Summary
Den beskrivna metoden isolering och karakterisering av humana celler Dental Pulp Stem (hDPSCs) med hjälp av antingen
Abstract
Introduction
Stamceller är klonogena celler som besitter två fantastiska funktioner, så kallade multi-styrka och självförnyelse 15. Bland alla stamceller med olika replikativa potenser, har dentala stamceller som de postnatala stamceller uppmärksammat på senare år på grund av deras tillgänglighet, plasticitet och hög proliferativ förmåga i jämförelse med andra adulta stamceller 16. Karakteristiskt, liknande de mesenkymala stamcellerna, tandpulpan stamceller är vidhäftande klonogena celler som har multipla differentiering kapacitet i mesenkym och / eller icke-mesenkymceller linjer, både in vitro och in vivo. 1-8,17,18 DPSC identifieras genom deras negativa uttryck av hematopoetiska antigener (t.ex. CD45, CD34, CD14), och positivt uttryck för CD90, CD29, CD73, CD105, CD44 och STRO-1. 19,20
Lätt erhållits potential med minimal smärta och morbiditet göra mänskliga DPSC som en värdefullkunna källa MSC jämfört med vanliga källor, såsom mesenkymala benmärgsstamceller 21. I allmänhet har DPSC isolerats antingen utväxt metod, dvs migrering av stamceller från explantat massa vävnad (DPSC-OG) 22-24, och / eller genom enzymatisk spjälkning (DPSC-DE) 4,6,25. Tidigare studier har visat att isoleringen metoden och odlingsbetingelser kan inducera olika populationer eller härstamningar under in vitro passager 26,27. I fallet med permanenta tänder (pDPSCs) avslöjade Huang et al att enzymatiska smälta pDPSCs har högre tillväxt potential jämfört med urvuxna DPSC. 26 Då det gäller mjölktänder (dDPSCs), visades att STRO-1 & CD34 markörer uttryckta mer i dDPSC-ED i jämförelse med dDPSC-OG. Dessutom visade dDPSC-ED högre mineraliseringshastighet i definierade osteo / odonto medium. 27 Därför, på grund av den enastående potential DPSC i regenerative medicin, kommer fler studier krävs för bättre förståelse av eventuella olika populationer som härrör från olika isoleringsmetoder.
Här var det försök att införa enkelt sätt av massa utvinning, genom att använda en steg tandvård diamant skiva för att underlätta processen av massa extraktion. Dessutom, efter isolering av humana massa-härledda stamceller genom att tillämpa ED eller OG metoder har allmänna egenskaper och differentiering kapacitet mellan två grupper också undersökts.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbered enzymlösning och spridning Medium (PM)
- Gör Kollagenas typ I Lösning: Väg upp kollagenas typ I (12 mg / ml) och lös upp i 1 ml PBS och filtret med en 0,2-filter xm spruta. Sedan placera det 15 ml rör och hålla den vid -20 ° C tills de behövdes.
- Gör dispas Lösning: Väg upp dispas (16 mg / ml) och lös upp i 1 ml PBS och filtret med en 0,2-filter xm spruta. Sedan placera den 15 ml tub och hålla den vid 4 ° C tills det behövs.
- Gör enzymlösning: Tillsätt 1 ml kollagenas typ I-lösningar (12 mg / ml) och 1 ml dispas lösningar (16 mg / ml) i 2 ml sterilt PBS innehållande 100 mg / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin. Totala koncentrationen av dispas och kollagenas jag slutvolymen ska vara 4 mg / ml och 3 mg / ml, receptively. Därefter alikvot denna volym i till fyra 15 ml rör, vardera innehållande 1 ml enzymlösning. Varje rör kan användas för en massa digerering.
- Gör tvättlösning: Tillsätt 100 mg / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin i PBS.
- Göra grundläggande medier: Alpha modifiering av Eagles medium (α-MEM) kompletterat med 10% FBS och 100 enheter / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin.
- Gör spridning media (PM): Alpha modifiering av Eagles medium (α-MEM) kompletterat med 10% FBS, 100 | iM L-askorbinsyra 2-fosfat, 2 mM L-glutamin, 100 enheter / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin, 0,25 mg / ml amfotericin B.
- Gör odontogena medier: Alpha modifiering av Eagles medium (α-MEM) kompletterat med 10% FBS, 100 | iM L-askorbinsyra 2-fosfat, 2 mM L-glutamin, 100 enheter / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin, 0,01 | iM Dexametason, 5 mM β-glycerolfosfat, 1,8 mM Monokaliumfosfat.
2. Förbered Human tandpulpan Mjukpapper för tandpulpan Stem Cell Isolation
- Normala humana tredje molarer samlades in från vuxna (21-29 år) vid tandkliniken på Imam Ali i godkända Institutional Review Board (IRB).
- Tänder placerades i det basiska mediet (α-MEM kompletterat med 10% FBS) och överfördes till laboratoriet vid 4 ° C.
- Enligt sterilt skick, som arbetar inom en biohazard laminärt flöde huva, installation gjordes en 100 mm petriskålar för varje tand som skall behandlas. Tandytor rengjordes med 70% etanol.
- När du arbetar i en av de Petri-skålar, var tand förs av dentala pincett och en skalpell blad användes för att rensa bort skräp och parodontala ligament på rötterna.
- Cemento-emalj korsningen långsamt minskas med hjälp steriliserad tand skiva för att avslöja massa kammaren. Det bör övervägas att skärprocessen måste utföras långsamt för att minska överhettning av dentala vävnaden.
- Massa vävnad försiktigt separeras från krona och rot. Massa vävnad skars i små bitar med hjälp av ett skalpellblad.
3. Humant tandpulpan Isolering
- Massa vävnader genomgick antingen enzymatisk dissociation av pappersmassa vävnad eller direkt cell utväxt från explantat massa vävnad för isolering av hDPSCs.
- Enzymatisk dissociation av pulpavävnad:
- Små bitar av massa vävnader överfördes till Enzymlösning under 1 timme vid 37 ° C. Vortex var 30 min för att hjälpa bryta upp vävnad.
- Efteråt har stora cellaggregat avlägsnas och Single-cellsuspensioner erhölls genom att passera cellerna genom en 70-iM cellfilter.
- Encelliga suspensioner centrifugerades vid 1.200 rpm under 5 min vid rumstemperatur.
- Supernatanter försiktigt pipetterades bort och pelleten återsuspenderades i 1 ml proliferation-medium (PM). (Obs! FBS i spridning medelstora avslutar enzymatisk dising.)
- Encelliga suspensioner av tandpulpan såddes i 25 cm 2 odlingsflaska med PM och inkuberades sedan vid 37 ° C i 5% COj 2.
- Odlingsmediet byttes var tredje dag tills cellen konfluens uppnåddes.
- Direkt cell utväxt från explantat massa vävnad:
- Pulpavävnad hackades i 1-2-mm fragment, och varje bit placerades i 25-cm 2 odlingsflaskor med PM och inkuberades sedan vid 37 ° C i 5% COj 2. Det bör övervägas att den totala volymen av PM för utväxt av celler måste stödja fastsättning av massa bitar för ytterligare celler utväxt (2-3 ml per flaska).
- Medium byttes efter utväxt observerades.
- De urvuxna celler vid sammanflödet var subodlas i förhållande 1:4 (passagen 1).
4. Immunfenotypning
- 250.000 celler /rör av båda typerna av celler i kanalen 3 inkuberades med PE eller FITC-konjugerade anti-humana antikroppar med sina isotyper under 30 minuter vid 4 ° C i mörker. (Notera:. Koncentrationen av antikroppar applicerades enligt tillverkarens protokoll)
- Efter inkubationstiden tillsattes 100 pl PBS eller FACS spädning lösning sattes till varje rör och centrifugerades vid 1.200 rpm under 5 minuter i mörk plats.
- Supernatanter avlägsnades och pelletarna åter-suspenderades i 100 pl PBS eller FACS utspädning i mörk plats.
- Riktade ytmarkörer (CD markörer) utvärderades genom BD FACSCalibur.
5. Induktion av differentiering av DPSC i Mineraliserade celler och kvantifierade alizarin red S-analys
- DPSC som erhölls genom antingen enzymatisk dissociation av pulpavävnad (känd som DPSC-DE) eller direkt cell utväxt från explantat massa vävnad (DPSC-OG) var sub-odlades under 3 passager.
- ENt Passage 3, cellerna såddes i en 6 brunnars platta vid 5.000 celler / brunn.
- Vid sammanflödet av 60%, var odontogena mediet ersättas med konventionell PM. Tre brunnar kvar som en negativ kontroll genom att tillsätta tillväxtmedium.
- Medium ändras varje 3 dagar tills dag 21.
- På dag 21, tvättades cellerna med PBS och fixerades med 1 ml / brunn 10% paraformaldehyd under 15 min vid rumstemperatur.
- Därefter paraformaldehyd pipetterades bort, försiktigt och cellerna tvättades 3 gånger (5-10 min för varje gång) med destillerat H 2 O (Obs: Undvik att störa monoskiktet.)
- Efter tvättning 1 ml / brunn Alizarin red S tillsattes under 20 minuter vid rumstemperatur.
- Celler tvättades genom avjoniserat H 2 O fyra gånger (5 min för varje gång med försiktig skakning) för att avlägsna eventuella ytterligare Alizarin röd.
- 1 ml / brunn H 2 O tillsattes för att förhindra cellerna från att torka.
- Plattorna antogs visuella inspection och / eller bild förvärv.
- För alizarin red S kvantifiering analys, var H 2 O ersattes med 1 ml 10% ättiksyra till varje brunn av 6-brunnsplatta och inkubera under 30 min vid rumstemperatur med skakning.
- Därefter, var cellmonoskikt / brunn skrapa & både ättiksyra och cellerna överfördes till de separata 1,5 ml mikro-centrifugrör. (Obs!. Varje brunn bör överföring till ett separat rör, dvs tre testbrunnar & tre brunnar kontroll för varje ED & OG grupper)
- Rören vortexades kraftigt under 30 sekunder.
- Värm till 85 ° C under 10 minuter. (Notera: för att undvika avdunstning, var rören förseglades med parafilm.)
- Efter upphettning fick rören överfördes till is under 5 min. (OBS: Rör inte bör öppnas förrän bli svalnat.)
- Uppslamningarna centrifugerades vid 20.000 x g under 15 min. Medan centrifugering har alizarin red standarder görsupp.
Alizarin red S standarden framställdes genom att först utspäda utspädningsbuffert & används för att göra 2-faldiga serieutspädningar baserat på tabellen.
| High Range koncentration av färgämne | Lågväxel koncentration av färgämne | ||||||||||||
| 2 mM | 1 mM | 500 pM | 250 pM | 125 pM | 62,5 M | 31,3 M | 15,6 M | 7,8 M | 3,9 M | 1,9 M | 0,9 M | 0,4 pM | Blank |
- Efter centrifugering, 1 ml av supematant / rör överfördes till nya separata 1,5 ml mikro-centrifugrör.
- PH neutraliserades med ~ 375 | il 10% Ammoniumhydroxid per rör. (Obs! pH-raseri ska vara 4,1-4,5.)
- 150 ul av standard & prover (innehåller separata tester och kontroller) tillsattes i en ogenomskinlig väggar, transparent botten 96-brunnsplatta.
- Absorbansen avlästes vid 405 nm och OD-värden från prover jämfördes med standard tomt för ytterligare analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
- DPSC som erhölls genom enzymatisk dissociation (DPSC-DE) visas här på dag 10, 15,18 (figur 1). Kolonierna initierade bildas på nästan 3 till 5 dagar efter isoleringen.
- Urvuxna DPSC (DPSC-OG) visas i figur 2 på dag 5, 10, 13 och 18. Fibroblastliknande celler började migrera från pappersmassa vävnad i kolven genom parallella beställa med nästan 5 dagar efter sådd.
- DPSC vid passage 3 med båda metoderna visas i figur 3. Båda typerna av DPSC var nästan i samma storlek och morfologi.
- Immunfenotypning resultat i DPSC-ED och DPSC-OG (Figur 4). Dessa resultat indikerade förekomst av mesenkymala stamceller är markörer såsom CD44, CD73, CD105 och CD90, och frånvaron av hematopoetiska & endoteliala markörer såsom CD34, CD45 och CD11b . De uttryck CD105 och CD146 (perivaskulär markör) var mer i DPSC-OG i jämförelse med DPSC-ED.STRO-1 var negativ i båda grupperna. (Blå linjer hänvisas till OG-gruppen, medan röda linjer som avses ED en angav gula linjer isotyper.)
- Alizarin red S morfologi och resultat kvantifiering för utvärdering av mineraliserad vävnad bildning i DPSC-ED och DPSC-OG på dag 21 visas i figur 5. Den mer kalcium avsättning Ju mer absorberande röd färg. Dessa resultat indikerar mer kalcium nedfall i differentierade DPSC-ED (d) i jämförelse med DPSC-OG (c). (Tredubbla tekniska replikationer) kvantifiering av alizarin red S uppgav också den betydande (*) högre koncentration av färgämne mellan DPSC-ED jämfört med OG grupper. (Färgämneskoncentration ökade också betydligt (**, ***) mellan prov och kontroller av varje grupp (ED eller OG) som angivits kalcium nedfall efter differentiering processen)
(Anmärkningar: En parat t-test-analys användes för att bestämma skillnaderna imängd mineraliserad matris producerade ED och OG grupper efter induktion av differentiering. Resultaten uttrycktes som medelvärde ± SEM. (Betydelse antas för P <0,05)
- QPCR resultaten av uttrycket av odontoblast och mineraliserad-relaterade gener (DSPP) och (MEPE, ALP) respektive i differentierade DPSC-ED & DPSC-OG visas i figur 6. Dessa resultat indikerade signifikant uppreglering av ALP & MEPE efter differentiering av ED och OG grupper. Samtidigt var ALP och MEPE uttryck betydligt högre i differentierade DPSC-ED jämfört med differentierade DPSC-OG. Det finns emellertid ingen skillnad i uttrycket av DSPP i differentierade celler mellan de båda grupperna (housekeeping-gen: Tyrosin 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenas aktivering protein (YWHAZ)). 28
(Obs!. The qPCR data analyserades med hjälp av jämförande CT metod A pa IRED t-test-analys användes för att bestämma skillnaderna i genuttryck mellan ED & OG grupper före och efter differentiering, och även mellan differentierade celler av två grupper. Resultaten uttrycktes som medelvärde ± SEM. (Betydelse antas för P <0,05) (Tredubbla tekniska replikationer)
Figur 1. Enzymatisk dissocierade DPSC (DPSC-DE) vid dag 10, 15 och 18. Förstoring bar = 200 | im.
Figur 2. Urvuxen DPSC (DPSC-OG) på dag 5, 10, 13 och 18. Förstoring bar = 200 | im.
load/4372/4372fig3highres.jpg "/>
Figur 3. Urvuxen DPSC (DPSC-OG) och enzymatiska smälta DPSC (DPSC-DE) morfologier i passagen 3. Förstoring bar = 200 nm. Klicka här för att se större bild .
Figur 4. Överlagrade Histogram för immunfenotypning resultat i DPSC-ED (mörk röd) och DPSC-OG (Blå). (Gula linjer representerar isotyper). Klicka här för att se större bild .
hres.jpg "/>
Figur 5. Alizarin red S färgning resulterar i differentierade DPSC-OG (c), och differentierad DPSC-ED (d). (A) & (b) som avses kontrollerna. Kvantifiering av alizarin red S-analysen visa mer färg absorption i differentierade DPSC-ED jämfört med differentierade OG-gruppen (e). Klicka här för att se större bild .
Figur 6. QPCR resultaten av uttrycket av odontoblast och mineraliserad-relaterade gener (DSPP) och (MEPE, ALP) respektive i differentierade DPSC-ED & DPSC-OG. Uttrycket av MEPE, ALP, och DSPP i differentierade celler jämfört med kontrollen bekräftade differentiering av båda grupperna i odontoblast (AC). Dessa rESULTAT indikerade betydande uppreglering av ALP & MEPE efter differentiering av ED och OG grupper (A & B). Samtidigt var ALP och MEPE uttryck betydligt högre i differentierade DPSC-ED jämfört med differentierade DPSC-OG (A & B). Det finns dock ingen skillnad i uttrycket av DSPP i differentierade celler i båda grupperna (c) (Hushållning gen: Tyrosin 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenas aktivering protein, YWHAZ). Klicka här för att se större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver processen för isolering och karakterisering av hDPSCs från tandpulpan använda två metoder, enzymatisk dissociation och direkt utväxt av stamceller från explantat massa vävnad. Dessutom, in vitro-differentiering av dessa celler till odontoblaster, bedömdes genom kvantitativ alizarin red S analys och QPCR.
Befintliga protokoll för att isolera massa vävnad från människa tand hade använts olika instrument såsom tänger (ben pincett) 9, extirpation nål 29, Gracey kyrettens 30, tandvård spricka borrar 4, etc. Dessa metoder är tidskrävande, samtidigt som hänsyn tas låga överhettning av massa genom tillsats av vatten kontinuerligt. Emellertid, i nuvarande teknik, är dental diamant skiva som används för isolering av pulpavävnad, vilket är ett snabbt sätt att skära tand med minimal förorening i enstegsförfarande, och minimerar överhettning av massan under en skärprocess. Dessutom hDPSCs enre slutligen differentieras i odontoblaster som aldrig har jämförts när det gäller humana permanenta tänder genom diskuterade mål. Jämförande bedömning av differentierade hDPSCs (ED & OG grupper) genom kvantitativ alizarin red S analys indikerade högre mineraliseringen potential hDPSC-ED jämfört med OG-gruppen. Dessa resultat bekräftas också av QPCR. DSPP, ALP och MEPE som mineraliseringen markörerna uppregleras efter odontoblast differentiering i båda grupperna. Å andra sidan, var uttryck MEPE & ALP högre i differentierade hDPSC-ED jämfört med kontrollen. I samråd med tidigare studie om mjölktänder 27, stamceller från permanenta tänder med hjälp av ED eller OG metoder isolering uppvisar också liknande differentiering beteenden på samma villkor. Dessutom bättre jämförande utvärdering, i denna studie, var båda hDPSC-ED & hDPSC-OG isolerad från samma individer.
Uttryck av MSC markörer ettd. frånvaron av heamatopietic / endotel markörer identifierar båda typerna av hDPSCs som mesenkymala stamceller. Å andra sidan, var CD 105 / CD 146 högre i DPSC-OG jämfört med ED grupperna. Trots den befintliga bevisningen enligt närvaron av STRO-1 i DPSC 31, visade våra resultat inte uttryck av STRO-1 i båda grupperna. Kan dock den betydande mångfald i ytmarkör uttryck i olika studier bero på de antingen odlingsförhållandena som passagen antal, sammansättning av media, etc. eller interindividuella variationer mellan olika givare. Frånvaron av STRO-1 i båda grupperna kan tyda på att uttrycket av denna markör inte direkt kan påverka potentiella odontoblast differentiering (visas ej i bild).
Olika hDPSCs isolering tillstånd kan medföra olika differentiering kapacitet. Dessa skillnader kan bero på förekomsten av olika populationer i massa vävnad. Således välja isolering metoder MIGht vara användbart för riktad-vävnadsspecifik reparation och förnyelse för framtida kliniska metoder. Våra resultat visade att högre mineraliseringen kapacitet av enzymatisk ned DPSC jämfört med de urvuxna sådana. Dock ytterligare studier, såsom bedömningen av bildandet av rörstrukturen in vivo & in vitro, som krävs för att avgöra vilken av dessa två förfaranden gäller för funktionell dentin / massa vävnad behandlingar förnyelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Leila Shakeri & Dr Aref Dournaei för deras kritiska diskus och Mr Mohammad Reza Khadem Sharif för hans tekniska stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| α-MEM | GIBCO | 11900-073 | |
| Collagenase type I | Sigma-Aldrich | C0130-100MG | |
| Dispase | GIBCO | 17105-041 | |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
| Fetal Bovine serum defined (FBS) | HyClone | SH30070.03 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960-5G | |
| L-glutamine | GIBCO | 25030-024 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| β-Glycerol phosphate disodium salt hydrate, BioUltra | Sigma | G9422-100G | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Osteogenesis Assay Kit | Millipore | PS01802031 | |
| Mouse IgG2b-PE isotype control | BD pharmingen | 50808088029 | |
| FITC mouse IgG2b isotype control | BD pharmingen | 559532 | |
| FITC mouse IgG1 κ isotype | BD pharmingen | 11471471 | |
| FITC/PE mouse anti-human CD34/CD45 | BD pharmingen | 341071 | |
| PE anti-human CD146 | BD pharmingen | 550315 | |
| Monoclonal mouse anti-human CD90/FITC | Daka | 00034418 | |
| PE mouse anti-human CD73 | BD pharmingen | 550257 | |
| Anti-h CD105/Endoglin PE | BD pharmingen | FAB10971P | |
| PE mouse anti-human CD11b/Mac1 | BD pharmingen | 5553888 | |
| CD44 PE mouse anti human | BD pharmingen | 555479 | |
| Phosphate buffer Solution (PBS) | GIBCO | 003000 | |
| 70-μm cell strainer | Falcon | 352360 | |
| 0.2 μm syringe filter | Millex-GV | SLGV033RB | |
| 25 cm2 culture flask | Sigma-Aldrich | Z707481 | |
| EQUIPMENT | |||
| BD FACSCalibur | BD | 342975 | |
| multiskan microplate spectrophotometer | Thermo scientific | 51119200 | |
| Fleurcense Microscope | Olympus | ||
| Flowing Software version 2.3.1 | |||
References
- Volponi, A. A., Pang, Y., Sharpe, P. T. Stem cell-based biological tooth repair and regeneration. Trends Cell Biol. 20, 715-722 (2010).
- Nosrat, I. V., Widenfalk, J., Olson, L., Nosrat, C. A. Dental pulp cells produce neurotrophic factors, interact with trigeminal neurons in vitro, and rescue motoneurons after spinal cord injury. Dev. Biol. 238, 120-132 (2001).
- Gandia, C., et al. Human dental pulp stem cells improve left ventricular function, induce angiogenesis, and reduce infarct size in rats with acute myocardial infarction. Stem Cells. 26, 638-645 (2008).
- Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.. 97, 13625-13630 (2000).
- Graziano, A., d'Aquino, R., Laino, G., Papaccio, G. Dental pulp stem cells: a promising tool for bone regeneration. Stem Cell Rev. 4, 21-26 (2008).
- Kerkis, I., et al. Early transplantation of human immature dental pulp stem cells from baby teeth to golden retriever muscular dystrophy (GRMD) dogs: Local or systemic. J. Transl. Med. 6, 35 (2008).
- Onyekwelu, O., Seppala, M., Zoupa, M., Cobourne, M. T. Tooth development: 2. Regenerating teeth in the laboratory. Dent. Update. 34, 20-29 (2007).
- Cordeiro, M. M., et al. Dental pulp tissue engineering with stem cells from exfoliated deciduous teeth. J. Endod. 34 (08), 962-969 (2008).
- Pierdomenico, L., et al. Multipotent mesenchymal stem cells with immunosuppressive activity can be easily isolated from dental pulp. Transplantation. 80, 836-842 (2005).
- de Mendonca Costa, A., et al. Reconstruction of large cranial defects in nonimmunosuppressed experimental design with human dental pulp stem cells. J. Craniofac. Surg. 19, 204-210 (2008).
- Tirino, V., et al. Methods for the identification, characterization and banking of human DPSCs: current strategies and perspectives. Stem Cell Rev. 7, 608-615 (2011).
- Tirino, V., Paino, F., De Rosa, A., Papaccio, G. Identification, isolation, characterization, and banking of human dental pulp stem cells. Methods Mol. Biol. 879, 443-463 (2012).
- Eslaminejad, M. B., Vahabi, S., Shariati, M., Nazarian, H. In vitro Growth and Characterization of Stem Cells from Human Dental Pulp of Deciduous Versus Permanent Teeth. J. Dent. (Tehran). 7, 185-195 (2010).
- Wei, X., Ling, J., Wu, L., Liu, L., Xiao, Y. Expression of mineralization markers in dental pulp cells. J. Endod. 33, 703-708 (2007).
- Nombela-Arrieta, C., Ritz, J., Silberstein, L. E. The elusive nature and function of mesenchymal stem cells. Nat. Rev. Mol Cell Biol. 12, 126-131 (2011).
- Huang, G. T., Gronthos, S., Shi, S. Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs. those from other sources: their biology and role in regenerative medicine. J. Dent. Res. 88, 792-806 (2009).
- Graziano, A., et al. Scaffold's surface geometry significantly affects human stem cell bone tissue engineering. J. Cell Physiol. 214, 166-172 (2008).
- d'Aquino, R., et al. Human dental pulp stem cells: from biology to clinical applications. J. Exp. Zool. B. Mol. Dev. Evol. 312, 408-415 (2009).
- Mitsiadis, T. A., Feki, A., Papaccio, G., Caton, J. Dental pulp stem cells, niches, and notch signaling in tooth injury. Adv. Dent. Res. 23, 275-279 (2011).
- Shi, S., Gronthos, S. Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp. J. Bone Miner. Res. 18, 696-704 (2003).
- Tomic, S., et al. Immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells derived from dental pulp and dental follicle are susceptible to activation by toll-like receptor agonists. Stem Cells Dev. 20, 695-708 (2011).
- Tsukamoto, Y., et al. Mineralized nodule formation by cultures of human dental pulp-derived fibroblasts. Arch. Oral Biol. 37, 1045-1055 (1992).
- About, I., et al. Human dentin production in vitro. Exp. Cell Res. 258, 33-41 (2000).
- Couble, M. L., et al. Odontoblast differentiation of human dental pulp cells in explant cultures. Calcif. Tissue Int. 66, 129-138 (2000).
- Onishi, T., Kinoshita, S., Shintani, S., Sobue, S., Ooshima, T. Stimulation of proliferation and differentiation of dog dental pulp cells in serum-free culture medium by insulin-like growth factor. Arch. Oral Biol. 44 (99), 361-371 (1999).
- Huang, G. T., Sonoyama, W., Chen, J., Park, S. H. In vitro characterization of human dental pulp cells: various isolation methods and culturing environments. Cell Tissue Res. 324, 225-236 (2006).
- Bakopoulou, A., et al. Assessment of the impact of two different isolation methods on the osteo/odontogenic differentiation potential of human dental stem cells derived from deciduous teeth. Calcif. Tissue Int. 88, 130-141 (2011).
- Curtis, K. M., et al. EF1alpha and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells. BMC Mol. Biol. 11, 61 (2010).
- Suchanek, J., et al. Dental pulp stem cells and their characterization. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech Repub. 153, 31-35 (2009).
- d'Aquino, R., et al. Human postnatal dental pulp cells co-differentiate into osteoblasts and endotheliocytes: a pivotal synergy leading to adult bone tissue formation. Cell Death Differ. 14, 1162-1171 (2007).
- Atari, M., et al. Isolation of pluripotent stem cells from human third molar dental pulp. Histol. Histopathol. 26, 1057-1070 (2011).
