende evaluering, i denne undersøgelse, var begge hDPSC-ED & hDPSC-OG isoleret fra de samme individer.
Udtryk for MSC markører end fravær af heamatopietic / endothelial markører identificerer begge typer hDPSCs som mesenkymale stamceller. På den anden side var CD 105 / CD 146 højere i dpsc-OG sammenlignet med ED grupper. Trods de nuværende bevis efter tilstedeværelsen af STRO-1 i DPSCs 31, viste vores resultater ingen ekspression af STRO-1 i begge grupper. Kan imidlertid betydelige forskelle i overflademarkør ekspression i forskellige undersøgelser skyldes de enten dyrkningsbetingelserne såsom passage nummer, sammensætning af medier osv. eller inter-individuelle variationer mellem forskellige donorer. Fraværet af STRO-1 i begge grupper kan indikere, at ekspression af denne markør måske ikke direkte påvirke odontoblast differentieringspotentiale (ikke vist i video).
Forskellige hDPSCs isolation tilstand kan bringe anderledes differentiering kapacitet. Disse forskelle kan skyldes, at eksistensen af forskellige befolkningsgrupper i Pulpavævet. Således vælger isolation metoder MIGht være nyttige til målrettet-vævsspecifikke reparation & regeneration for fremtidige kliniske tilgange. Vores resultater indikerede højere mineralisering kapacitet enzymatisk fordøjet dpsc forhold til outgrown dem. Der er dog yderligere undersøgelser, såsom vurderingen af dannelsen af rørformede struktur in vivo og in vitro, der kræves for at afgøre, hvilken af disse to procedurer er gældende for funktionel dentin / papirmasse vævsregeneration behandlinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Leila Shakeri & Dr. Aref Dournaei for deres kritiske discus og Mr. Mohammad Reza Khadem Sharif for hans tekniske hjælpemidler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| α-MEM | GIBCO | 11900-073 | |
| Collagenase type I | Sigma-Aldrich | C0130-100MG | |
| Dispase | GIBCO | 17105-041 | |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
| Fetal Bovine serum defined (FBS) | HyClone | SH30070.03 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960-5G | |
| L-glutamine | GIBCO | 25030-024 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| β-Glycerol phosphate disodium salt hydrate, BioUltra | Sigma | G9422-100G | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Osteogenesis Assay Kit | Millipore | PS01802031 | |
| Mouse IgG2b-PE isotype control | BD pharmingen | 50808088029 | |
| FITC mouse IgG2b isotype control | BD pharmingen | 559532 | |
| FITC mouse IgG1 κ isotype | BD pharmingen | 11471471 | |
| FITC/PE mouse anti-human CD34/CD45 | BD pharmingen | 341071 | |
| PE anti-human CD146 | BD pharmingen | 550315 | |
| Monoclonal mouse anti-human CD90/FITC | Daka | 00034418 | |
| PE mouse anti-human CD73 | BD pharmingen | 550257 | |
| Anti-h CD105/Endoglin PE | BD pharmingen | FAB10971P | |
| PE mouse anti-human CD11b/Mac1 | BD pharmingen | 5553888 | |
| CD44 PE mouse anti human | BD pharmingen | 555479 | |
| Phosphate buffer Solution (PBS) | GIBCO | 003000 | |
| 70-μm cell strainer | Falcon | 352360 | |
| 0.2 μm syringe filter | Millex-GV | SLGV033RB | |
| 25 cm2 culture flask | Sigma-Aldrich | Z707481 | |
| EQUIPMENT | |||
| BD FACSCalibur | BD | 342975 | |
| multiskan microplate spectrophotometer | Thermo scientific | 51119200 | |
| Fleurcense Microscope | Olympus | ||
| Flowing Software version 2.3.1 | |||
References
- Volponi, A. A., Pang, Y., Sharpe, P. T. Stem cell-based biological tooth repair and regeneration. Trends Cell Biol. 20, 715-722 (2010).
- Nosrat, I. V., Widenfalk, J., Olson, L., Nosrat, C. A. Dental pulp cells produce neurotrophic factors, interact with trigeminal neurons in vitro, and rescue motoneurons after spinal cord injury. Dev. Biol. 238, 120-132 (2001).
- Gandia, C., et al. Human dental pulp stem cells improve left ventricular function, induce angiogenesis, and reduce infarct size in rats with acute myocardial infarction. Stem Cells. 26, 638-645 (2008).
- Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.. 97, 13625-13630 (2000).
- Graziano, A., d'Aquino, R., Laino, G., Papaccio, G. Dental pulp stem cells: a promising tool for bone regeneration. Stem Cell Rev. 4, 21-26 (2008).
- Kerkis, I., et al. Early transplantation of human immature dental pulp stem cells from baby teeth to golden retriever muscular dystrophy (GRMD) dogs: Local or systemic. J. Transl. Med. 6, 35 (2008).
- Onyekwelu, O., Seppala, M., Zoupa, M., Cobourne, M. T. Tooth development: 2. Regenerating teeth in the laboratory. Dent. Update. 34, 20-29 (2007).
- Cordeiro, M. M., et al. Dental pulp tissue engineering with stem cells from exfoliated deciduous teeth. J. Endod. 34 (08), 962-969 (2008).
- Pierdomenico, L., et al. Multipotent mesenchymal stem cells with immunosuppressive activity can be easily isolated from dental pulp. Transplantation. 80, 836-842 (2005).
- de Mendonca Costa, A., et al. Reconstruction of large cranial defects in nonimmunosuppressed experimental design with human dental pulp stem cells. J. Craniofac. Surg. 19, 204-210 (2008).
- Tirino, V., et al. Methods for the identification, characterization and banking of human DPSCs: current strategies and perspectives. Stem Cell Rev. 7, 608-615 (2011).
- Tirino, V., Paino, F., De Rosa, A., Papaccio, G. Identification, isolation, characterization, and banking of human dental pulp stem cells. Methods Mol. Biol. 879, 443-463 (2012).
- Eslaminejad, M. B., Vahabi, S., Shariati, M., Nazarian, H. In vitro Growth and Characterization of Stem Cells from Human Dental Pulp of Deciduous Versus Permanent Teeth. J. Dent. (Tehran). 7, 185-195 (2010).
- Wei, X., Ling, J., Wu, L., Liu, L., Xiao, Y. Expression of mineralization markers in dental pulp cells. J. Endod. 33, 703-708 (2007).
- Nombela-Arrieta, C., Ritz, J., Silberstein, L. E. The elusive nature and function of mesenchymal stem cells. Nat. Rev. Mol Cell Biol. 12, 126-131 (2011).
- Huang, G. T., Gronthos, S., Shi, S. Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs. those from other sources: their biology and role in regenerative medicine. J. Dent. Res. 88, 792-806 (2009).
- Graziano, A., et al. Scaffold's surface geometry significantly affects human stem cell bone tissue engineering. J. Cell Physiol. 214, 166-172 (2008).
- d'Aquino, R., et al. Human dental pulp stem cells: from biology to clinical applications. J. Exp. Zool. B. Mol. Dev. Evol. 312, 408-415 (2009).
- Mitsiadis, T. A., Feki, A., Papaccio, G., Caton, J. Dental pulp stem cells, niches, and notch signaling in tooth injury. Adv. Dent. Res. 23, 275-279 (2011).
- Shi, S., Gronthos, S. Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp. J. Bone Miner. Res. 18, 696-704 (2003).
- Tomic, S., et al. Immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells derived from dental pulp and dental follicle are susceptible to activation by toll-like receptor agonists. Stem Cells Dev. 20, 695-708 (2011).
- Tsukamoto, Y., et al. Mineralized nodule formation by cultures of human dental pulp-derived fibroblasts. Arch. Oral Biol. 37, 1045-1055 (1992).
- About, I., et al. Human dentin production in vitro. Exp. Cell Res. 258, 33-41 (2000).
- Couble, M. L., et al. Odontoblast differentiation of human dental pulp cells in explant cultures. Calcif. Tissue Int. 66, 129-138 (2000).
- Onishi, T., Kinoshita, S., Shintani, S., Sobue, S., Ooshima, T. Stimulation of proliferation and differentiation of dog dental pulp cells in serum-free culture medium by insulin-like growth factor. Arch. Oral Biol. 44 (99), 361-371 (1999).
- Huang, G. T., Sonoyama, W., Chen, J., Park, S. H. In vitro characterization of human dental pulp cells: various isolation methods and culturing environments. Cell Tissue Res. 324, 225-236 (2006).
- Bakopoulou, A., et al. Assessment of the impact of two different isolation methods on the osteo/odontogenic differentiation potential of human dental stem cells derived from deciduous teeth. Calcif. Tissue Int. 88, 130-141 (2011).
- Curtis, K. M., et al. EF1alpha and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells. BMC Mol. Biol. 11, 61 (2010).
- Suchanek, J., et al. Dental pulp stem cells and their characterization. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech Repub. 153, 31-35 (2009).
- d'Aquino, R., et al. Human postnatal dental pulp cells co-differentiate into osteoblasts and endotheliocytes: a pivotal synergy leading to adult bone tissue formation. Cell Death Differ. 14, 1162-1171 (2007).
- Atari, M., et al. Isolation of pluripotent stem cells from human third molar dental pulp. Histol. Histopathol. 26, 1057-1070 (2011).
