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Medicine

Isolamento, caracterização e comparativa Diferenciação de células-tronco da polpa dentária Derivado de dentes permanentes usando dois métodos diferentes

Published: November 24, 2012 doi: 10.3791/4372

Summary

O método descrito o isolamento e caracterização de células pulpares humanas estaminais (hDPSCs) usando

Abstract

Introduction

As células-tronco são células que possuem clonogénicos duas características marcantes, conhecidos como multi-potência e auto-renovação 15. Entre todas as células estaminais com potências diferentes replicativas, as células estaminais dentários como as células-tronco pós-natais têm chamado a atenção nos últimos anos por causa da sua acessibilidade, plasticidade e capacidade proliferativa elevada em comparação com as células estaminais adultas outros 16. Caracteristicamente, semelhante para as células estaminais mesenquimais, as células estaminais da polpa dentária são células aderentes clonogénicas que têm a capacidade de diferenciação em múltiplas mesênquima e / ou não-mesênquima linhagens, tanto in vitro como in vivo. 1-8,17,18 DPSCs são identificados pela a sua expressão negativa de antigénios hematopoiéticas (por exemplo, CD45, CD34, CD14), e da expressão de CD90 positivas, CD29, CD73, CD105, CD44 e STRO-1, 19,20.

Potencial obtida fácil com o mínimo de dor e morbidade fazer DPSCs humanos como um valiosofonte capaz de MSCs em comparação com as fontes comuns, tais como a da medula óssea as células estaminais mesenquimais 21. Em geral, DPSCs ter sido isolada por qualquer método outgrowth, isto é, a migração de células estaminais a partir de explantes de tecido de celulose (DPSC-OG) 22-24, e / ou por digestão enzimática (DPSC-ED) 4,6,25. Estudos anteriores têm mostrado que o método de isolamento e as condições de cultura podem induzir diferentes populações ou linhagens sob passagens in vitro 26,27. No caso dos dentes permanentes (pDPSCs), Huang et al mostraram que enzimáticas pDPSCs digeridos têm um maior potencial de proliferação em comparação com os DPSCs crescido. 26 Por outro lado, no caso dos dentes de leite (dDPSCs), demonstrou-se que STRO-1 e CD34 marcadores expressa mais em dDPSC-ED em comparação com dDPSC-OG. Além disso, dDPSC-ED apresentado maior taxa de mineralização em meio definido osteo / odonto. 27 Portanto, devido ao excelente potencial de DPSCs em regenerative medicina, mais estudos serão necessários para uma melhor compreensão das possíveis várias populações que são derivadas de diferentes métodos de isolamento.

Aqui, ela foi a tentativa de introduzir de maneira fácil a extracção da polpa, utilizando-se um passo de disco de diamante dental para facilitar o processo de extracção da polpa. Além disso, após o isolamento de células-tronco derivadas de celulose, aplicando métodos de ED ou OG, propriedades gerais e capacidade de diferenciação entre os dois grupos também foram investigados.

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Protocol

1. Prepare a solução de enzima e meio de proliferação (PM)

  1. Fazer colagenase tipo I Solução: Pesar colagenase tipo I (12 mg / ml) e dissolver em 1 ml de PBS e de filtro usando um filtro de seringa de 0,2 | im. Em seguida, colocá-lo 15 ml de tubo e mantê-lo a -20 ° C até ser necessário.
  2. Solução fazer dispase: Pesar dispase (16 mg / ml) e dissolver em 1 ml de PBS e de filtro usando um filtro de seringa de 0,2 | im. Em seguida, colocá-lo 15 ml de tubo e manter a 4 ° C até ser necessário.
  3. Fazer a solução de enzima: Adicione 1 ml de colagenase tipo I de soluções (12 mg / ml) e 1 ml de soluções de dispase (16 mg / ml) na 2 ml de PBS estéril, contendo 100 mg / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina. Concentração total de colagenase e dispase I em volume final deve ser de 4 mg / ml e 3 mg / ml, receptivamente. Em seguida, este volume da alíquota para quatro tubos de 15 ml, contendo cada um deles uma solução de enzima ml. Cada tubo podia ser usado para uma digestão de celulose.
  4. Fazer a solução de lavagem: Adicionam-se 100 mg / ml de penicilina, 100 mg / mL de estreptomicina em PBS.
  5. Fazer meio básico: Alpha modificação do meio de Eagle (α-MEM) suplementado com FBS a 10% e 100 unidades / ml de penicilina, estreptomicina 100 mg / ml.
  6. Fazer a mídia Proliferação (PM): Alpha modificação do meio de Eagle (α-MEM) suplementado com FBS a 10%, 100 uM de ácido L-ascórbico-2-fosfato, 2 mM de L-glutamina, 100 unidades / penicilina ml, 100 mg / ml estreptomicina, 0,25 mg / ml de anfotericina B.
  7. Fazer media odontogênicos: Alpha modificação do meio de Eagle (α-MEM) suplementado com FBS a 10%, 100 uM de ácido L-ascórbico-2-fosfato, 2 mM de L-glutamina, 100 unidades / penicilina ml, 100 mg / ml de estreptomicina, 0,01 uM dexametasona, 5 mM de fosfato de glicerol β-, 1,8 mM de fosfato monopotássico.

2. Prepare polpa dental humano para Dental Isolatio celular Pulp Stemn

  1. Normais terceiros molares humanos foram coletados de adultos (21-29 anos de idade) na Clínica de Odontologia da Imam Ali, sob aprovado Institutional Review Board (IRB).
  2. Os dentes foram colocados em meio básico (α-MEM suplementado com FBS 10%) e foram transferidos em laboratório, a 4 ° C.
  3. Sob a condição estéril, trabalhando dentro de um capuz de risco biológico de fluxo laminar, set-up foi feita uma placas de 100 mm de Petri para cada dente a ser processado. Superfícies dos dentes foram limpos por etanol 70%.
  4. Enquanto trabalha em um dos pratos de Petri-, dente foi mantido por meio de fórceps dentais e uma lâmina de bisturi foi utilizada para limpar os detritos e do ligamento periodontal, nas raízes.
  5. Cemento-esmalte junção foi lentamente cortar usando esterilizados disco dental para revelar a câmara pulpar. Deve-se considerar que o processo de corte tem de ser realizada lentamente para reduzir o sobreaquecimento do tecido dental.
  6. Tecido pulpar foi gentilmente separada da coroa e raiz. Polpa foi cortada em pequenos pedaços, com o auxílio de uma lâmina de bisturi.

3. Isolamento Pulp humana Dental

  1. Tecidos pulpares foi submetido a dissociação enzimática do tecido pulpar ou conseqüência direta de células a partir de explantes de polpa de tecidos para isolamento de hDPSCs.
  2. Dissociação enzimática do tecido pulpar:
    1. Pequenos pedaços de tecidos de polpa foram transferidos para solução de enzimas, durante 1 hora a 37 ° C. Vortex cada 30 minutos para ajudar a romper o tecido.
    2. Depois, os agregados celulares grandes foram removidos e as suspensões unicelulares foram obtidos pela passagem de células através de um coador de células de 70 | iM.
    3. Unicelulares suspensões foram centrifugadas a 1200 rpm durante 5 min à temperatura ambiente.
    4. Os sobrenadantes foram cuidadosamente pipetado fora e pelete foi re-suspenso em 1 ml de meio de proliferação (PM). (Nota: FBS em meio de proliferação encerrar enzimática disassociação.)
    5. Unicelulares suspensões de polpa dentária foi semeada em frasco de cultura de 25 cm 2 com AM e, em seguida, incubadas a 37 ° C em 5% de CO 2.
    6. O meio de cultura foi mudado de três em três dias até a confluência celular foi alcançada.
  3. Conseqüência direta de células a partir de explantes de tecido de celulose:
    1. Polpa foi picada em 1-2 mm de fragmentos, e cada peça foi colocada em 25-cm 2 frascos de cultura com PM e, em seguida, incubadas a 37 ° C em 5% de CO 2. Deve-se considerar que o volume total da PM para crescimento de célula deve apoiar a fixação de peças de celulose para crescimento celular ainda (2-3 ml por frasco).
    2. O meio foi mudado após crescimento foi observado.
    3. As células crescido em confluência foram sub-cultivadas a uma razão de 1:4 (passagem 1).

4. Imunofenotipagem

  1. 250.000 células /tubo de ambos os tipos de células na passagem 3 foram incubadas por PE ou FITC-conjugado anti-humano com anticorpos com os seus isotipos durante 30 min a 4 ° C num local escuro. (Nota:. Da concentração de anticorpos foi aplicada de acordo com o protocolo de fabricação)
  2. Após o tempo de incubação, 100 uL de PBS ou de FACS solução de diluição foi adicionada a cada tubo e centrifugou-se a 1200 rpm durante 5 min, em local escuro.
  3. Os sobrenadantes foram removidos e pelotas foram re-suspensas em 100 ul de PBS ou de diluição FACS em local escuro.
  4. Marcadores de superfície alvo (marcadores CD) foram avaliados por BD FACSCalibur.

5. A indução da diferenciação de células em DPSCs mineralizadas e quantificada Ensaio Vermelho de alizarina S

  1. DPSCs que foram obtidos por um ou outro dissociação enzimática do tecido pulpar (conhecido como DPSC-ED) ou excrescência celular directa a partir de explantes de tecido de celulose (DPSC-OG) foram sub-cultivadas durante 3 passagens.
  2. At A passagem 3, as células foram de semente em uma placa de 6 poços a 5000 células / poço.
  3. Na confluência de 60%, o meio foi substituído por odontogênico PM convencional. Três cavidades foram permaneceu como um controlo negativo pela adição de meio de crescimento.
  4. Médio mudam a cada 3 dias até o dia 21.
  5. No dia 21, as células foram lavadas com PBS e foram fixadas em 1 ml / poço de 10% de paraformaldeído durante 15 min à temperatura ambiente.
  6. Em seguida, foram pipetados paraformaldeído fora, com cuidado e as células foram lavadas 3 vezes (5-10 min para cada vez) com água destilada H 2 O. (Nota: Evite perturbar a monocamada.)
  7. Após a lavagem, 1 ml / poço de vermelho de alizarina S foram adicionados durante 20 min à temperatura ambiente.
  8. As células foram lavadas por desionizada H 2 O (quatro vezes 5 min de cada vez, com agitação suave), para remover qualquer vermelho de alizarina adicional.
  9. 1 ml / poço de H 2 O foram adicionados para evitar que as células de secagem.
  10. As placas foram assumidos como ins visuaispection e / ou aquisição de imagem.
  11. Para o ensaio com vermelho de alizarina S quantificação, H 2 O foram substituídos por 1 ml de ácido acético a 10% a cada poço da placa de 6 poços e incubar durante 30 min à temperatura ambiente com agitação.
  12. Então, monocamada de células / poço foram scrape & tanto o ácido acético e as células foram transferidas para as separar de 1,5 ml de centrífuga de micro-tubos. (Nota:. Cada poço deve ser transferido para um tubo separado ou seja, três poços de teste e três poços de controle para cada grupo de ED & OG)
  13. Os tubos foram agitados vigorosamente durante 30 sec.
  14. Aquece-se a 85 ° C durante 10 min. (Nota: para evitar a evaporação, os tubos foram selados com parafilme.)
  15. Após o aquecimento, os tubos foram transferidos para gelo, durante 5 min. (Nota: Os tubos não deve ser aberta até que se esfriou.)
  16. As suspensões foram centrifugadas a 20.000 xg durante 15 min. Embora a centrifugação, as normas de vermelho de alizarina foram feitas-se.

Padrão vermelho de alizarina S foram preparadas por diluição da primeira tampão de diluição e usado para fazer duas diluições em série com base na tabela.

Gama Alta concentração de corante Gama Baixa concentração de corante
2 mM 1 mM 500 uM 250 uM 125 uM 62,5 mM 31,3 mM 15,6 mM 7,8 mM 3,9 mM 1,9 mM 0,9 mM 0,4 uM Em branco
  1. Após a centrifugação, 1 ml de sobrenadante / tubo foram transferidas para novos separados de 1,5 ml de centrífuga de micro-tubos.
  2. O pH foi neutralizado com 375 ul ~ 10Hidróxido de amónio% por tubo. (Nota: a raiva pH deve ser 4,1-4,5).
  3. 150 ul de padrão e amostras (inclui testes separados e controlos) foram adicionados a um opaco de parede de fundo transparente, de 96 poços da placa.
  4. A absorvância foi lida a 405 nm e os valores de OD das amostras foram comparadas com o lote padrão para análise posterior.

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Representative Results

  1. DPSCs que foram obtidos por dissociação enzimática (DPSC-ED) são mostrados aqui no dia 10, 15,18 (Figura 1). As colónias iniciadas de modo a formar em quase 3 a 5 dias após o isolamento.
  2. DPSCs outgrown (DPSC-OG) são mostrados na Figura 2, no dia 5, 10, 13 & 18. Fibroblast-como as células começaram a migrar a partir do tecido da polpa para o balão através paralelo ordenação por cerca de 5 dias após a semeadura.
  3. DPSCs a passagem 3, utilizando os dois métodos estão apresentados na Figura 3. Ambos os tipos de DPSCs eram quase do mesmo tamanho e morfologia.
  4. A imunofenotipagem resulta em DPSC-ED e DPSC-OG (Figura 4). Estes resultados indicaram a presença de marcadores de células estaminais mesenquimais, tais como CD44, CD73, CD105 e CD90, e a ausência de marcadores hematopoiéticas e endoteliais, tais como CD34, CD45 e CD11b . As expressões de CD105 e CD146 (perivascular marcador) estavam mais na DPSC-GO em comparação com DPSC-ED.STRO-1 foi negativo em ambos os grupos. (Linhas Azul referida OG grupo, enquanto que as linhas vermelhas que se refere o ED um, linhas amarelas indicado isotipos.)
  5. Morfologia Vermelho de alizarina S & resultados de quantificação para avaliação da formação do tecido mineralizado, em DPSC-ED-OG e DPSC no dia 21 são mostrados na Figura 5. A cor vermelha mais absorver a maior deposição de cálcio. Estes resultados indicam a deposição de cálcio em mais diferenciada DPSC-ED (d), em comparação com DPSC-OG (c). (Repetições em triplicado técnicas) quantificação de vermelho de alizarina S também indicada a concentração de (*) significativamente maior de corante entre DPSC-ED, em comparação com os grupos de OG. (Concentração de corante também aumentou significativamente (**, ***) entre os testes e controles de cada grupo (ED ou OG) que são indicadas a deposição de cálcio, após o processo de diferenciação)

(Nota: A análise do teste t emparelhado foi utilizado para determinar as diferenças noquantidade de matriz mineralizada produzida grupos DE OG e após a indução de diferenciação. Os resultados foram expressos como média ± EPM. (Significância assumido para P <0,05)

  1. QPCR resultados da expressão de genes de odontoblastos e mineralizado relacionada (DSPP) e (MEPE, ALP), respectivamente, em diferenciada DPSC-ED & DPSC-OG são mostrados na Figura 6. Estes resultados indicaram o significativo aumento da regulação da ALP & MEPE após a diferenciação dos grupos DE e OG. Enquanto isso, as expressões de ALP e MEPE foram significativamente maiores nos diferenciada DPSC-ED relação ao diferenciado DPSC-OG. No entanto, não existe qualquer diferença na expressão da DSPP em células diferenciadas entre os dois grupos (gene arrumação: 3-monooxygenase/tryptophan Tirosina 5-mono-oxigenase da proteína de activação (YWHAZ)) 28.

(Nota:. QPCR Os dados foram analisados ​​utilizando o método CT comparativo A pa A análise do teste t IRED foi utilizado para determinar as diferenças na expressão de genes entre os grupos ED & OG antes e após a diferenciação, e também entre as células diferenciadas dos dois grupos. Os resultados foram expressos como média ± EPM. (Significância assumido para P <0,05) (repetições em triplicata técnicas)

Figura 1
Figura 1. Enzimática DPSC dissociado (DPSC-ED) no dia 10, 15 e 18. Ampliação de barras = 200 uM.

Figura 2
Figura 2. Outgrown DPSCs (DPSC-OG), no dia 5, 10, 13 e 18. Ampliação de barras = 200 uM.

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Figura 3. Outgrown DPSCs (DPSC-GO) e enzimáticas DPSCs digeridos (DPSC-ED) morfologias de passagem em 3. Barra de Ampliação = 200 m. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 4
Figura 4. Histograma Sobrepor de imunofenotipagem resulta em DPSC-ED (vermelho escuro) e DPSC-OG (Azul). (Linhas amarelas representam isotipos). Clique aqui para ver maior figura .

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Figura 5. Vermelho de alizarina S resultados de coloração em diferenciada DPSC-OG (c), e diferenciados DPSC-ED (d). (A) e (b) se refere aos controlos. Quantificação de ensaio Alizarina Red S mostrar maior absorção de corante em diferenciada DPSC-ED em comparação com o grupo diferenciado OG (e). Clique aqui para ver maior figura .

Figura 6
Figura 6. QPCR resultados da expressão de genes de odontoblastos e mineralizado relacionada (DSPP) e (MEPE, ALP), respectivamente, em diferenciada DPSC-ED & DPSC-OG. A expressão de MEPE, ALP, & DSPP células diferenciadas em comparação com o controlo confirmaram a diferenciação dos dois grupos em odontoblastos (ac). Estes resultados indicado o significativo aumento da regulação da ALP & MEPE após a diferenciação dos grupos DE e OG (a & b). Enquanto isso, as expressões de ALP e MEPE foram significativamente maiores nos diferenciada DPSC-ED relação ao diferenciado DPSC-OG (a & b). No entanto, não existe qualquer diferença na expressão da DSPP em células diferenciadas, de ambos os grupos (c) (gene de limpeza: 3-monooxygenase/tryptophan Tirosina 5-mono-oxigenase da proteína de activação; YWHAZ). para ver figura maior .

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Discussion

Este protocolo descreve o processo de isolamento e caracterização de hDPSCs da polpa dentária através de dois métodos, dissociação enzimática e excrescência directa de células estaminais a partir de explantes de tecido de celulose. Além disso, a diferenciação in vitro destas células em odontoblastos, foi avaliada por ensaio quantitativo Vermelho de alizarina S & QPCR.

Os protocolos existentes para o isolamento de tecido de polpa de dentes humanos foram utilizados diferentes instrumentos tais como um alicate pinça (osso) 9, extirpação de agulha 29, Gracey cureta 30, brocas fissuras dentárias 4, etc Estes métodos são demorados, considerando ao mesmo tempo baixo nível de sobreaquecimento da polpa pela adição de água de forma contínua. No entanto, na técnica actual, o disco de diamante dental é utilizado para o isolamento de tecido de celulose, que é uma maneira rápida para cortar dente com contaminação mínima no processo de um só passo, e minimiza o superaquecimento de celulose durante um processo de corte. Além disso, um hDPSCsre finalmente diferenciar-se em odontoblastos que nunca foram comparados no caso dos dentes permanentes humanos por objectivo discutidos. Avaliação comparativa de hDPSCs diferenciados (grupos ED & GO) por ensaio quantitativo Alizarina Red S indicou o maior potencial de mineralização de hDPSC-ED em comparação com OG grupo. Estes resultados também confirmado por QPCR. DSPP, ALP e MEPE como a mineralização marcadores-reguladas após a diferenciação odontoblástica em ambos os grupos. Por outro lado, as expressões de MEPE & ALP foram maiores nos diferenciada hDPSC-ED em comparação com o controle. De acordo com o estudo anterior sobre dentes decíduos 27, as células-tronco derivadas de dentes permanentes, utilizando ED ou métodos de isolamento OG também apresentam comportamentos semelhantes diferenciação nas mesmas condições. Além disso, para uma melhor avaliação comparativa, no presente estudo, ambos hDPSC-ED & hDPSC-OG foram isolados a partir dos mesmos indivíduos.

Expressões de uma MSC marcadoresd a ausência de marcadores heamatopietic / endotelial identificar ambos os tipos de hDPSCs como as células estaminais mesenquimais. Por outro lado, CD 105/146 CD foram maiores no DPSC-OG em comparação com os grupos de ED. Apesar da evidência existente de acordo com a presença de STRO-1 em DPSCs 31, os nossos resultados não mostraram expressão de STRO-1, em ambos os grupos. No entanto, a diversidade significativa da expressão do marcador de superfície em diferentes estudos pode ser devida a condições de cultivo quer como número de passagens, a composição dos meios de comunicação, etc, ou variações interindividuais entre diferentes doadores. A ausência de STRO-1, em ambos os grupos, pode indicar que a expressão deste marcador pode não afectam directamente o potencial de diferenciação odontoblástica (não mostrado no vídeo).

Condição de isolamento diferente hDPSCs pode trazer capacidade de diferenciação diferente. Estas diferenças podem dever-se à existência de populações diferentes no tecido pulpar. Assim, seleccionando o isolamento mig métodosht ser útil para alvejado-tecido de reparação e regeneração específica para futuras abordagens clínicas. Os resultados obtidos indicaram a maior capacidade de mineralização de DPSC digerido enzimático em comparação com os crescido. No entanto, estudos adicionais, tais como a avaliação da formação de estrutura tubular, in vivo e in vitro, são necessários para determinar qual dos dois procedimentos é aplicável para a dentina funcional / celulose terapias de regeneração de tecidos.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Agradecemos Dra. Leila Shakeri & Dr. Aref Dournaei para sua discussão crítica e Mohammad Reza Sr. Khadem Sharif por seus apoios técnicos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-MEM GIBCO 11900-073
Collagenase type I Sigma-Aldrich C0130-100MG
Dispase GIBCO 17105-041
Penicillin/streptomycin GIBCO 15140-122
Amphotericin B GIBCO 15290-018
Fetal Bovine serum defined (FBS) HyClone SH30070.03
L-ascorbic acid 2-phosphate Sigma A8960-5G
L-glutamine GIBCO 25030-024
Dexamethasone Sigma D4902
β-Glycerol phosphate disodium salt hydrate, BioUltra Sigma G9422-100G
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655
Osteogenesis Assay Kit Millipore PS01802031
Mouse IgG2b-PE isotype control BD pharmingen 50808088029
FITC mouse IgG2b isotype control BD pharmingen 559532
FITC mouse IgG1 κ isotype BD pharmingen 11471471
FITC/PE mouse anti-human CD34/CD45 BD pharmingen 341071
PE anti-human CD146 BD pharmingen 550315
Monoclonal mouse anti-human CD90/FITC Daka 00034418
PE mouse anti-human CD73 BD pharmingen 550257
Anti-h CD105/Endoglin PE BD pharmingen FAB10971P
PE mouse anti-human CD11b/Mac1 BD pharmingen 5553888
CD44 PE mouse anti human BD pharmingen 555479
Phosphate buffer Solution (PBS) GIBCO 003000
70-μm cell strainer Falcon 352360
0.2 μm syringe filter Millex-GV SLGV033RB
25 cm2 culture flask Sigma-Aldrich Z707481
EQUIPMENT
BD FACSCalibur BD 342975
multiskan microplate spectrophotometer Thermo scientific 51119200
Fleurcense Microscope Olympus
Flowing Software version 2.3.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Isolamento, caracterização e comparativa Diferenciação de células-tronco da polpa dentária Derivado de dentes permanentes usando dois métodos diferentes
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Karamzadeh, R., Eslaminejad, M. B.,More

Karamzadeh, R., Eslaminejad, M. B., Aflatoonian, R. Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods. J. Vis. Exp. (69), e4372, doi:10.3791/4372 (2012).

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