Summary
Il metodo descritto l'isolamento e la caratterizzazione di cellule staminali dentali umane Pulp (hDPSCs) utilizzando
Abstract
Introduction
Le cellule staminali sono cellule clonogeniche che possiedono due caratteristiche notevoli, conosciuti come multi-potenza e di auto-rinnovamento 15. Tra tutte le cellule staminali con diverse potenze replicative, le cellule staminali dentali come le cellule staminali post-natali hanno attirato l'attenzione negli ultimi anni, a causa della loro accessibilità, plasticità, e ad alta capacità proliferativa rispetto ad altre cellule staminali adulte 16. Caratteristicamente, simili alle cellule staminali mesenchimali, cellule staminali polpa dentale sono aderenti cellule clonogeniche aventi capacità multipla differenziazione in mesenchima e / o non-mesenchima lignaggi, sia in vitro che in vivo. 1-8,17,18 DPSCs sono identificati da la loro espressione negativa di antigeni ematopoietiche (ad esempio, CD45, CD34, CD14), e l'espressione di CD90 positivo, CD29, CD73, CD105, CD44 e STRO-1. 19,20
Facile potenziale ottenuto con un minimo sforzo e la morbilità rendere DPSCs umani come un validosorgente in grado di MSC rispetto alle fonti ordinarie, come le cellule staminali mesenchimali del midollo 21. In generale, DPSCs sono stati isolati da una escrescenza metodo, cioè, la migrazione di cellule staminali da espianti di tessuto pulpare (DPSC-OG) 22-24, e / o mediante digestione enzimatica (DPSC-ED) 4,6,25. Studi precedenti hanno dimostrato che il metodo di isolamento e condizioni di coltura possono indurre differenti popolazioni o casate sotto passaggi in vitro 26,27. Nel caso di denti permanenti (pDPSCs), Huang et al rivelato che enzimatiche pDPSCs digeriti hanno potenziale proliferativo superiore rispetto ai DPSCs cresciuti. 26 Inoltre, nel caso di denti decidui (dDPSCs), è stato dimostrato che STRO-1 e CD34 marcatori espressi più dDPSC-DE rispetto a dDPSC-OG. Inoltre, dDPSC-ED visualizzato elevato tasso di mineralizzazione in definito osteo / odonto media. 27 Pertanto, a causa del potenziale eccezionale di DPSCs in rmedicina egenerative, ulteriori studi saranno necessari per una migliore comprensione delle possibili varie popolazioni che sono derivati da diversi metodi di isolamento.
Qui, era tentativo di introdurre modo semplice di estrazione polpa, utilizzando uno step-disco diamantato dentale per facilitare il processo di estrazione polpa. Inoltre, dopo l'isolamento di polpa umani cellule staminali derivate mediante l'applicazione di metodi di ED o OG, proprietà generali e capacità di differenziazione tra i due gruppi sono stati studiati.
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Protocol
1. Preparare la soluzione enzimatica e medie proliferazione (PM)
- Marca Collagenasi I Soluzione: Pesare, collagenasi di tipo I (12 mg / ml) e sciogliere in 1 ml di PBS e filtro con un filtro 0,2 micron siringa. Poi posto 15 ml tubetto e la tiene a -20 ° C fino al momento dell'uso.
- Fai Soluzione dispasi: Pesare dispasi (16 mg / ml) e sciogliere in 1 ml di PBS e filtro con un filtro 0,2 micron siringa. Poi posto 15 ml tubetto e la tiene a 4 ° C fino al momento dell'uso.
- Rendere soluzione enzimatica: Aggiungere 1 ml di collagenasi di tipo I soluzioni (12 mg / ml) e 1 ml di soluzioni dispasi (16 mg / ml) in 2 ml di PBS sterile contenente 100 mg / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina. Concentrazione totale di dispasi e collagenasi I in volume finale deve essere di 4 mg / ml e 3 mg / ml, ricettivamente. Quindi, in questo volume aliquota di quattro tubo 15 ml, ciascuna contenente 1 ml di soluzione di enzima. Ogni tubo potrebbe essere utilizzato per una digestione pasta.
- Rendere soluzione di lavaggio: Aggiungere 100 mg / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina in PBS.
- Assicurarsi che i supporti di base: Alpha modifica del mezzo di Eagle (α-MEM) addizionato con 10% FBS e 100 unità / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina.
- Rendere il supporto proliferazione (PM): modifica Alpha di mezzo di Eagle (α-MEM) addizionato con 10% FBS, 100 mM L-ascorbico 2-fosfato, 2 mM L-glutammina, 100 unità / ml di penicillina, 100 mg / ml streptomicina, 0,25 mg / ml di amfotericina B.
- Rendere supporti odontogene: modifica Alpha di mezzo di Eagle (α-MEM) addizionato con 10% FBS, 100 mM L-ascorbico 2-fosfato, 2 mM L-glutammina, 100 unità / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina, 0,01 pM desametasone, 5 mM β-glicerolo fosfato, 1,8 mM di fosfato monopotassico.
2. Preparare umano tessuto dentale Dental Pulp per Isolatio cellule staminali della polpan
- Normali molari umani terzi sono stati raccolti da adulti (21-29 anni di età) presso la Clinica Odontoiatrica dell'Imam Ali sotto Institutional Review Board approvato (IRB).
- Denti sono stati inseriti nel terreno base (α-MEM supplementato con 10% FBS) e sono stati trasferiti in laboratorio a 4 ° C.
- Sotto la condizione sterile, lavorando all'interno di una cappa a flusso laminare biohazard, set-up è stato fatto uno 100 millimetri Petri per ogni dente da trattare. Superfici dentali venivano pulite del 70% di etanolo.
- Mentre lavora in uno dei piatti Petri, dente è stato tenuto da pinze dentali e una lama di bisturi è stato usato per pulire i detriti e legamento parodontale sulle radici.
- Giunzione smalto-cemento è stato lentamente tagliato utilizzando sterilizzato disco dentale per rivelare la camera pulpare. Va considerato che il processo di taglio deve essere effettuata lentamente per ridurre il surriscaldamento del tessuto dentale.
- Tessuto pulpare è stato delicatamente separato dalla corona e radice. Tessuto pulpare è stato tagliato in piccoli pezzi con l'aiuto di una lama di bisturi.
3. Umano Isolamento polpa dentale
- Pulp tessuti sono stati sottoposti sia dissociazione enzimatica del tessuto della polpa o cellule conseguenza diretta da espianti pasta tessuto per l'isolamento di hDPSCs.
- Dissociazione enzimatica del tessuto della polpa:
- Piccoli pezzi di tessuti paste sono state trasferite in soluzione enzimatica per 1 ora a 37 ° C. Vortex ogni 30 minuti per rompere il tessuto.
- In seguito, gli aggregati a grandi cellule sono state rimosse e cella singola sospensioni sono stati ottenuti facendo passare le cellule attraverso un 70-mM filtro cella.
- Monocellulari sospensioni sono state centrifugate a 1200 rpm per 5 min a temperatura ambiente.
- Surnatanti sono stati accuratamente pipettati off e pellet è stato risospeso in 1 ml di terreno di proliferazione (PM). (Nota: FBS a medio proliferazione terminare enzimatica disciazione.)
- Sospensioni monocellulari di polpa dentale è stato seminato in 25 cm 2 pallone di coltura con PM e poi incubate a 37 ° C in 5% CO 2.
- Il terreno di coltura è stato cambiato ogni tre giorni fino a quando la confluenza delle cellule è stato raggiunto.
- Cella diretta conseguenza da espianti di tessuto pasta:
- Tessuto pulpare stata macinata in 1-2-millimetri frammenti, e ogni pezzo è stato posto in 25-cm 2 fiasche con PM e poi incubate a 37 ° C in 5% CO 2. Si deve considerare che il volume totale del PM per conseguenza di cella deve supportare il fissaggio di pezzi paste per outgrowth cella ulteriore (2-3 ml per beuta).
- Medio è stato modificato dopo escrescenza è stata osservata.
- Le cellule erano cresciuti a confluenza sub-coltura con un rapporto di 1:4 (passaggio 1).
4. Immunofenotipizzazione
- 250.000 cellule /tubo di entrambi i tipi di cellule nel passaggio 3 sono state incubate da PE o FITC-coniugato anti-umani coniugati con i loro isotipi per 30 min a 4 ° C al buio. (Nota:. Concentrazione di anticorpi è stato applicato secondo il protocollo fabbricazione)
- Dopo il tempo di incubazione, 100 microlitri di PBS o soluzione di diluizione FACS è stato aggiunto a ciascuna provetta e centrifugati a 1200 rpm per 5 min in luogo buio.
- Surnatanti sono stati rimossi e pellet sono stati risospesi in 100 pl di PBS o diluizione FACS in luogo buio.
- Marcatori di superficie mirate (marcatori CD) sono stati valutati da BD FACSCalibur.
5. Induzione di differenziazione delle cellule in DPSCs mineralizzati e quantificata Assay Rosso alizarina S
- DPSCs che sono stati ottenuti da una dissociazione enzimatica del tessuto pulpare (noto come DPSC-DE) o conseguenza delle cellule direttamente da espianti di tessuto polpa (DPSC-OG) sono stati sub-coltivate per 3 passaggi.
- Lat Passage 3, le cellule sono state seme in una piastra a 6 pozzetti 5000 cellule / pozzetto.
- Alla confluenza del 60%, medie odontogeno stati sostituiti da PM convenzionale. Tre pozzetti erano rimasti come controllo negativo aggiungendo mezzo di crescita.
- Media ogni 3 giorni fino al giorno 21.
- Al giorno 21, cellule sono state lavate con PBS e sono stati fissati con 1 ml / pozzetto 10% paraformaldeide per 15 min a temperatura ambiente.
- Poi paraformaldeide stato pipettato off, cura e le cellule sono state lavate 3 volte (5-10 minuti per ogni volta) con acqua distillata H 2 O. (Nota: evitare di disturbare il monostrato.)
- Dopo il lavaggio, 1 ml / pozzetto di rosso alizarina S sono stati aggiunti per 20 minuti a temperatura ambiente.
- Le cellule sono state lavate da H 2 O deionizzata quattro volte (5 min per ogni volta con gentile dondolio) per rimuovere qualsiasi ulteriore Alizarin rosso.
- 1 ml / pozzetto H 2 O sono stati aggiunti per impedire alle cellule di essiccazione.
- Le piastre sono stati assunti i componenti visivipection e / o l'acquisizione dell'immagine.
- Per il saggio di quantificazione Rosso alizarina S, H 2 O sono stati sostituiti da 1 ml di acido acetico 10% in ciascun pozzetto della piastra da 6 pozzetti e incubare per 30 min a temperatura ambiente con agitazione.
- Poi, monostrato di cellule / pozzetto sono stati raschiare e sia l'acido acetico e le cellule sono state trasferite nelle distinte da 1,5 ml micro-centrifuga tubi. (Nota:. Ogni bene dovrebbe essere il trasferimento in un tubo separato vale a dire tre pozzi di prova e tre pozzi di controllo per ogni gruppo ED & OG)
- Tubi furono vortexate energicamente per 30 sec.
- Riscaldare a 85 ° C per 10 min. (Nota: per evitare l'evaporazione, i tubi sono stati sigillati con parafilm.)
- Dopo il riscaldamento, i tubi sono stati trasferiti in ghiaccio per 5 min. (Nota: I tubi non devono essere aperti finché diventano raffreddato.)
- Gli impasti sono stati centrifugati a 20.000 xg per 15 min. Mentre centrifugazione, alizarina standard Red sono stati effettuatiup.
Standard Rosso alizarina S sono state preparate prima diluendo il tampone di diluizione e usato per fare diluizioni seriali due volte in base alla tabella.
| Gamma Alta concentrazione di colorante | Gamma bassa concentrazione di colorante | ||||||||||||
| 2 mM | 1 mM | 500 pM | 250 pM | 125 pM | 62,5 pM | 31,3 pM | 15,6 pM | 7,8 pM | 3,9 pM | 1,9 pM | 0,9 pM | 0,4 micron | Vuoto |
- Dopo la centrifugazione, 1 ml di surnatante / tubo sono state trasferite nei nuovi separati 1,5 ml micro-provette da centrifuga.
- Il pH è stato neutralizzato con ~ 375 microlitri 10% Idrossido di ammonio per provetta. (Nota: la rabbia pH dovrebbe essere 4,1-4,5.)
- 150 ml di standard e campioni (include test separati e controlli) sono stati aggiunti in una parete opaca, fondo trasparente piastra a 96 pozzetti.
- L'assorbanza è stata letta a 405 nm e valori di assorbanza dei campioni sono stati confrontati con trama standard per ulteriori analisi.
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Representative Results
- DPSCs che sono stati ottenuti dalla dissociazione enzimatica (DPSC-ED) sono mostrati qui a 10 giorni, 15,18 (Figura 1). Le colonie avviato per formare su quasi 3 a 5 giorni dopo l'isolamento.
- DPSCs superato (DPSC-OG) sono mostrati nella Figura 2, il giorno 5, 10, 13 e 18. Fibroblasto-simili cellule hanno cominciato a migrare dal tessuto pulpare nel pallone da parallelo ordinazione quasi 5 giorni dopo la semina.
- DPSCs al passaggio 3 utilizzando entrambi i metodi sono illustrati nella Figura 3. Entrambi i tipi di DPSCs erano quasi nella stessa dimensione e morfologia.
- Immunofenotipo risultati in DPSC-ED e DPSC-OG (Figura 4). Questi risultati indicavano la presenza di marcatori di cellule staminali mesenchimali di come CD44, CD73, CD105 e CD90, e l'assenza di marcatori ematopoietici & endoteliale quali CD34, CD45 e CD11b . Le espressioni di CD105 e CD146 (perivascolare marcatore) erano più in DPSC-OG rispetto DPSC-ED.STRO-1 era negativo in entrambi i gruppi. (Linee blu di cui OG gruppo, mentre le linee rosse di cui ED uno, linee gialle indicato isotipi.)
- Morfologia Rosso alizarina S & risultati quantificazione per la valutazione della formazione di tessuto mineralizzato in DPSC-ED-OG DPSC e il giorno 21 sono mostrati in Figura 5. Il colore rosso più assorbente la deposizione di calcio più. Questi risultati indicano deposizione di calcio in più differenziato DPSC-ED (d) in confronto con DPSC-OG (c). (Repliche triplice copia tecnici) quantificazione del Rosso alizarina S indicato anche il significativo (*) maggiore concentrazione di colorante tra DPSC-DE rispetto ai gruppi OG. (Concentrazione di colorante è aumentato in modo significativo (**, ***) tra i test e controlli di ogni gruppo (DE o OG) che sono indicati la deposizione di calcio dopo il processo di differenziazione)
(Note: A t-test accoppiato analisi è stata utilizzata per determinare le differenze nellaquantità di matrice mineralizzata prodotto gruppi ED OG e dopo l'induzione della differenziazione. I risultati sono stati espressi come media ± SEM. (Significato assunto per P <0,05)
- QPCR risultati dell'espressione dei geni e odontoblast mineralizzata correlata (DSPP) e (MEPE, ALP) rispettivamente, in differenziato DPSC-ED-OG & DPSC sono mostrati in Figura 6. Questi risultati indicavano la significativa up-regolazione di ALP & MEPE dopo la differenziazione dei gruppi e ED OG. Nel frattempo, le espressioni ALP e MEPE erano significativamente più alti nei differenziata DPSC-ED rispetto alla differenziata DPSC-OG. Tuttavia, non vi è differenza nella espressione di DSPP in cellule differenziate tra i due gruppi (gene housekeeping: Tirosina 3-monooxygenase/tryptophan 5-monoossigenasi proteina di attivazione (YWHAZ)). 28
(Nota:. QPCR I dati sono stati analizzati utilizzando il metodo comparativo CT A pa ired t-test di analisi è stata utilizzata per determinare le differenze nell'espressione genica tra ED e gruppi OG prima e dopo la differenziazione, e anche tra le cellule differenziate dei due gruppi. I risultati sono stati espressi come media ± SEM. (Importanza assunto per P <0,05) (repliche tecniche triplice copia)
Figura 1. Enzimatica dissociato DPSC (DPSC-DE) al giorno 10, 15 e 18. Ingrandimento bar = 200 micron.
Figura 2. Superato DPSCs (DPSC-OG) il giorno 5, 10, 13 e 18. Ingrandimento bar = 200 micron.
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Figura 3. Superato DPSCs (DPSC-OG) e digeriti enzimatici DPSCs (DPSC-DE) morfologie in passaggio 3. Ingrandimento bar = 200 micron. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 4. Istogramma sovrapposto dei immunofenotipizzazione risultati in DPSC-ED (rosso scuro) e DPSC-OG (blu). (Linee gialle rappresentano isotipi). Clicca qui per ingrandire la figura .
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Figura 5. Rosso alizarina S risultati della colorazione differenziata in DPSC-OG (c), e differenziato DPSC-ED (d). (A) e (b) di cui ai controlli. Quantificazione dei test Rosso alizarina S mostra un assorbimento più colorante in differenziato DPSC-ED differenziato rispetto al gruppo OG (e). Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 6. Risultati qPCR dell'espressione dei geni odontoblast e mineralizzata-correlate (DSPP) e (MEPE, ALP), in differenziato DPSC-ED & DPSC-OG. L'espressione di MEPE, ALP, e DSPP nelle cellule differenziate confrontare al controllo ha confermato la differenziazione dei due gruppi in odontoblast (ac). Questi risultati indicato la significativa up-regolazione di ALP e MEPE dopo la differenziazione dei gruppi di ED e OG (a & b). Nel frattempo, le espressioni ALP e MEPE erano significativamente più alti nei differenziata DPSC-ED rispetto alla differenziata DPSC-OG (a & b). Tuttavia, non vi è alcuna differenza di espressione di DSPP in cellule differenziate di entrambi i gruppi (c) (gene housekeeping: Tirosina 3-monooxygenase/tryptophan 5-monoossigenasi proteina di attivazione; YWHAZ). Clicca qui per ingrandire la figura .
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Discussion
Questo protocollo descrive il processo di isolamento e caratterizzazione di hDPSCs da polpa dentale utilizzando due metodi, dissociazione enzimatica e la conseguenza diretta di cellule staminali da espianti di tessuto pulpare. Inoltre, in vitro differenziazione di queste cellule in odontoblasti, è stata valutata mediante dosaggio quantitativo Rosso alizarina S & QPCR.
Protocolli esistenti per isolare dal tessuto pulpare dente umano era stato utilizzato diversi strumenti quali pinze (forcipe osseo) 9, extirpation ago 29, Gracey curette 30, frese dentali fessura 4, ecc Tali metodi sono lunghi, mentre considerando basso livello di surriscaldamento di pasta aggiungendo acqua continuo. Tuttavia, nella tecnica attuale, disco diamantato dentale viene utilizzato per l'isolamento di tessuto pulpare, che è un modo rapido per tagliare dente con la contaminazione minima in unico passaggio, e minimizza il surriscaldamento della polpa durante un processo di taglio. Inoltre, un hDPSCsri infine differenziate in odontoblasti che non sono mai stati confrontati nel caso di denti umani permanenti per scopo discusso. Valutazione comparativa dei hDPSCs differenziati (gruppi di ED & OG) dal dosaggio quantitativo Rosso alizarina S indicato il potenziale di mineralizzazione più elevato di hDPSC-DE rispetto a OG gruppo. Questi risultati confermato anche da QPCR. DSPP, ALP e MEPE come la mineralizzazione marcatori up-regolata dopo la differenziazione odontoblast in entrambi i gruppi. D'altra parte, le espressioni di MEPE & ALP erano più elevati nei differenziata hDPSC-ED rispetto al controllo. In accordo con lo studio precedente circa 27 denti decidui, le cellule staminali derivate da denti permanenti utilizzando ED o metodi di isolamento OG anche mostrare comportamenti di differenziazione simili alle stesse condizioni. Inoltre, per una migliore valutazione comparativa, in questo studio, sia hDPSC-ED & hDPSC-OG sono stati isolati dagli stessi individui.
Espressioni di un MSC marcatorid assenza di marcatori heamatopietic / endoteliale identificare due tipi di hDPSCs come cellule staminali mesenchimali. D'altra parte, 105 CD / CD 146 erano superiori in DPSC-OG rispetto ai gruppi ED. Nonostante i dati esistenti in base alla presenza di STRO-1 in DPSCs 31, i nostri risultati hanno mostrato alcuna espressione di STRO-1 in entrambi i gruppi. Tuttavia, la diversità significativa dell'espressione del marcatore di superficie in diversi studi potrebbe essere dovuto alle condizioni di coltivazione sia come numero di passaggio, composizione del terreno, ecc o variazioni tra tra i diversi donatori. L'assenza di STRO-1 in entrambi i gruppi può indicare che l'espressione di questo marcatore potrebbe non influenzano direttamente differenziazione potenziale odontoblast (non mostrato in video).
Diverso isolamento hDPSCs condizione potrebbe portare la capacità diversa differenziazione. Queste differenze possono essere dovute alla presenza di diverse popolazioni nel tessuto pulpare. Così, selezionando la mig isolamento metodiht essere utile per la riparazione dei tessuti-bersaglio specifico e rigenerazione per i futuri approcci clinici. I nostri risultati indicano la capacità superiore di mineralizzazione enzimatica DPSC digerito rispetto a quelli cresciuti. Tuttavia, ulteriori studi, come la valutazione della formazione della struttura tubolare in vivo e in vitro, sono necessari per determinare quale di queste due procedure è applicabile funzionale dentina / paste terapie di rigenerazione tissutale.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Si ringrazia il Dr. Leila Shakeri & Dr. Aref Dournaei per la loro discus critica e Mohammad Reza Khadem Sharif per i suoi supporti tecnici.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| α-MEM | GIBCO | 11900-073 | |
| Collagenase type I | Sigma-Aldrich | C0130-100MG | |
| Dispase | GIBCO | 17105-041 | |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
| Fetal Bovine serum defined (FBS) | HyClone | SH30070.03 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960-5G | |
| L-glutamine | GIBCO | 25030-024 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| β-Glycerol phosphate disodium salt hydrate, BioUltra | Sigma | G9422-100G | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Osteogenesis Assay Kit | Millipore | PS01802031 | |
| Mouse IgG2b-PE isotype control | BD pharmingen | 50808088029 | |
| FITC mouse IgG2b isotype control | BD pharmingen | 559532 | |
| FITC mouse IgG1 κ isotype | BD pharmingen | 11471471 | |
| FITC/PE mouse anti-human CD34/CD45 | BD pharmingen | 341071 | |
| PE anti-human CD146 | BD pharmingen | 550315 | |
| Monoclonal mouse anti-human CD90/FITC | Daka | 00034418 | |
| PE mouse anti-human CD73 | BD pharmingen | 550257 | |
| Anti-h CD105/Endoglin PE | BD pharmingen | FAB10971P | |
| PE mouse anti-human CD11b/Mac1 | BD pharmingen | 5553888 | |
| CD44 PE mouse anti human | BD pharmingen | 555479 | |
| Phosphate buffer Solution (PBS) | GIBCO | 003000 | |
| 70-μm cell strainer | Falcon | 352360 | |
| 0.2 μm syringe filter | Millex-GV | SLGV033RB | |
| 25 cm2 culture flask | Sigma-Aldrich | Z707481 | |
| EQUIPMENT | |||
| BD FACSCalibur | BD | 342975 | |
| multiskan microplate spectrophotometer | Thermo scientific | 51119200 | |
| Fleurcense Microscope | Olympus | ||
| Flowing Software version 2.3.1 | |||
References
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