Summary
De werkwijze beschreven isolatie en karakterisering van menselijke pulpa stamcellen (hDPSCs) door ofwel
Abstract
Introduction
Stamcellen zijn cellen die klonogene twee opmerkelijke eigenschappen, bekend als multi-potentie en zelfvernieuwing 15 bezitten. Van alle stamcellen met verschillende replicatieve vermogens, hebben tandheelkundige stamcellen als postnatale stamcellen gewezen laatste jaren vanwege hun toegankelijkheid, plasticiteit en hoge proliferatieve vermogen in vergelijking met andere volwassen stamcellen 16. Kenmerkend vergelijkbaar met de mesenchymale stamcellen, dentale pulp stamcellen zijn hechtende klonogene cellen die meerdere differentiatiecapaciteit in mesenchym en / of niet-mesenchym lineages, zowel in vitro als in vivo. 1-8,17,18 DPSC's worden geïdentificeerd door hun negatieve uitdrukking van hematopoietische antigenen (bijv. CD45, CD34, CD14), en positieve uitdrukking van CD90, CD29, CD73, CD105, CD44 en STRO-1. 19,20
Gemakkelijk verkregen potentieel met een minimum aan pijn en ziekte te maken menselijke DPSC's als een waardevollekunnen bron van MSCs in vergelijking met de gewone bronnen, zoals beenmerg mesenchymale stamcellen 21. In het algemeen zijn DPSC's zijn geïsoleerd door een uitwas werkwijze, dwz migratie van stamcellen uit pulp weefselexplantaten (DPSC-OG) 22-24, en / of door enzymatische digestie (DPSC-ED) 4,6,25. Eerdere studies hebben aangetoond dat de isolatiemethode en kweekomstandigheden kunnen verschillende populaties of geslachten er onvoldoende in vitro passages 26,27. In geval van blijvende tanden (pDPSCs), Huang et al. toonde aan dat enzymatische digestie pDPSCs hogere proliferatie potentie vergeleken met de ontgroeid DPSC's. 26 Bovendien, in het geval van melktanden (dDPSCs), werd aangetoond dat STRO-1 en CD34 markers, uitgedrukt in dDPSC-ED in vergelijking met dDPSC-OG. Bovendien dDPSC-ED weergegeven hogere mineralisatie in bepaalde osteo / odonto medium. 27 Derhalve dankzij de uitstekende mogelijkheden van DPSC's in regenerative geneeskunde, meer studies nodig voor een beter begrip van mogelijke verschillende populaties die zijn afgeleid van verschillende isolatiemethoden.
Hier was poging makkelijke manier pulp extractie voeren, met eentraps tandheelkundige diamantschijf de pulp extractie te vergemakkelijken. Bovendien, na isolatie van humane pulp-stamcellen door toepassing of ED OG werkwijzen werden algemene eigenschappen en differentiatiecapaciteit tussen twee groepen onderzocht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereid de enzymoplossing en proliferatie Medium (PM)
- Merk Collagenase Type I oplossing: Weeg collagenase type I (12 mg / ml) en los op in 1 ml PBS en filter met een 0,2 urn spuitfilter. Plaats dan het 15 ml tube en bewaar deze bij -20 ° C totdat het nodig is.
- Maak dispase Oplossing: Weeg dispase (16 mg / ml) en los op in 1 ml PBS en filter met behulp van een 0,2 micrometer spuitfilter. Plaats dan het 15 ml buis en houd het bij 4 ° C totdat het nodig is.
- Merk enzymoplossing: Voeg 1 ml collagenase type I oplossingen (12 mg / ml) en 1 ml dispase oplossingen (16 mg / ml) in de 2 ml steriel PBS bevattende 100 mg / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine. Totale concentratie dispase en Collagenase I eindvolume moeten 4 mg / ml en 3 mg / ml, receptief zijn. Vervolgens aliquot dit volume in vier 15 ml buis, die elk 1 ml enzymoplossing. Elke buis kan worden gebruikt voor een pulp digestie.
- Merk wasoplossing: Voeg 100 mg / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine in PBS.
- Standaardcorrecties media: Alpha wijziging van Eagle's medium (α-MEM) aangevuld met 10% FBS en 100 eenheden / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine.
- Maken de verspreiding Media (PM): Alpha wijziging van medium Eagle's (α-MEM) aangevuld met 10% FBS, 100 uM L-ascorbinezuur 2-fosfaat, 2 mM L-glutamine, 100 eenheden / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine, 0,25 mg / ml amfotericine B.
- Merk odontogene media: Alpha wijziging van medium Eagle's (α-MEM) aangevuld met 10% FBS, 100 mM L-ascorbinezuur 2-fosfaat, 2 mM L-glutamine, 100 eenheden / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine, 0,01 uM dexamethason, 5 mM β-glycerolfosfaat, 1,8 mM Monokaliumfosfaat.
2. Bereid Human Dental Pulp weefsel voor Dental Pulp Stem Cell Isolation
- Normale menselijke derde molaren werden verzameld van volwassenen (21 tot 29 jaar) op de Dental Clinic van de Imam Ali onder goedgekeurde Institutional Review Board (IRB).
- Tanden werden in het medium (α-MEM aangevuld met 10% FBS) en overgebracht naar het laboratorium bij 4 ° C.
- Onder de steriele toestand, het werken binnen een biohazard laminaire stroming kap, set-up werd gedaan een 100 mm petrischaaltjes voor elke tand te verwerken. Tandoppervlakken werden gereinigd met 70% ethanol.
- Tijdens het werken in een van de Petri-schalen, werd tand gehouden door tandheelkundige tang en een scalpel gebruikt om schoon te vuil en periodontale ligament op de wortels.
- Cemento-emaille kruising werd langzaam gesneden met behulp van gesteriliseerde tandheelkundige disc naar de pulpakamer te onthullen. Bedacht moet worden dat snijproces moet langzaam worden uitgevoerd om verminderen oververhitting van het tandweefsel.
- Pulp weefsel werd zachtjes gescheiden van de kroon en wortel. Pulpa werd in kleine stukjes gesneden met behulp van een scalpel.
3. Human Dental Pulp Isolatie
- Pulp weefsel ondergingen ofwel enzymatische dissociatie van pulpa of directe cel uitgroei van pulp weefselexplantaten voor isolatie van hDPSCs.
- Enzymatische dissociatie van pulpa:
- Stukjes pulp weefsels werden overgebracht naar enzymoplossing gedurende 1 uur bij 37 ° C. Vortex elke 30 minuten om te helpen breken weefsel.
- Daarna werden grote celaggregaten verwijderd en Single-cell suspensies werden verkregen door het passeren van cellen door middel van een 70-uM cel zeef.
- Eencellige suspensies werden gecentrifugeerd bij 1200 rpm gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
- Supernatanten werden voorzichtig afgepipetteerd en pellet werd geresuspendeerd in 1 ml proliferatie medium (PM). (Opmerking: FBS in proliferatie medium beëindigen enzymatische displayAssociation.)
- Eencellige suspensies van dentale pulp werd uitgezaaid in 25 cm2 cultuur kolf met PM en vervolgens geïncubeerd bij 37 ° C in 5% CO2.
- Het kweekmedium werd elke drie dagen totdat de cel confluentie werd bereikt.
- Directe cel uitgroei van pulp weefselexplantaten:
- Pulpa werd gehakt in 1-2-fragmenten mm, en elk stuk werd in 25 cm2 cultuur flessen met PM en vervolgens geïncubeerd bij 37 ° C in 5% CO2. Bedacht moet worden dat de totale volume van de PM voor uitgroei van cel moet de bevestiging van pulp stukken voor verdere uitgroei cellen (2-3 ml per kolf) te ondersteunen.
- Het medium werd gewijzigd nadat uitgroei werd waargenomen.
- De ontgroeid cellen bij confluentie werden sub-gecultiveerd in een verhouding van 1:4 (passage 1).
4. Immunofenotypering
- 250.000 cellen /tube van beide typen cellen in passage 3 werden geïncubeerd met PE of FITC-geconjugeerd anti-humane antilichamen met isotypen gedurende 30 min bij 4 ° C in een donkere plaats. (Opmerking:. De concentratie van antilichamen werd toegepast volgens de vervaardiging protocol)
- Na de incubatie periode werd 100 pi PBS of FACS verdunningsoplossing toegevoegd aan elke buis en gecentrifugeerd bij 1200 rpm gedurende 5 min in een donkere plaats.
- Supernatanten werden verwijderd en pellets werden geresuspendeerd in 100 ul PBS of FACS verdunning in donkere plaats.
- Gerichte oppervlakte markers (CD markers) werden geëvalueerd door BD FACSCalibur.
5. Inductie van differentiatie van DPSC's in Gemineraliseerde Cells & Gekwantificeerde Alizarinerood S Assay
- DPSC's die werden verkregen door enzymatische dissociatie van pulpa (bekend als DPSC-ED) of directe cel uitgroei van pulp weefselexplantaten (DPSC-OG) waren sub-gekweekte voor 3 gangen.
- Eent Passage 3, werden de cellen zaad in een plaat met 6 putjes bij 5.000 cellen / putje.
- Bij confluentie van 60% werden odontogene medium vervangen door conventionele PM. Drie putjes werden bleef als een negatieve controle door toevoeging van groeimedium.
- Medium wissel alle 3 dagen tot dag 21.
- Op dag 21 werden de cellen gewassen met PBS en werden vastgesteld bij 1 ml / putje 10% paraformaldehyde gedurende 15 min bij kamertemperatuur.
- Daarna werd paraformaldehyde afgepipetteerd zorgvuldig en cellen werden 3 keer gewassen (5-10 min per keer) met gedestilleerd H 2 O. (Opmerking: Vermijd het verstoren van de monolaag.)
- Na wassen werden 1 ml / putje Alizarinerood S toegevoegd gedurende 20 min bij kamertemperatuur.
- Cellen werden gewassen met gedeïoniseerd H 2 O viermaal (5 min per keer met zacht schudden) om extra Alizarinerood verwijderen.
- 1 ml / putje H 2 O werden toegevoegd aan de cellen niet uitdroogt.
- De platen werden verondersteld visuele inspection en / of beeldopname.
- Voor de kwantificering Alizarinerood S assay werden H 2 O vervangen door 1 ml 10% azijnzuur aan elk putje van 6-well plaat en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur onder schudden.
- Vervolgens celmonolaag / putje waren schraap & zowel azijnzuur en cellen overgebracht naar de afzonderlijke 1,5 ml micro-centrifugebuisjes. (Let op:. Elk putje moet de overdracht worden in een afzonderlijke buis dwz drie test putten en drie controleputjes voor elk ED & OG groepen)
- Buizen werden krachtig gevortext gedurende 30 sec.
- Verwarm tot 85 ° C gedurende 10 minuten. (Opmerking: om verdamping te voorkomen, werden buizen afgesloten met parafilm.)
- Na verwarmen, werden buizen overgebracht naar ijs gedurende 5 minuten. (Opmerking: Tubes mag pas worden geopend geworden afgekoeld.)
- De suspensies werden gecentrifugeerd bij 20.000 x g gedurende 15 minuten. Tijdens centrifugeren werden Alizarinerood normen genomenup.
Alizarinerood S standaard werden bereid door eerst verdunnen van de verdunningsbuffer en gebruikt om 2-voudige seriële verdunningen gebaseerd op de tabel.
| High Range concentratie van de kleurstof | Laag bereik concentratie van de kleurstof | ||||||||||||
| 2 mM | 1 mM | 500 uM | 250 uM | 125 uM | 62,5 uM | 31,3 uM | 15,6 uM | 7,8 uM | 3,9 uM | 1,9 uM | 0,9 uM | 0,4 uM | Blanco |
- Na het centrifugeren werden 1 ml supernatant / buis overgebracht naar nieuwe afzonderlijke 1,5 ml micro-centrifugebuisjes.
- De pH werd geneutraliseerd met 375 pi 10 ~% Ammoniumhydroxide per buis. (Opmerking: pH woede moet 4,1-4.5.)
- 150 ul standaard en monsters (inclusief afzonderlijke tests en controles) werden toegevoegd aan een ondoorzichtige wanden, transparante bodem 96-well plaat.
- De absorptie werd afgelezen bij 405 nm en OD waarden werden vergeleken met standaard plot voor verdere analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
- DPSC's die zijn verkregen door enzymatische dissociatie (DPSC-ED) hier op dag 10, 15,18 (Figuur 1). Kolonies opgestart om op bijna 3 tot 5 dagen na de isolatie vormen.
- Ontgroeid DPSC's (DPSC-OG) zijn weergegeven in Figuur 2 op dag 5, 10, 13 en 18. Fibroblastachtige cellen begon te migreren van pulp weefsel in de kolf parallel bestellen met bijna 5 dagen na uitzaaien.
- DPSC's bij passage 3 met beide methoden zijn weergegeven in figuur 3. Beide DPSC's bijna dezelfde grootte en morfologie.
- Immunofenotypering resulteert in DPSC-ED en DPSC-OG (figuur 4). Deze resultaten tonen de aanwezigheid van markers mesenchymale stamcellen's zoals CD44, CD73, CD105 en CD90 en de afwezigheid van hematopoëtische en endotheliale markers zoals CD34, CD45 en CD11b . De uitingen van CD105 & CD146 (perivasculaire marker) waren in DPSC-OG in vergelijking met DPSC-ED.STRO-1 was negatief in beide groepen. (Blauwe lijnen genoemd OG groep, terwijl rode lijnen aangeduid ED een, gele lijnen aangegeven isotypen.)
- Alizarinerood S morfologie & kwantificering resultaten voor evaluatie van gemineraliseerd weefsel formatie DPSC-ED en DPSC-OG op dag 21 worden getoond in Figuur 5. Meer absorberende rode kleur de meer calcium afzetting. Deze resultaten geven meer kalkafzetting in gedifferentieerde DPSC-ED (d) in vergelijking met DPSC-OG (c). (Drievoud technische replicaties) kwantificering van Alizarinerood S ook aangegeven significant (*) hogere concentratie van kleurstof tussen DPSC-ED in vergelijking met OG groepen. (Dye concentratie ook aanzienlijk toegenomen (**, ***) tussen de tests en controles van elke groep (ED of OG) die de calcium afzetting worden aangegeven na de differentiatie-proces)
(Opmerkingen: A gepaarde t-test analyse werd gebruikt om de verschillen in het bepalenhoeveelheid gemineraliseerde matrix ED en OG groepen die na inductie van differentiatie. De resultaten werden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. (Belang vooropgesteld P <0,05)
- QPCR resultaten van de expressie van odontoblast en gemineraliseerde-gerelateerde genen (DSPP) en (MEPE, ALP) respectievelijk in gedifferentieerde DPSC-ED & DPSC-OG worden getoond in Figuur 6. Deze resultaten tonen de significante opwaartse regulatie van ALP & MEPE na de differentiatie van ED en OG groepen. Ondertussen, ALP en MEPE uitdrukkingen waren significant hoger in gedifferentieerde DPSC-ED in vergelijking met de gedifferentieerde DPSC-OG. Er is echter geen verschil in de expressie van DSPP in gedifferentieerde cellen tussen beide groepen (huishoudgen: Tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein (YWHAZ)) 28.
(Let op:. De QPCR gegevens werden geanalyseerd met behulp van de vergelijkende CT methode A pa IRED t-test analyse werd gebruikt om de verschillen in genexpressie tussen ED & OG groepen voor en na de differentiatie en tussen gedifferentieerde cellen van twee groepen te bepalen. De resultaten werden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. (Betekenis vooropgesteld P <0,05) (drievoud technische replicaties)
Figuur 1. Enzymatische gedissocieerd DPSC (DPSC-ED) op dag 10, 15 & 18. Vergroting bar = 200 pm.
Figuur 2. Ontgroeid DPSC's (DPSC-OG) op dag 5, 10, 13 en 18. Vergroting bar = 200 pm.
load/4372/4372fig3highres.jpg "/>
Figuur 3. Ontgroeid DPSC's (DPSC-OG) en enzymatische verteerd DPSC's (DPSC-ED) morfologie in gang 3. Vergroting bar = 200 micrometer. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 4. Overlaid Histogram van immunofenotypering resultaten in DPSC-ED (donker rood) en DPSC-OG (blauw). (Gele lijn geven de isotypen). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
hres.jpg "/>
Figuur 5. Alizarinerood S kleuringen in gedifferentieerde DPSC-OG (c), en gedifferentieerde DPSC-ED (d). (A) en (b) genoemde controles. Kwantificering van test Alizarinerood S toon meer kleurstof absorptie in gedifferentieerde DPSC-ED in vergelijking met de gedifferentieerde OG groep (e). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 6. QPCR resultaten van de expressie van odontoblast en gemineraliseerde-gerelateerde genen (DSPP) en (MEPE, ALP) respectievelijk in gedifferentieerde DPSC-ED & DPSC-OG. De expressie van MEPE, ALP, en DSPP gedifferentieerde cellen in vergelijking met de controle bevestigde de differentiatie van beide groepen in odontoblast (ac). Deze rESULTATEN gewezen op de belangrijke up-regulatie van ALP & MEPE na de differentiatie van ED en OG groepen (a & b). Ondertussen ALP en MEPE uitdrukkingen waren significant hoger in gedifferentieerde DPSC-ED vergeleken met de gedifferentieerde DPSC-OG (a en b). Er is echter geen verschil in de expressie van DSPP in gedifferentieerde cellen van beide groepen (c) (huishoudgen: Tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein, YWHAZ). Klik hier om groter bedrag bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft het proces van isolatie en karakterisering van hDPSCs van tandheelkundige pulp met behulp van twee methoden, enzymatische dissociatie en directe uitgroei van stamcellen uit pulp weefselexplantaten. Bovendien in vitro differentiatie van deze cellen naar odontoblasts, werd bepaald door kwantitatieve assay Alizarinerood S & QPCR.
Bestaande protocollen voor het isoleren van pulp weefsel van menselijke tand werd gebruik gemaakt van verschillende instrumenten zoals tangen (bot forceps) 9, uitroeiing naald 29, Gracey curette 30, tandheelkundige spleet boren 4, enz. Deze methoden zijn tijdrovend, rekening houdend met lage oververhitting van de pulp door het toevoegen van water continu. Echter, in de huidige techniek, wordt tandheelkundige diamantschijf gebruikt voor de isolatie van pulpa, een snelle manier om tand met minimale verontreiniging gesneden eenstapsproces en minimaliseert de oververhitting van pulp gedurende een snijproces. Bovendien hDPSCs eentenslotte weer onderverdeeld in odontoblasts die nooit vergeleken bij menselijke tanden door permanent besproken doel. Vergelijkende evaluatie van de gedifferentieerde hDPSCs (ED & OG groepen) door assay kwantitatieve Alizarinerood S gewezen op de hogere mineralisatie potentieel van hDPSC-ED in vergelijking met OG-groep. Deze resultaten ook bevestigd door QPCR. DSPP, ALP en MEPE als de mineralisatie markers up-gereguleerd na de odontoblast differentiatie in beide groepen. Anderzijds worden de uitdrukkingen van MEPE en ALP hoger in gedifferentieerde hDPSC-ED vergeleken met de controle. In overeenstemming met eerdere studie over melktanden 27 stamcellen uit vaste tanden met ED of OG isolatiemethoden vertonen ook vergelijkbare differentiatie gedrag onder dezelfde omstandigheden. Bovendien een betere vergelijkende evaluatie, in deze studie werden zowel hDPSC-ED & hDPSC-OG geïsoleerd uit dezelfde personen.
Uitingen van MSC markers eend Aangezien heamatopietic / endotheliale markers beide hDPSCs als mesenchymale stamcellen. Anderzijds, CD 105/146 CD hoger in DPSC-OG opzichte van de ED groepen. Ondanks de bestaande gegevens volgens de aanwezigheid van STRO-1 in DPSC's 31, onze resultaten toonden geen expressie van STRO-1 in beide groepen. Nochtans, zou de aanzienlijke diversiteit in oppervlakte marker expressie in verschillende studies zijn door de beide kweekomstandigheden zoals passage nummer, samenstelling van media, etc. of interindividuele verschillen tussen donoren. Aangezien STRO-1 in beide groepen kan erop wijzen dat de expressie van deze marker niet zouden rechtstreeks odontoblast differentiatie potentieel beïnvloeden (niet getoond in video).
Verschillende hDPSCs isolatie aandoening kan brengen verschillende differentiatie capaciteit. Deze verschillen kunnen het gevolg zijn van het bestaan van verschillende populaties in de pulpa. Aldus kiezen de isolatiemethoden might nuttig zijn voor gerichte weefsel specifieke reparatie & regeneratie voor toekomstige klinische benaderingen. Onze resultaten laten de hogere mineralisatie capaciteit van enzymatische digestie DPSC opzichte van de ontgroeid degenen. Er zijn echter meer onderzoeken zoals de beoordeling van de vorming van buisvormige structuur in vivo en in vitro, nodig om te bepalen welke van de twee procedures geldt voor functionele dentine / pulp weefselregeneratie therapieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij dankbaar erkennen Dr Leila Shakeri & Dr Aref Dournaei voor hun kritische discus en de heer Mohammad Reza Khadem Sharif voor zijn technische ondersteuning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| α-MEM | GIBCO | 11900-073 | |
| Collagenase type I | Sigma-Aldrich | C0130-100MG | |
| Dispase | GIBCO | 17105-041 | |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
| Fetal Bovine serum defined (FBS) | HyClone | SH30070.03 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960-5G | |
| L-glutamine | GIBCO | 25030-024 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| β-Glycerol phosphate disodium salt hydrate, BioUltra | Sigma | G9422-100G | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Osteogenesis Assay Kit | Millipore | PS01802031 | |
| Mouse IgG2b-PE isotype control | BD pharmingen | 50808088029 | |
| FITC mouse IgG2b isotype control | BD pharmingen | 559532 | |
| FITC mouse IgG1 κ isotype | BD pharmingen | 11471471 | |
| FITC/PE mouse anti-human CD34/CD45 | BD pharmingen | 341071 | |
| PE anti-human CD146 | BD pharmingen | 550315 | |
| Monoclonal mouse anti-human CD90/FITC | Daka | 00034418 | |
| PE mouse anti-human CD73 | BD pharmingen | 550257 | |
| Anti-h CD105/Endoglin PE | BD pharmingen | FAB10971P | |
| PE mouse anti-human CD11b/Mac1 | BD pharmingen | 5553888 | |
| CD44 PE mouse anti human | BD pharmingen | 555479 | |
| Phosphate buffer Solution (PBS) | GIBCO | 003000 | |
| 70-μm cell strainer | Falcon | 352360 | |
| 0.2 μm syringe filter | Millex-GV | SLGV033RB | |
| 25 cm2 culture flask | Sigma-Aldrich | Z707481 | |
| EQUIPMENT | |||
| BD FACSCalibur | BD | 342975 | |
| multiskan microplate spectrophotometer | Thermo scientific | 51119200 | |
| Fleurcense Microscope | Olympus | ||
| Flowing Software version 2.3.1 | |||
References
- Volponi, A. A., Pang, Y., Sharpe, P. T. Stem cell-based biological tooth repair and regeneration. Trends Cell Biol. 20, 715-722 (2010).
- Nosrat, I. V., Widenfalk, J., Olson, L., Nosrat, C. A. Dental pulp cells produce neurotrophic factors, interact with trigeminal neurons in vitro, and rescue motoneurons after spinal cord injury. Dev. Biol. 238, 120-132 (2001).
- Gandia, C., et al. Human dental pulp stem cells improve left ventricular function, induce angiogenesis, and reduce infarct size in rats with acute myocardial infarction. Stem Cells. 26, 638-645 (2008).
- Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.. 97, 13625-13630 (2000).
- Graziano, A., d'Aquino, R., Laino, G., Papaccio, G. Dental pulp stem cells: a promising tool for bone regeneration. Stem Cell Rev. 4, 21-26 (2008).
- Kerkis, I., et al. Early transplantation of human immature dental pulp stem cells from baby teeth to golden retriever muscular dystrophy (GRMD) dogs: Local or systemic. J. Transl. Med. 6, 35 (2008).
- Onyekwelu, O., Seppala, M., Zoupa, M., Cobourne, M. T. Tooth development: 2. Regenerating teeth in the laboratory. Dent. Update. 34, 20-29 (2007).
- Cordeiro, M. M., et al. Dental pulp tissue engineering with stem cells from exfoliated deciduous teeth. J. Endod. 34 (08), 962-969 (2008).
- Pierdomenico, L., et al. Multipotent mesenchymal stem cells with immunosuppressive activity can be easily isolated from dental pulp. Transplantation. 80, 836-842 (2005).
- de Mendonca Costa, A., et al. Reconstruction of large cranial defects in nonimmunosuppressed experimental design with human dental pulp stem cells. J. Craniofac. Surg. 19, 204-210 (2008).
- Tirino, V., et al. Methods for the identification, characterization and banking of human DPSCs: current strategies and perspectives. Stem Cell Rev. 7, 608-615 (2011).
- Tirino, V., Paino, F., De Rosa, A., Papaccio, G. Identification, isolation, characterization, and banking of human dental pulp stem cells. Methods Mol. Biol. 879, 443-463 (2012).
- Eslaminejad, M. B., Vahabi, S., Shariati, M., Nazarian, H. In vitro Growth and Characterization of Stem Cells from Human Dental Pulp of Deciduous Versus Permanent Teeth. J. Dent. (Tehran). 7, 185-195 (2010).
- Wei, X., Ling, J., Wu, L., Liu, L., Xiao, Y. Expression of mineralization markers in dental pulp cells. J. Endod. 33, 703-708 (2007).
- Nombela-Arrieta, C., Ritz, J., Silberstein, L. E. The elusive nature and function of mesenchymal stem cells. Nat. Rev. Mol Cell Biol. 12, 126-131 (2011).
- Huang, G. T., Gronthos, S., Shi, S. Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs. those from other sources: their biology and role in regenerative medicine. J. Dent. Res. 88, 792-806 (2009).
- Graziano, A., et al. Scaffold's surface geometry significantly affects human stem cell bone tissue engineering. J. Cell Physiol. 214, 166-172 (2008).
- d'Aquino, R., et al. Human dental pulp stem cells: from biology to clinical applications. J. Exp. Zool. B. Mol. Dev. Evol. 312, 408-415 (2009).
- Mitsiadis, T. A., Feki, A., Papaccio, G., Caton, J. Dental pulp stem cells, niches, and notch signaling in tooth injury. Adv. Dent. Res. 23, 275-279 (2011).
- Shi, S., Gronthos, S. Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp. J. Bone Miner. Res. 18, 696-704 (2003).
- Tomic, S., et al. Immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells derived from dental pulp and dental follicle are susceptible to activation by toll-like receptor agonists. Stem Cells Dev. 20, 695-708 (2011).
- Tsukamoto, Y., et al. Mineralized nodule formation by cultures of human dental pulp-derived fibroblasts. Arch. Oral Biol. 37, 1045-1055 (1992).
- About, I., et al. Human dentin production in vitro. Exp. Cell Res. 258, 33-41 (2000).
- Couble, M. L., et al. Odontoblast differentiation of human dental pulp cells in explant cultures. Calcif. Tissue Int. 66, 129-138 (2000).
- Onishi, T., Kinoshita, S., Shintani, S., Sobue, S., Ooshima, T. Stimulation of proliferation and differentiation of dog dental pulp cells in serum-free culture medium by insulin-like growth factor. Arch. Oral Biol. 44 (99), 361-371 (1999).
- Huang, G. T., Sonoyama, W., Chen, J., Park, S. H. In vitro characterization of human dental pulp cells: various isolation methods and culturing environments. Cell Tissue Res. 324, 225-236 (2006).
- Bakopoulou, A., et al. Assessment of the impact of two different isolation methods on the osteo/odontogenic differentiation potential of human dental stem cells derived from deciduous teeth. Calcif. Tissue Int. 88, 130-141 (2011).
- Curtis, K. M., et al. EF1alpha and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells. BMC Mol. Biol. 11, 61 (2010).
- Suchanek, J., et al. Dental pulp stem cells and their characterization. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech Repub. 153, 31-35 (2009).
- d'Aquino, R., et al. Human postnatal dental pulp cells co-differentiate into osteoblasts and endotheliocytes: a pivotal synergy leading to adult bone tissue formation. Cell Death Differ. 14, 1162-1171 (2007).
- Atari, M., et al. Isolation of pluripotent stem cells from human third molar dental pulp. Histol. Histopathol. 26, 1057-1070 (2011).
