Summary
我々は、標的遺伝子とスコアボディサイズの表現型をノックダウンするのRNAi送り技法を使用する方法を示し
Abstract
二本鎖RNA媒介干渉（RNAi）は1月3日 、標的遺伝子の発現をノックダウンする効果的な戦略である。それは植物、無脊椎動物と脊椎動物を含む多くのモデルシステムに適用されています。 生体 4,5 でRNAiを達成するためのさまざまな方法があります。一過性かもしれない代わりに特定の標的遺伝子（RNAiのオリゴ）から二本鎖オリゴヌクレオチドを合成し、例えば、標的遺伝子がRNAiのベクトルに変換することができ、その後永久に、または一過性に遺伝子ノックダウンの効果を達成するために、細胞株や初代培養細胞に形質転換標的遺伝子を沈黙させる細胞株や初代培養細胞に形質転換し、または合成された二本鎖RNA分子が生体に微量注入することができる。線虫C.以来虫、細菌が標的遺伝子に対する二本鎖RNAを発現する動物の餌、食料源として細菌を使用して実行可能な戦略6を提供しています。ここではRNAiの給餌を提示体の大きさの表現型を獲得するための方法。 Cのボディサイズ虫は主に 、TGF-βによって調節されている-のような配位子DBL-1ので、このアッセイは、TGF-βシグナル伝達成分7の識別に適しています。私たちは、RNAi給餌実験を再現する2 RNAiの過敏株を含む様々な菌株を使用していました。我々の結果は、RRF-3株は私たちに最高の期待されるのRNAi表現型を与えることを示した。方法は、実施が容易で再現性があり、容易に定量化される。さらに、我々のプロトコルでは、特殊な装置の使用を最小限に抑えているので、小さな実験室や主に学部機関の人に適しています。
Protocol
1。標的遺伝子配列を運ぶのRNAi給餌プレートの準備
- 市販のRNAiライブラリー（ 例えば、ソースバイオサイエンスライフサイエンスから）使用している場合は、1.4に進みます。代わりに、標準的なクローニングプロトコルによって、ベクトルL4440、8 RNAiのプラスミド、一般的に使用されるワームに標的遺伝子配列のクローンを作成します。
- 細菌株HT115（DE3）を、25μg/ mlのカルベニシリンおよび12.5μg/ mlのテトラサイクリンを含むLB寒天プレート上で培養して組換えプラスミドに変換し、将来の使用のために単一クローンをピックします。
- 一方、実験の対照として使用する細菌株HT115に空のベクターL4440を変換します。
- 37℃で一晩100μg/ mlのアンピシリンを含む1ミリリットルLBブロス℃の文化換えと空の両方L4440-運ぶ細菌テトラサイクリンは、それがRNAiの効率を低下させるという事実のために追加されません。
- 一晩cultuに100μg/ mlのアンピシリンを持つ別の5mlのLBブロスを追加37で別の4から6時間インキュベート再、℃
- RNAiのワームプレートにシード0.5ミリリットル換えまたは空L4440-運ぶ細菌培養。クローン名を持つすべてのプレートにラベルを付けます。
- プレートをマークし、37℃で一晩インキュベート℃の細菌の芝生を育てるために、これらは標的遺伝子配列の有無を問わずRNAiの板である。少なくとも2つのプレートはそれぞれの条件のために準備されるべきです。
2。 RNAiの給餌プレート上の培養ワーム
- 炎が白金線ワームピックの先端を消毒。 6月10日4令幼虫（L4）は、組換えまたは空L4440を含む各RNAiのプレートに雌雄同体迎えに選ぶワームを使用します。動物は食物源として細菌を使用します。
- 雌雄同体が20℃（C. elegansのための標準的な培養条件）で一晩成長させ、彼らは翌日、若年成人になるでしょう。
- 新たに対応して標識し、準備したRNAiプレートに6月10日、若年成人を転送します。
- てみましょう大人は4-6時間、卵を産み、その後板からすべての大人を削除し、このステップでは、子孫を同期させることです。母親が削除されたら、時間をカウントし始める。これは時間がゼロになります。
- 20でプレートをインキュベート℃の動物は特定の発達段階に成長するようにするためには、このプロトコルでは、我々は表現型分析のための若年成人を選択します。通常の速度で開発ノックダウンのために、72時間のインキュベーションは、若年成人になるための動物のために十分である。しかし、様々な遺伝子が異なる動物の発達に影響を与える。 RNAiは、異なる速度で成長すると動物が発生した場合は、若年成人が完了外陰部の開発と子宮の2-6胚（肥沃な場合）とL4は過去24時間以外のものは、それ以下に識別することができます。他の発達段階を識別するために、治験責任医師は、ガイドとして性腺と外陰部の開発を使用する必要があります。
3。 RNAiに処理されたワームのスコアボディサイズ表現型
- スライドガラス上に色のついたラベルテープの2つのレイヤーを配置します。のメイク2seのガラススライド。次に、テープを持つ2つのスライドの間に新しいスライドガラスを配置します。水中2％アガロースを溶かし、新しいスライドガラスの中央に一滴を適用し、次にアガロースは前述の9記載されている2％の薄い層を作るために上に第2のスライドガラスを押してください。
- アガロースが固化した後、上部スライドガラスを取り外すこと。アガロースパッド付きのスライドは、ワームをロードする準備ができています。クローン名とラベルのスライド。
- アガロースパッドに10μlの25mMのNaN 3を追加して、それを固定するために、NaN 3溶液中に30から40の動物を選択してから、上にカバースリップを入れて、組換えと空の両方がRNAi処理した動物をL4440-運ぶための繰り返し。
- 画像2.5倍の対物レンズを用いて解剖顕微鏡下ワーム、ここで我々は、ソフトウェアQcaptureをサポートするとライカのデジタルカメラを使用しています。
- キャリブレーションでは、最初の標準マイクロメートル定規のイメージをキャプチャします。 [イメージ-Proソフトウェアで画像を開いて、選択して "測定"をクリックし、 "キャリブレーション"を選択してください"空間キャリブレーションウィザード"。 "アクティブな画像をキャリブレーション"を選択した状態で、 "次へ"をクリックします。入力キャリブレーションの名前と空間参照の単位がメートルに設定されていることを確認してください。そして、 "作成基準校正"ボタンをチェックし、 "次へ"をクリックします。をクリックして "描画基準線。"基準スケールバーが表示されます。マイクロメータの両端に一致するスケールバーの位置を変更し、参照が千単位を示すことを示している。 "OK"ボタン、 "次へ"をクリックし、 "完了"。
- ソフトウェアが校正されると、ワームの画像を開きます。次に、 "測定"メニューの下に選択して、 "空間を選択"をクリックし、 "キャリブレーション"を選択します。プルダウンメニューでは、マイクロメータ校正用に作成したファイル名を選択します。次に、 "測定"メニューの下に、 "測定"を選択してください。開いたウィンドウで、自由に描画ツールを選択し、コンピュータのマウス（ 図1）と尾部に頭から動物の体の中心を通る線をたどる。長さがウィンドウに報告されます。今標的遺伝子のRNAiと空L4440ベクトルで処置した対照動物と投与動物の体の長さ：あなたはデータの2つのグループがあります。
- Microsoft Excelファイル、または他の適切な統計ソフトに長さの測定値をエクスポートします。各サンプルの平均値と標準偏差を計算することにより、データを分析します。その後、スチューデントのt検定を用いてサンプルを比較します。
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Representative Results
私たちの研究では、DBL-1/TGF-β経路による体の大きさの規制に重点を置いています。野生型動物7,10,11に比べ短いボディの長さも含めて、小さなボディサイズでDBL-1経路の結果、の機能の喪失。したがって、Cの画面虫の体の大きさの変異体は、TGF-βシグナル伝達成分と修飾子を識別することが可能である。 DBL-1シグナルが細胞表面の受容体と細胞内のSmadシグナルトランスデューサ12を含む保存されたTGF-βのシグナル伝達経路によって媒介される。 dbl-1/ligand; SMA-2、SMA-3、sma-4/Smads;と：ボディサイズ変異体の同定のために供給することにより、RNAiの有効性をテストするために、我々は、DBL-1経路成分を倒すためにこの手法を使用sma-6/receptor。我々の研究では、2つの異なるRNAi過敏Cを使用実験を行うためのエレガンス株：ERI-1; LIN-15bとRRF-3 13,14。一方、我々はまた、N2（STAを使用ndard野生型）株およびLIN-36は、RNAi感度N2 13〜それにもかかわらず類似しているLIN-15経路内のコンポーネント。予想通りLIN-36バックグラウンドでのRNAi SMA-6を除いて、これらの株のすべては、（p <0.001）とショートボディサイズの表現型を示したことを我々の結果（ 図2）を示している。 RRF-3の背景では、RNAi治療後の若年成人の体の長さは84〜ベクターのみ の95％であった。 ERI-1では、若年成人のLIN-15Bの背景、ボディの長さRNAiは対照動物の68〜86％になった後。 LIN-36とN2株と比較して、RNAi過敏株RRF-3およびERI-1の両方; LIN-15bはもっと敏感であった。
図1。測定されている動物の体の長さの代表的な画像測定前にAの動物のイメージ。
図2。 DBL-1経路のコンポーネントがRNAiの給紙方法によって不活化されていますこれらのバックグラウンド株の全てにおけるRNAi動物はLIN-36のSMA-6 RNAiを除いて、（p <0.001）が予想通りショートボディの長さの表現型を示した動物の体長背景。 RRF-3およびERI-1のRNAi、LIN-15B株はlin-36及びN2背景のそれよりも強い表現型を示した。
図3。回路図D候補遺伝子をスクリーニングするためのRNAi給餌戦略を使用してのescription。
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Discussion
このプロトコルでは、Cのボディサイズ欠損変異株の同定のための私達の方法を記述RNAiの給餌によってエレガンス 。この方法では、TGF-βシグナル伝達コンポーネントの識別にも適用可能である。このような成分が高度に進化15を介して保存されているので、このような画面は、すべての後生動物ではTGF-βシグナル伝達の分子機構の解明に関連しています。このような画面を設計する際の重要な考慮事項は、出発菌株です。 LIN-15bとRRF-3以前の研究12,13と一致しているコントロール株よりもRNAiの摂食に対してより敏感である、我々は、両方がeri-1があることを実証した。 ERI-リットルにもかかわらずしかし、LIN-15bは最強の表現型を示したが、動物はよく成長し、いくつかの子孫を生産していませんでした。したがって、大規模な画面では、我々はこの株から表現型を記録する十分な動物を持っていないでしょう。結果として、我々はRRF-3株を適用するに賛成RNAiは、体の大きさの規制に技術を供給する。出発菌株では、考慮すべき2番目の選択肢は無傷DBL-1経路で画面を開始するか、DBL-1経路のどちらか妥協したり過活動されている感作された菌株を開始するかどうかである。これらの代替の出発点は、重複の識別が、シグナリングコンポーネントの異なるセットにつながる可能性があります。我々のプロトコルは、他の後胚の表現型の研究に変更することができます。この場合、目的の表現型の得点が記録される動物のステージは、ステップ2.5における成長の持続時間を変更することによって変更する必要があります。前に他の表現型の大規模な画面を開始するために私たちがDBL-1、SMA-2、SMA-3 SMA-4、およびのためにここで説明するように、私たちはそのような目的の表現型を生成することが知られている遺伝子でパイロット画面を推薦するSMA- 6。
DBL-1経路成分をノックダウンすると、このプロトコルを使用することによって期待されるボディの長さの表現型を示した。 TホースRNAiの動物は、対照動物と比較して、長さが68から95％程度であった。以前の研究では、成人期における機能遺伝子変異のDBL-1経路損失は、野生型動物7,10,11より約50％短くなります。したがって、ここに提示されたRNAiの給電技術は完全に遺伝子活性を排除しなかった。したがって、この方法は、弱い表現型を有する経路成分を識別する能力が制限される可能性があります。ボディーの長さを調節する多くの遺伝子が存在するので、その間、画面から同定された遺伝子は、必ずしもDBL-1経路に落ちないかもしれません。さらなる実験は、他のスクリーン方式にあてはまることですが、経路に候補者を配置するために実行されるべきです。
Cで要約すると、RNAiを送り画面elegansは 、対象プロセスに関与する遺伝子を同定するのに有用であることが証明されています。このプロトコルでは、体の大きさの欠陥の同定に非常に有効であることが既存のプロトコルを最適化しました。最適化されたプロトコルは、さらにすることができます他の後胚の表現型の研究のために修正された。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
我々は、様々な発達の時点で動物の姿を提供するためJames Clark氏に感謝します。C.本研究ではエレガンス株は研究資源のためのNIHナショナルセンター（NCRR）によってサポートされ線虫遺伝学センターから入手した。この作品は、ニューヨーク市立大学からJLとCSDにCIRG 1817でサポートされていた、とNIH 1R15GM073678-01およびCSDへ1R15GM097692-01で我々は、原稿上のコメントのための博士ウィリアム·J·ライス博士ナタリアホルツマン、とメリッサSilvestriniに感謝します。この作品は、ニューヨーク市立大学（S.熊）の大学院センターから博士号のための要件の部分的な達成で行った。
Materials
| RNAi worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Add 3 ml 1M IPTG(sterile) and 3 ml 25 mg/ml Carbenicillin(sterile); then pour into 60 mm Petri dishes. Worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 0.6 g Streptomycin Sulfate 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Pour into 60 mm Petri dishes. Worm Medium Mix 55 g Tris-Cl 24 g Tris-OH 310 g Bacto Peptone 800 mg Cholesterol 200 g NaCl Mix thoroughly and be sure to avoid chunks; this powdered mixture can be stored for many months prior to use. 2% agarose 0.5 g Agarose Add 25 ml dH2O. Heat in microwave until dissolved. 1M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 2 g IPTG Dissolve in10 ml dH2O 1M NaN3 6.5 g NaN3 Add dH2O to 100 ml 25 mM NaN3 2.5 ml 1M NaN3 Add dH2O to 100 ml Caenorhabditis elegans from Caenorhabditis Genetics Center L4440 plasmid (carries ampicillin-resistance gene) Bacteria strain HT115 (DE3) (contains IPTG inducible T7 polymerase; deficient for RNAse III gene (a dsRNAse) which also carries tetracycline-resistance gene)16 60 mm Petri dishes 100 mm Petri dishes 14 ml round-bottom Falcon culture tubes glass slides glass coverslips 1-20 μl pipettor 20-200 μl pipettor 200-1000 μl pipettor 1-200 μl pipet tips 200-1000 μl pipet tips 1.5 ml Eppendorf tubes platinum wire worm pick |
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