Summary
Biz hedef genler ve skoru vücut büyüklüğüne fenotipi yıkmak için RNAi besleme tekniği nasıl kullanılacağını göstermektedir
Abstract
Çift iplikli RNA-aracılı girişim (RNAi) hedef gen ekspresyonu 1-3 yıkmak için etkili bir stratejidir. Bu bitkiler, omurgasızlar ve omurgalılar dahil birçok model sistemler uygulanmıştır. Vivo 4,5 RNAi ulaşmak için çeşitli yöntemler vardır. Örneğin, hedef gen, bir RNAi vektörü haline dönüştürülmesi ve daha sonra da sürekli veya geçici olarak hücre soyları ya da gen devirme etkileri elde etmek için birincil hücrelerine transforme edilebilir veya belirli bir hedef genin (RNAi Oligolar) için çift iplikli oligonükleotidler sentezlenebilir geçici olabilir hedef genleri susturmak için hücre hatları veya primer hücre dönüştürülmüştür; veya sentezlenen çift iplikli RNA molekülleri bir organizmanın içine mikroenjeksiyon yoluyla olabilir. Nematod C. yana elegans bakterileri hedef genlerin karşı çift iplikli RNA ifade ile hayvan besleme, bir gıda kaynağı olarak bakterileri kullanan uygun bir strateji 6. sağlar. Burada bir RNAi besleme sunmakyöntem vücut büyüklüğü fenotipi puan. C. Gövde boyutu elegans öncelikle TGF-β düzenlenir - gibi bir ligand DBL-1, böylece bu tahlil TGF-β sinyal bileşenleri 7 belirlenmesi için uygundur. Biz RNAi beslenme deneyleri tekrarlamak için iki RNAi duyarlı suşlar dahil farklı suşları kullanılmıştır. Bizim sonuçlarımız rrf-3 suşu bize en iyi beklenen RNAi fenotip verdiğini gösterdi. Yöntem, uygulanması kolay bir tekrarlanabilir ve kolayca ölçülür. Ayrıca, protokol özel ekipman kullanımını en aza indirir, bu nedenle daha küçük laboratuar ya da ağırlıklı olarak lisans kurumları da uygundur.
Protocol
1. Hedef Gen Dizi Defter RNAi Besleme Tabaklar hazırlanması
- Piyasada bulunan RNAi kütüphanelerin (örn. Kaynak BioScience Doğal Bilimler itibaren) kullanıyorsanız, 1.4 adıma geçin. Alternatif olarak, standart klonlama protokolü tarafından, vektör L4440, 8 RNAi plazmid yaygın olarak kullanılan bir solucan içine hedef gen dizileri klonu.
- Bakterinin HT115 (DE3), 25 mcg / ml karbenisilin ile LB agar plaklarına kültürü onları ve 12.5 mcg / ml tetrasiklin içine rekombinant plazmid Transform, ve gelecekte kullanılmak üzere tek bir klon almak.
- Bununla birlikte, deneyler için bir kontrol olarak kullanmak için bakteri suşu HT115 içine boş vektör L4440 dönüşümü.
- 37 gece boyunca 100 ug / ml ampisilin ile 1 ml LB et suyu ° C. Kültür rekombinant ve boş hem de L4440 taşıyan bakteriler Tetrasiklin o RNAi randıman düşer olmasından dolayı eklenir.
- Gecede cultu içine 100 mg / ml ampisilin ile başka bir 5 ml LB suyu ekleyinre, 37 başka bir 4-6 saat süreyle inkübe ° C
- Tohum 0.5 ml rekombinant veya boş L4440 taşıyan RNAi solucanı plakalar üzerine bakteri kültürü. Klon adı ile tüm plakaları etiketleyin.
- Plakaları işaretleyin ve 37 gece inkübe ° C bakteriyel çim büyümeye; Bu hedef gen sekansı olan veya olmayan RNAi levhalar vardır. En az 2 tabak, her durum için hazırlıklı olmalıdır.
2. RNAi Besleme Tabaklar Kültür Worms
- Alev bir platin tel solucan pick ucu sterilize. 6-10 dördüncü dönem larvaları (L4) ya rekombinant veya boş L4440 içeren her RNAi plakasına Hermafroditler almak almak solucan kullanın; hayvanların besin kaynağı olarak bakterileri kullanır.
- Çift cinsiyetli 20 ° C (C. elegans için standart bir kültür koşulu) gecede büyümek edelim, onlar ertesi gün genç yetişkinler olacak.
- Yeni buna etiketli ve hazırlanan RNAi plaka içine 6-10 genç yetişkinler aktarın.
- Letyetişkinlerin 4-6 saat için yumurtalarını bıraktıkları, ardından plakası tüm yetişkinlerin kaldırmak; bu adımı döl senkronize etmektir. Anneler yok olduktan sonra, zaman saymaya başlar. Bu sefer sıfırdır.
- 20 plakalar inkübe ° C hayvanların belirli bir gelişim evresine büyümesine izin vermek, bu protokolde, biz fenotipik analiz için genç yetişkinler seçin. Normal bir hızda gelişir hakemin için 72 saat inkübasyon genç yetişkinler haline hayvanlar için yeterlidir. Ancak, çeşitli genlerin farklı hayvan gelişimini etkileyebilir. RNAi farklı bir hızda büyümeye hayvanlar neden olursa, genç erişkinlerde rahim içinde tamamlanmış vulval geliştirme ve 2-6 embriyolar (fertil varsa) L4 geçmiş olanlar en fazla 24 saat olarak tespit edilebilir. Diğer gelişimsel aşamaları belirlemek için, araştırmacı bir rehber olarak gonadal ve vulval gelişimi kullanmalısınız.
3. RNAi Puan Vücut büyüklüğü Fenotiplerinin Worms Tedavi
- Bir cam slayt üzerine renkli etiket şeritleri iki kat yerleştirin. Of Make ikise cam slaytlar. Sonra, bant ile iki slayt arasına yeni bir cam slayt yerleştirin. Su içinde% 2 agaroz Melt yeni bir cam slayt merkezine bir damla uygulanır; sonra agaroz önceden 9 açıklanan% 2 ince bir katman yapmak için üstüne ikinci bir cam slayt basın.
- Agaroz katılaşmış sonra, üst cam slayt kaldırmak; agaroz pad ile slayt solucanlar yüklemek için hazır. Klon adla Etiket slayt.
- Agaroz pad 10 ul 25 mM NaN 3 ekleyin; onları hareketsiz NaN 3 solüsyon içine 30-40 hayvanları almak, sonra üstüne lamel koymak; rekombinant ve boş hem RNAi tedavi edilen hayvanlar L4440-taşıma için tekrar.
- Görüntü 2.5x objektif lens kullanarak diseksiyon mikroskobu altında solucanlar; burada yazılım Qcapture destekleyen Leica dijital kamera kullanın.
- Kalibrasyonu için, önce standart bir mikrometre cetvel bir görüntü yakalayabilirsiniz. Sonra Image-Pro yazılımı görüntüyü açmak seçin ve "ölçü" üzerine tıklayın ve "kalibrasyon" i seçin"Mekansal kalibrasyon sihirbazı". Seçilen "aktif görüntüyü kalibre" ile "gelecek" üzerine tıklayın. Girdi kalibrasyon için isim ve mekansal referans birimleri mikrometre ayarlandığından emin olun. Sonra, "oluşturmak için bir referans kalibrasyon" düğmesini işaretleyin ve "next" butonuna tıklayınız. Tıklayın "beraberlik referans çizgisi." Bir referans ölçek çubuğu görünecektir. Mikrometre ucuna uygun ölçek çubuğu yeniden konumlandırma, daha sonra 1000 adet referans gösterdiğini göstermektedir. , "Tamam", "Next" ve "Finish" tıklayınız.
- Yazılım kalibre edildikten sonra, bir solucan görüntüyü açmak. Sonra, "select mekansal" tıklayın sonra "kalibrasyon" seçin, "tedbir" menüsünün altında seçin. Açılan menüden ise, mikrometre kalibrasyonu için oluşturulan dosya adını seçin. Sonra, "tedbir" menüsü altında, "ölçüm" seçeneğini seçin. Açılan pencerede, serbest çizim aracını seçin ve bilgisayar faresi (Şekil 1) ile kuyruk baş hayvan vücudunun ortasından geçen bir çizgi izlemesi. Uzunluk pencere içinde rapor edilir. ŞimdiHedef gen RNAi L4440 ve boş vektör ile tedavi edilen kontrol hayvanları ile muamele edilen hayvanların vücut süresi: iki veri gruplarına sahiptir.
- Microsoft Excel dosyası veya başka uygun istatistik yazılım uzunluk ölçümleri aktarın. Her numune için ortalama ve standart sapma hesaplanarak verileri analiz. Sonra Student t-testi kullanılarak örnekleri karşılaştırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Araştırmamızda, biz DBL-1/TGF-β yolu ile vücut büyüklüğü düzenleme odaklanmak. Yabani tip hayvanlarda 7,10,11 ile karşılaştırıldığında daha kısa bir gövde uzunluk dahil olmak üzere küçük vücut boyutu DBL-1 yolunun sonuçları, fonksiyon kaybı. C. için Böylece, ekranlar elegans vücut büyüklüğü mutantlar TGF-β sinyal bileşenleri ve düzenleyici belirleme yeteneğine sahiptirler. DBL-1, sinyal hücre yüzey reseptörleri ve hücre içi sinyal dönüştürücüleri Smad 12 içeren bir korunmuş bir TGF-β sinyal transdüksiyon yolu ile aracılık etmektedir. Dbl-1/ligand; sma-2, sma-3, sma-4/Smads ve: vücut büyüklüğü mutantların tanımlanması için besleyerek RNAi etkinliğini test etmek için, DBL-1 yolağı bileşenlerini yıkmak için bu tekniği kullanılır sma-6/receptor. Çalışmamızda için, biz iki farklı RNAi duyarlı C. kullanılır elegans suşları deneyi gerçekleştirmek için: eri-1; lin-15b ve rrf-3 13,14. Bu arada, biz de (sta N2 kullanılanndard yabani tip) suşu ve lin-36, RNAi hassasiyeti N2 13 yine benzer lin-15 yolunun bir bileşen. Lin-36 arka sma-6 RNAi hariç, (p <0.001) beklendiği gibi bu suşların hepsi kısa vücut büyüklüğü fenotipini gösterdiğini ettiğimiz sonuçlar (Şekil 2) göstermektedir. Rrf-3 arka planında, RNAi tedavi sonrası genç yetişkinlerin vücut uzunlukları 84 ~ yalnız vektörün% 95 idi. Eri-1 olarak; genç yetişkinlerin lin-15b arka plan, vücut uzunlukları RNAi kontrol hayvanlarının 68 ~% 86 idi sonra. Lin-15b daha duyarlı idi; lin-36 ve N2 suşları, RNAi aşırı duyarlı suşlar rrf-3 ve eri-1 her iki ile karşılaştırıldığında.
Şekil 1. Hayvan vücut uzunluğu Temsilcisi görüntüleri ölçülen A. hayvan görüntü ölçüm önce.;
Şekil 2. Bu arka plan suşların tümünde DBL-1 yolağı bileşenlerinin RNAi beslenme yöntemi ile inaktive edildiği hayvanların vücut uzunluğu. RNAi hayvanlar lin-36 sma-6 RNAi hariç, (p <0.001) beklendiği gibi kısa gövde uzunluğu fenotipi gösterilmiştir arka plan. Rrf-3 ve eri-1 RNAi; lin-15b suşları lin-36 ve N2 arka göre daha güçlü bir fenotip gösterdi.
Şekil 3,. Şematik daday genler için ekrana RNAi beslenme stratejisi kullanarak escription.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, biz C. vücut büyüklüğü kusurlu mutantların belirlenmesi için yöntem tarif RNAi besleme ile elegans. Bu yöntem, TGF-β sinyal bileşenlerin tanımlanması için de geçerlidir. Gibi bileşenler yüksek evrim 15 yoluyla korunmuş olduğundan, bu ekranlar, tüm Metazoan'da TGF-β sinyal moleküler mekanizmalarının aydınlatılmasına alakalı. Böyle bir ekran tasarımında önemli bir göz başlayarak suşudur. Lin-15b ve rrf-3 önceki çalışmalar 12,13 ile tutarlı kontrolünde zorlanmalar, daha RNAi beslenme karşı daha duyarlıdır; Biz de eri-1 olduğunu göstermiştir. Eri-l olsa Ancak; lin-15b güçlü fenotip gösterdiği, hayvanlara iyi büyür ve birkaç nesil üretmedi vermedi. Böylece, büyük ölçekli ekran, bu gerginlik fenotipleri puanlama için yeterli hayvanların olmazdı. Bunun sonucu olarak, rrf-3 suşu uygulamak için tercihVücut büyüklüğü düzenlemeye RNAi besleme tekniği. Başlangıç gerilme göz önünde bulundurulması gereken bir ikinci tercih bozulmamış DBL-1 yolu ile bir ekran başlatmak için ya da DBL-1 yol ya tehlikeye aşırı aktif olduğu bir hassas suşu ile başlamak için olup olmadığıdır. Bu alternatif başlangıç noktaları örtüşen belirlenmesi ama sinyal bileşenlerinin farklı set yol açması muhtemeldir. Bizim protokol aynı zamanda diğer postembryonic fenotiplerinin çalışmaya değiştirilebilir. Bu durumda, ilgi fenotip için atılır için hayvanların aşama adımda 2.5 büyüme süresi değiştirilerek modifiye edilmesi gerekebilir. Önce diğer fenotiplerin için büyük ölçekli ekran başlatmadan, biz dbl-1, sma-2, sma-3 SMA-4 ve sma-burada açıklamak gibi ilgi fenotipi üretmek için bilinen gen ile bir pilot ekran tavsiye ederim 6.
, Bu protokolü kullanarak DBL-1 yolağı bileşenlerinin aşağı vurma tarafından beklenen vücut uzunluğu fenotipi gösterdi. Thortum RNAi hayvanlar kontrol hayvanları ile karşılaştırıldığında, uzunluk olarak yaklaşık% 68-95 idi. Daha önceki çalışmalarda, yetişkinlikte işlevi genetik mutantlar DBL-1 yolağı kaybı vahşi tip hayvanlara 7,10,11 yaklaşık% 50 daha kısadır. Bu nedenle, burada sunulan RNAi besleme tekniği tam gen aktivitesinin ortadan vermedi. Bu yüzden, yöntem, bir zayıf fenotipe sahip yolu bileşenlerini belirlemek için yeteneği sınırlıdır olabilir. Vücut uzunluğu düzenleyen birçok gen var çünkü arada, ekranda belirlenen genler de mutlaka DBL-1 yolağı düşmek olmayabilir. Başka bir ekran yöntemi için doğru olduğunu daha sonra yaptıkları deneyler, yollardaki adayları yerleştirmek için yapılmalıdır.
C. Sonuç olarak, RNAi besleme ekranlar elegans ilgi sürecine dahil genlerin belirlenmesinde yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Bu protokol, biz vücut büyüklüğü kusurların tespiti son derece etkili olduğu mevcut protokoller optimize ettik. Optimize protokolü daha olabilirDiğer postembryonic fenotiplerinin çalışma için değiştirilmiş.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz çeşitli gelişimsel zaman noktalarında hayvan figürleri sağlamak için James Clark ederim. C. Bu çalışmada elegans suşları Araştırma Kaynakları için NIH Ulusal Merkezi (NCRR) tarafından desteklenen Caenorhabditis Genetik Merkezi, elde edilmiştir. Bu çalışma CUNY gelen JL ve CSD CIRG 1817 tarafından desteklenen ve NIH 1R15GM073678-01 ve CSD 1R15GM097692-01 tarafından Biz yazması üzerine yorumlar için Dr William J Rice, Dr Nathalia Holtzman ve Melissa Silvestrini ederim. Bu çalışmaları, New York Şehir Üniversitesi (S. Xiong) ve Graduate Center'da bir doktora derecesi için gereksinimleri kısmen yerine getirilmesi yürütülmüştür.
Materials
| RNAi worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Add 3 ml 1M IPTG(sterile) and 3 ml 25 mg/ml Carbenicillin(sterile); then pour into 60 mm Petri dishes. Worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 0.6 g Streptomycin Sulfate 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Pour into 60 mm Petri dishes. Worm Medium Mix 55 g Tris-Cl 24 g Tris-OH 310 g Bacto Peptone 800 mg Cholesterol 200 g NaCl Mix thoroughly and be sure to avoid chunks; this powdered mixture can be stored for many months prior to use. 2% agarose 0.5 g Agarose Add 25 ml dH2O. Heat in microwave until dissolved. 1M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 2 g IPTG Dissolve in10 ml dH2O 1M NaN3 6.5 g NaN3 Add dH2O to 100 ml 25 mM NaN3 2.5 ml 1M NaN3 Add dH2O to 100 ml Caenorhabditis elegans from Caenorhabditis Genetics Center L4440 plasmid (carries ampicillin-resistance gene) Bacteria strain HT115 (DE3) (contains IPTG inducible T7 polymerase; deficient for RNAse III gene (a dsRNAse) which also carries tetracycline-resistance gene)16 60 mm Petri dishes 100 mm Petri dishes 14 ml round-bottom Falcon culture tubes glass slides glass coverslips 1-20 μl pipettor 20-200 μl pipettor 200-1000 μl pipettor 1-200 μl pipet tips 200-1000 μl pipet tips 1.5 ml Eppendorf tubes platinum wire worm pick |
References
- Melnyk, C. W., Molnar, A., Baulcombe, D. C. Intercellular and systemic movement of RNA silencing signals. Embo J. 30, 3553-3563 (2011).
- Wall, N. R., Shi, Y. Small RNA: can RNA interference be exploited for therapy. Lancet. 362, 1401-1403 (2003).
- Kalantidis, K., Schumacher, H. T., Alexiadis, T., Helm, J. M. RNA silencing movement in plants. Biol. Cell. 100, 13-26 (2008).
- Shim, M. S., Kwon, Y. J. Efficient and targeted delivery of siRNA in vivo. Febs. J. 277, 4814-4827 (2010).
- Amarzguioui, M., Rossi, J. J., Kim, D. Approaches for chemically synthesized siRNA and vector-mediated RNAi. FEBS Lett. 579, 5974-5981 (2005).
- Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30, 313-321 (2003).
- Savage-Dunn, C., et al. Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFb pathway components. Genesis. 35, 239-247 (2003).
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
- Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).
- Wang, J., Tokarz, R., Savage-Dunn, C. The expression of TGFβ signal transducers in the hypodermis regulates body size in C. elegans. Development. 129, 4989-4998 (2002).
- Liang, J., et al. The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling. Development. 130, 6453-6464 (2003).
- Savage-Dunn, C. TGF-β signaling. WormBook. , 1-12 (2005).
- Simmer, F., et al. Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).
- Wang, D., et al. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436, 593-597 (2005).
- De Robertis, E. M. Evo-devo: variations on ancestral themes. Cell. 132, 185-195 (2008).
- Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263, 103-112 (2001).
