Summary
Nós demonstramos como usar a técnica de alimentação RNAi para derrubar genes-alvo e pontuação fenótipo tamanho do corpo
Abstract
Double-strand RNA de interferência mediada (RNAi) é uma estratégia eficaz para derrubar alvo de expressão gênica 1-3. Ele foi aplicado a muitos sistemas de modelos, incluindo plantas, invertebrados e vertebrados. Existem vários métodos para atingir RNAi in vivo 4,5. Por exemplo, o gene alvo pode ser transformado em um vetor de RNAi, e, em seguida, de forma permanente ou transitória transformado em linhas celulares ou células primárias para alcançar efeitos knockdown do gene, alternativamente sintetizados oligonucleótidos de cadeia dupla a partir de genes alvo específicos (RNAi oligos) pode ser transitoriamente transformadas em linhas celulares ou células primárias de silenciar genes alvo, ou sintetizados moléculas de ARN de cadeia dupla pode ser microinjectado num organismo. Uma vez que o nemátodo C. elegans usa bactérias como fonte de alimento, a alimentação dos animais com bactérias expressando RNA de cadeia dupla contra genes alvo proporciona uma estratégia viável 6. Aqui apresentamos uma alimentação RNAimétodo para marcar fenótipo tamanho do corpo. Tamanho do corpo em C. elegans é regulado principalmente pelo TGF-β - ligante como DBL-1, de modo que este ensaio é adequado para a identificação de TGF-β componentes de sinalização 7. Usamos diferentes cepas incluindo duas linhagens de RNAi hipersensíveis repetir os experimentos de alimentação de RNAi. Nossos resultados mostraram que RRF-3 tensão nos deu o melhor fenótipo RNAi esperado. O método é de fácil execução, reprodutível e facilmente quantificada. Além disso, o nosso protocolo minimiza o uso de equipamento especializado, pelo que é adequado para laboratórios menores ou aqueles em instituições predominantemente de graduação.
Protocol
1. Preparando Placas de alimentação RNAi de transporte sequência do gene alvo
- Se o uso de bibliotecas disponíveis comercialmente RNAi (por exemplo, de LifeSciences Fonte BioScience), vá para o passo 1.4. Alternativamente, clonar seqüências de genes-alvo em vetor L4440, um worm comumente usado RNAi plasmídeo 8, por meio de protocolo de clonagem padrão.
- Transformar o plasmídeo recombinante na estirpe bacteriana HT115 (DE3), a cultura deles em placas de agar LB com 25 ug / ml de carbenicilina e 12,5 ug / ml de tetraciclina, e escolher um único clone para uso futuro.
- Enquanto isso, transforma o vector vazio L4440 na estirpe bacteriana HT115 para usar como um controlo para as experiências.
- Cultura tanto recombinantes e vazio L4440-transportam bactérias em 1 ml de caldo LB com 100 ug / ml de ampicilina durante a noite a 37 ° C. Tetraciclina não é adicionado devido ao fato de que ela diminui a eficiência RNAi.
- Adicionar mais 5 ml de caldo LB com 100 ug / ml de ampicilina durante a noite para a culture, incubar por mais 4-6 horas a 37 ° C.
- Semente de 0,5 ml recombinante ou vazio L4440 de transporte de cultura bacteriana sobre as placas sem-fim de RNAi. Rotular todas as placas com o nome de clone.
- Marcar as placas e incubar durante a noite a 37 ° C para crescer camada bacteriana, que são as placas de RNAi com ou sem sequência do gene alvo. Pelo menos duas chapas devem estar preparados para cada condição.
2. Worms cultura nas placas de alimentação RNAi
- Chama esterilizar a ponta de uma pick verme platina fio. Usar o verme escolher para escolher 6-10 quarta fase larval (L4) para cada placa hermafroditas RNAi que contém L4440 ou recombinante ou vazio, os animais irão utilizar as bactérias como uma fonte de alimento.
- Deixe hermafroditas crescer a 20 ° C (uma condição de cultura padrão para C. elegans) durante a noite, se tornarão adultos jovens no dia seguinte.
- Transferir 6-10 jovens adultos em uma nova placa de RNAi correspondentemente rotulados e preparados.
- Deixe oadultos põem ovos de 4-6 horas, em seguida, remover todos os adultos da placa; este passo é sincronizar a progênie. Uma vez que as mães são removidos, começar a contar o tempo. Este é o tempo zero.
- Incubar as placas a 20 ° C para permitir que animais crescem ao estágio de desenvolvimento específico, neste protocolo, escolhemos jovens adultos para análise fenotípica. Para knockdowns que se desenvolvem a uma taxa normal, 72 h de incubação é suficiente para que os animais se tornem adultos jovens. No entanto, vários genes afectam o desenvolvimento dos animais de forma diferente. Se RNAi faz com que animais a crescer a um ritmo diferente, os jovens adultos pode ser identificada como aqueles hr não mais do que 24 passado completou L4 com desenvolvimento vulvar e 2-6 embriões no útero (se fértil). Para identificar outros estágios de desenvolvimento, o pesquisador deve usar o desenvolvimento gonadal e vulvar como um guia.
3. Fenótipos pontuação de tamanhos de RNAi Tratada Worms
- Colocar duas camadas de fitas coloridas etiqueta sobre uma lâmina de vidro. Fazer dois doslâminas de vidro se. Em seguida, colocar uma placa de vidro novo entre as duas lâminas com fita. Melt agarose a 2% em água; aplicar uma gota para o centro da lâmina de vidro novo, em seguida, pressionar a lâmina de vidro segundo no topo para fazer uma fina camada de agarose a 2%, tal como descrito anteriormente 9.
- Uma vez agarose é solidificado, retire a lâmina de vidro superior, o slide com agarose almofada está pronto para carregar vermes. Slides etiqueta com o nome do clone.
- Adicionar 10 ul de 25 mM de NaN3 para a almofada de agarose; escolher animais 30-40 no 3 NaN solução para imobilizá-los, em seguida, colocar a lamela na parte superior; repetição para ambos recombinante e vazio L4440 de transporte de animais tratados com RNAi.
- Imagem os vermes sob estereomicroscópio usando lente objetiva de 2,5 x; aqui usamos Leica câmera digital com suporte Qcapture software.
- Para a calibração, em primeiro capturar uma imagem de uma régua micrométrica standard. Em seguida, abra a imagem no Image-Pro Software, clique em "medida" e escolha "calibração" e escolha"Assistente de calibração espacial". Com a "calibrar a imagem ativa" selecionada, clique em "Avançar". Introduza o nome para a calibração e garantir que as unidades de referência espaciais estão definidas para micrômetro. Em seguida, marque a opção "criar uma referência de calibração" e clique em "Avançar". Clique em "linha de referência empate." Uma barra de escala de referência aparecerá. Mude a posição da barra de escala para combinar com as extremidades do micrômetro, em seguida, indicar que a referência indica 1.000 unidades. Clique em "OK", "Next" e "Finish".
- Quando o software estiver calibrado, abrir uma imagem de worm. Em seguida, selecione sob a "medida" menu, selecione "calibração" e clique em "select espacial". No menu suspenso, selecione o nome do arquivo criado para a calibração do micrômetro. Então, sob a "medida" menu, selecione "medições". Na janela que se abre, selecione a ferramenta livre desenhar e traçar uma linha através do centro do corpo do animal, da cabeça à cauda com rato do computador (Figura 1). O comprimento será relatado na janela. Agoravocê tem dois grupos de dados: comprimento do corpo dos animais tratados com RNAi gene alvo e os animais controle tratados com vetor L4440 vazio.
- Exportar as medidas de comprimento em um arquivo do Microsoft Excel, ou outro software adequado estatística. Analisar os dados através do cálculo da média e desvio padrão para cada amostra. Em seguida, compare amostras utilizando teste t de Student.
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Representative Results
Em nossa pesquisa, focamos na regulação do tamanho corporal pela via DBL-1/TGF-β. A perda da função dos resultados DBL-1 via de tamanho pequeno corpo, incluindo um menor comprimento de corpo comparado com animais de tipo selvagem 7,10,11. Assim, telas para C. mutantes tamanho elegans do corpo são capazes de identificar os componentes de sinalização de TGF-β e modificadores. DBL-1 sinalização é mediada por uma via de transdução conservada TGF-β sinal que inclui os receptores da superfície celular e intracelulares transdutores de sinais Smad 12. Para testar a eficácia do RNAi, alimentando para a identificação de mutantes de tamanho corporal, que utilizou esta técnica para derrubar componentes DBL-um caminho: dbl-1/ligand; sma-2, SMA-3, sma-4/Smads e sma-6/receptor. Para o nosso estudo, foram utilizados dois diferentes RNAi hipersensibilidade C. elegans cepas a realização do experimento: eri-1; lin-15b e RRF-3 13,14. Enquanto isso, nós também utilizado N2 (standard tipo selvagem) estirpe e lin-36, um componente na via da lin-15 cuja sensibilidade é, no entanto, RNAi semelhante a N2 13. Os resultados (Figura 2) mostra que todas estas estirpes mostraram o fenotipo tamanho pequeno corpo como esperado (p <0,001), excepto sma-6 RNAi em lin-36 de fundo. Em RRF-3 fundo, comprimentos de adultos jovens após o tratamento RNAi foram de 84 ~ 95% do vetor sozinho. Em eri-1; lin-15b fundo comprimentos, do corpo de adultos jovens após RNAi eram 68 ~ 86% dos animais do grupo controle. Comparado com lin-36 e N2, ambas as estirpes de hipersensibilidade a RNAi estirpes RRF-3 e eri-1; lin-15b foram mais sensíveis.
Figura 1. Imagens representativas de comprimento do corpo do animal que está sendo medido A. imagem animal antes da medição.;
Figura 2. Animais de comprimento do corpo de animais em que os componentes da via DBL-1 foram inactivados por RNAi método de alimentação. RNAi em todas estas estirpes de fundo exibida fenótipo curto comprimento do corpo, como esperado (p <0,001), excepto sma-6 RNAi em lin-36 fundo. RNAi de RRF-3 e eri-1; lin-15b estirpes demonstraram um forte fenótipo do que a lin-36 e fundos de N2.
Figura 3. Esquemática descrição de usar RNAi estratégia de alimentação para triagem de genes candidatos.
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Discussion
Neste protocolo, descrevemos o nosso método para a identificação de mutantes defeituosos o tamanho do corpo de C. elegans alimentação por RNAi. Este método é aplicável para a identificação dos componentes de sinalização de TGF-β. Uma vez que estes componentes são altamente conservadas através da evolução 15, tais telas são relevantes para elucidar os mecanismos moleculares de TGF-β sinalização em todos metazoários. Uma consideração importante na concepção de uma tal tela é a estirpe de partida. Nós demonstramos que tanto a eri-1; lin-15b e RRF-3 são mais sensíveis à alimentação RNAi do que as estirpes de controlo, o que é consistente com estudos anteriores 12,13. No entanto, apesar de eri-l; lin-15b demonstrou a mais forte fenótipo, os animais não crescem bem e produziram descendência poucos. Assim, num ecrã de grande escala, não teríamos animais suficientes para marcar fenótipos desta estirpe. Como resultado, nós favorecemos a RRF-3 estirpe de aplicar oRNAi técnica de alimentação à regulação tamanho do corpo. Uma segunda escolha para considerar na estirpe de partida é a possibilidade de iniciar uma tela com a via DBL-1 intacto ou para começar com uma estirpe sensível em que a via DBL-1 está comprometido ou hiperactiva. Estes pontos de partida alternativos são susceptíveis de levar à identificação de sobreposição, mas diferentes conjuntos de componentes de sinalização. Nosso protocolo pode também ser modificado para o estudo de outras fenótipos pós-embrionário. Neste caso, a fase de animais a serem marcados para o fenótipo de interesse podem necessitar de ser modificados através da alteração da duração do crescimento no passo 2.5. Antes de iniciar uma tela larga escala para outros fenótipos, recomendamos uma tela de piloto com genes conhecidos para produzir o fenótipo de interesse, como descrevemos aqui para dbl-1, SMA-2, sma sma-3-4, e-sma 6.
Ao utilizar este protocolo, derrubando componentes DBL-1 via apresentaram fenótipo esperado comprimento do corpo. Tanimais de mangueira de RNAi foram cerca de 68-95% do comprimento em comparação com os animais de controlo. Em estudos anteriores, DBL-1 via de perda de função de mutantes genéticos na idade adulta são cerca de 50% mais curto do que os animais de tipo selvagem 7,10,11. Portanto, a técnica de alimentação RNAi aqui apresentada não eliminar totalmente a atividade do gene. Assim, o método pode ser limitado na sua capacidade para identificar os componentes da via, que têm um fenótipo de fraco. Enquanto isso, uma vez que há muitos genes que regulam o comprimento do corpo, os genes identificados a partir da tela também pode não ser necessariamente cair na via-1 DBL. Outros experimentos devem ser realizados para colocar os candidatos em vias, como é verdadeiro para qualquer método de outra tela.
Em resumo, RNAi telas de alimentação em C. elegans provaram ser úteis na identificação de genes envolvidos no processo de interesse. Neste protocolo, temos aperfeiçoado protocolos existentes por ser altamente eficaz na identificação de defeitos de tamanho corporal. O protocolo pode ser optimizado adicionalmodificado para o estudo de outras fenótipos pós-embrionário.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Agradecemos James Clark para a prestação de figuras de animais em vários pontos de tempo de desenvolvimento. C. elegans estirpes neste estudo foram obtidos a partir do Centro de Genética Caenorhabditis, que é suportado pelo National Center for NIH Research Resources (NCRR). Este trabalho foi financiado pelo CIRG 1817 da CUNY a JL e CDS, e pelo NIH 1R15GM073678-01 e 1R15GM097692-01 a CSD Agradecemos ao Dr. William J Rice, Dr. Nathalia Holtzman, e Melissa Silvestrini para comentários sobre o manuscrito. Este trabalho foi realizado em cumprimento parcial das exigências para um grau de doutoramento do Centro de Pós-Graduação da Universidade da Cidade de Nova York (S. Xiong).
Materials
| RNAi worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Add 3 ml 1M IPTG(sterile) and 3 ml 25 mg/ml Carbenicillin(sterile); then pour into 60 mm Petri dishes. Worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 0.6 g Streptomycin Sulfate 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Pour into 60 mm Petri dishes. Worm Medium Mix 55 g Tris-Cl 24 g Tris-OH 310 g Bacto Peptone 800 mg Cholesterol 200 g NaCl Mix thoroughly and be sure to avoid chunks; this powdered mixture can be stored for many months prior to use. 2% agarose 0.5 g Agarose Add 25 ml dH2O. Heat in microwave until dissolved. 1M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 2 g IPTG Dissolve in10 ml dH2O 1M NaN3 6.5 g NaN3 Add dH2O to 100 ml 25 mM NaN3 2.5 ml 1M NaN3 Add dH2O to 100 ml Caenorhabditis elegans from Caenorhabditis Genetics Center L4440 plasmid (carries ampicillin-resistance gene) Bacteria strain HT115 (DE3) (contains IPTG inducible T7 polymerase; deficient for RNAse III gene (a dsRNAse) which also carries tetracycline-resistance gene)16 60 mm Petri dishes 100 mm Petri dishes 14 ml round-bottom Falcon culture tubes glass slides glass coverslips 1-20 μl pipettor 20-200 μl pipettor 200-1000 μl pipettor 1-200 μl pipet tips 200-1000 μl pipet tips 1.5 ml Eppendorf tubes platinum wire worm pick |
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