Summary
Vi viser, hvordan du bruger RNAi fodring teknik til at vælte målgener og score kropsstørrelse fænotype i
Abstract
Dobbeltstrenget RNA-medieret interferens (RNAi) er en effektiv strategi til at vælte målgenekspression 1-3. Det er blevet anvendt til mange modelsystemer, herunder planter, invertebrater og vertebrater. Der er forskellige metoder til at opnå RNAi in vivo 4,5. For eksempel kan målgenet omdannes til en RNAi vektor, og derefter enten permanent eller transient omdannes til cellelinier og primære celler til opnåelse gen knockdown virkninger, alternativt syntetiseres dobbelt-oligonukleotider fra specifikke målgener (RNAi oligoer) kan være transient omdannet til cellelinjer eller primære celler til tavshed målrette gener, eller syntetiseres dobbelt-strengede RNA-molekyler kan mikroinjiceres i en organisme. Da nematoden C. elegans bruger bakterier som en fødekilde, fodring af dyrene med bakterier udtrykker dobbelt-strenget RNA mod målgener giver en levedygtig strategi 6. Her præsenterer vi en RNAi fodringFremgangsmåde til at score kropsstørrelse fænotype. Kropsstørrelse i C. elegans reguleres primært af det TGF-β - ligesom ligand DBL-1, så dette assay er egnet til identifikation af TGF-β signalering komponenter 7. Vi brugte forskellige stammer herunder to RNAi hypersensitive stammer at gentage de RNAi fodring eksperimenter. Vores resultater viste, at RRF-3-stammen gav os den bedste forventede RNAi fænotype. Fremgangsmåden er let at udføre, reproducerbar og let kvantificeres. Desuden er vores protokol minimerer brugen af specialiseret udstyr, så det er velegnet til mindre laboratorier eller personer, overvejende bachelor institutioner.
Protocol
1. Forberedelse RNAi Fodring Plates Carrying målgensekvens
- Hvis du bruger kommercielt tilgængelige RNAi biblioteker (fx fra Source BioScience LifeSciences), skal du fortsætte til trin 1,4. Alternativt klone målgensekvenser i vektor L4440, et almindeligt anvendt orm RNAi plasmid 8, ved standardklonings-protokol.
- Omdanne det rekombinante plasmid i bakteriestamme HT115 (DE3), kultur dem på LB-agarplader med 25 ug / ml carbenicillin og 12,5 ug / ml tetracyclin, og vælge en enkelt klon til fremtidig brug.
- I mellemtiden omdanne den tomme vektor L4440 i bakteriestamme HT115 at bruge som en kontrol for eksperimenterne.
- Kultur både rekombinante og tomme L4440-bærende bakterier i 1 ml LB-bouillon med 100 ug / ml ampicillin natten over ved 37 ° C. Tetracyclin tilsættes ikke på grund af, at det nedsætter RNAi effektivitet.
- Tilføje endnu 5 ml LB-bouillon med 100 ug / ml ampicillin til overnight culture, inkuberes i yderligere 4-6 timer ved 37 ° C.
- Seed 0,5 ml rekombinant eller tomme L4440-bærende bakteriekultur på de RNAi ormen pladerne. Mærke alle plader med klon navn.
- Markere pladerne og inkuberes natten over ved 37 ° C til at vokse bakteriel plæne, som er de RNAi plader med eller uden målgensekvens. Mindst 2 plader bør udarbejdes for hver tilstand.
2. Kultur Worms på RNAi Fodring Plates
- Flame sterilisere spidsen af en platintråd orm pick. Brug ormen vælge at plukke 6-10 4:e Larvestadium (L4) hermafroditter til hver RNAi plade, der indeholder enten rekombinant eller tom L4440, dyrene vil bruge de bakterier som en fødekilde.
- Lad hermafroditter vokse ved 20 ° C (en standardkultur betingelse for C. elegans) natten over, bliver de unge voksne den næste dag.
- Overfør 6-10 unge voksne i en ny tilsvarende mærket og forberedt RNAi plade.
- Ladvoksne lægger æg i 4-6 timer, og derefter fjerne alle voksne fra pladen, dette trin er at synkronisere afkommet. Når mødre er fjernet, begynder at tælle tid. Det er tiden nul.
- Inkubér pladerne ved 20 ° C for at lade dyrene vokse til specifik udviklingsstadiet; i denne protokol, vælger vi unge voksne til fænotypisk analyse. For knockdowns der udvikler sig ved en normal sats, er 72 timers inkubering tilstrækkelig for dyr til at blive unge voksne. Imidlertid forskellige gener påvirker dyr udviklingen forskelligt. Hvis RNAi forårsager dyr at vokse med en anden sats, kan unge voksne identificeres som dem, der ikke mere end 24 timer tidligere L4 med udfyldt vulva udvikling og 2-6 embryoner i livmoderen (hvis frugtbar). At identificere andre udviklingsstadier, bør investigator bruge gonadale og vulva udvikling som en guide.
3. Score kropsstørrelse fænotyper af RNAi Behandlet Worms
- Lægges to lag farvede etikettapes på et objektglas. Gøre to afselv nogen objektglas. Derefter placere en ny glasplade i mellem de to dias med tape. Smelt 2% agarose i vand, anvendes en dråbe til midten af den nye objektglas, trykke det andet objektglas på toppen at et tyndt lag på 2% agarose som beskrevet tidligere 9.
- Når agarose er størknet, fjernes det øverste objektglas, objektglasset med agarose pad er klar til at lægge orme. Label slide med klon navn.
- Tilsæt 10 gl 25 mM NaN3 til agarose puden; pick 30-40 dyr i NaN3 opløsningen at immobilisere dem derefter sætte dækglas på toppen, gentag for både rekombinant og tomme L4440-bærende RNAi-behandlede dyr.
- Billede ormene under dissektionsmikroskop hjælp 2,5 x objektiv, her vi bruger Leica digitalkamera med understøttende software Qcapture.
- For kalibrering fange først en billede af en standard mikrometer lineal. Derefter åbne billedet i Image-Pro software, Klik på "foranstaltning" og vælg "kalibrering" og derefter vælge"Rumlig kalibrering guiden". Med "kalibrere det aktive billede" er valgt, skal du klikke på "næste". Indtast navnet til kalibrering og sikre, at de rumlige referenceenheder er sat til mikrometer. Derefter kontrollere "oprette en reference kalibrering" knappen, og klik på "næste". Klik på "draw referencelinje." En reference skala bar vises. Flytte skalalinjen at matche enderne af mikrometer, derefter indikere, at henvisningen angiver 1.000 enheder. Klik på "OK", "Next" og "Finish".
- Når softwaren er kalibreret, skal du åbne en orm image. Vælg derefter under "foranstaltning" menuen, vælg "kalibrering" og derefter klikke på "vælg rumlig". I rullemenuen skal du vælge filnavnet skabt til mikrometer kalibrering. Herefter kommer i "foranstaltning" menuen, vælg "målinger." I det vindue, der åbnes, skal du vælge frit trække værktøj og spore en linje gennem midten af dyrets krop fra hoved til hale med computer mus (figur 1). Længden vil blive rapporteret i vinduet. Nudu har to grupper af data: kropslængde på dyr behandlet med målgen RNAi og kontrol dyr behandlet med tom L4440 vektor.
- Eksporter de længdemål til et Microsoft Excel-fil eller en anden egnet statistisk software. Analysere dataene ved at beregne middelværdien og standardafvigelsen for hver prøve. Derefter sammenligne prøver ved anvendelse af Students t-test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I vores forskning har vi fokus på kropsstørrelse regulering af den DBL-1/TGF-β vej. Tabet af funktion af de DBL-1 metaboliseringsvej resulterer i lille kropsstørrelse, herunder en kortere kropslængde sammenlignet med vildtype-dyr 7,10,11. Således skærme til C. elegans kropsstørrelse mutanter er i stand til at identificere TGF-β signal komponenter og modifikatorer. DBL-1 signalering medieret af en konserveret TGF-β signaltransduktionsvej, der omfatter celleoverfladereceptorer og intracellulære Smad signaltransducere 12. For at teste effektiviteten af RNAi ved fodring til identifikation af kropsstørrelse mutanter, vi brugte denne teknik til at vælte DBL-1 pathway komponenter: dbl-1/ligand, SMA-2, SMA-3, sma-4/Smads, og sma-6/receptor. Til vores undersøgelse benyttede vi to forskellige RNAi overfølsomme C. elegans stammer til at udføre eksperimentet: ERI-1, lin-15b og RRF-3 13,14. I mellemtiden har vi også brugt N2 (STAndard vildtype) stamme og lin-36, en komponent i lin-15 pathway hvis RNAi følsomhed ikke desto mindre ligner N2 13. Vore resultater (figur 2) viser, at alle disse stammer viste den korte kropsstørrelse fænotype som forventet (p <0,001), undtagen SMA-6 RNAi i lin-36 baggrunden. I RRF-3 baggrund, var karrosserilængder af unge voksne efter RNAi behandling 84 ~ 95% af vektor alene. I ERI-1; lin-15b baggrund, karrosserilængder af unge voksne efter RNAi var 68 ~ 86% af kontroldyr. Sammenlignet med lin-36 og N2 stammer, både af RNAi overfølsomme stammerne RRF-3 og ERI-1, lin-15b var mere følsomme.
Figur 1. Repræsentative billeder af dyrets længde, der måles A. dyr billedet før måling.;
Figur 2. Kropslængde på dyr, hvor DBL-1 pathway komponenter er blevet inaktiveret ved RNAi fodringsmetode. RNAi dyr i alle disse baggrund stammer viste den korte kropslængde fænotype som forventet (p <0,001), undtagen SMA-6 RNAi i lin-36 baggrund. RNAi for RRF-3 og ERI-1, lin-15b-stammer viste en stærkere fænotype end lin-36 og N2 baggrunde.
Figur 3. Skematisk dESKRIVELSE at bruge RNAi fodringsstrategi at screene for kandidatgener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokol, beskriver vi vores metode til identifikation af kropsstørrelse mutanter af C. elegans by RNAi fodring. Denne metode anvendes til identifikation af TGF-β signal komponenter. Da sådanne komponenter er stærkt konserverede ved evolution 15, sådanne skærme er relevante for at belyse de molekylære mekanismer af TGF-β-signalering i alle metazoans. En vigtig overvejelse i udformningen af en sådan skærm er den udgangsstamme. Vi har vist, at både ERI-1, lin-15b og RRF-3 er mere følsomme over RNAi fodring end kontrolstammer, hvilket er konsistent med tidligere undersøgelser 12,13. Selv om ERI-l; lin-15b viste den stærkeste fænotypen, havde dyrene ikke vokse godt og produceret få afkom. Således i en storstilet skærm, ville vi ikke har nok dyr for at opnå fænotyper fra denne stamme. Som følge heraf foretrækker vi RRF-3-stamme at anvendeRNAi fodring teknik til kropsstørrelse regulering. Et andet valg at overveje i den begyndende stammen er, om at indlede en skærm med DBL-1 pathway intakt eller at begynde med en sensibiliseret stammen, i hvilken DBL-1 bane enten kompromitteret eller overaktiv. Disse alternative udgangspunkter sandsynligvis føre til identifikation af overlappende, men distinkte sæt signalanlæg komponenter. Vores protokol kan også modificeres til undersøgelse af andre postembryonic fænotyper. I dette tilfælde kan den fase af de dyr, der skal bedømmes for fænotypen af interesse skal modificeres ved at ændre varigheden af væksten i trin 2.5. Forud for påbegyndelse af en omfattende screening for andre fænotyper, anbefaler vi en pilot skærm med gener vides at producere fænotypen af interesse, som vi beskriver her dbl-1, SMA-2, SMA-3 SMA-4 og SMA- 6.
Ved at bruge denne protokol, vælte DBL-1 pathway komponenter viste forventet kropslængde fænotype. Tslange RNAi dyr var omkring 68-95% i længden i forhold til kontroldyr. I tidligere undersøgelser, er DBL-1 pathway tab af funktion genetiske mutanter i voksenalderen omkring 50% kortere end vildtype dyr 7,10,11. Derfor fandt den RNAi fodring teknik præsenteres her ikke fuldstændig eliminere genaktivitet. Således kan fremgangsmåden begrænset i sin evne til at identificere pathway komponenter, som har en svag fænotype. I mellemtiden, eftersom der er mange gener, der regulerer kropslængde, gener identificeret fra skærmen ligeledes ikke nødvendigvis falde i DBL-1-vejen. Yderligere forsøg skal udføres for at placere kandidater i veje, som er sandt for enhver anden skærm-metode.
Sammenfattende fodring RNAi skærme i C. elegans har vist sig nyttige til at identificere gener involveret i en proces af interesse. I denne protokol, har vi optimeret eksisterende protokoller at være særdeles effektive til identifikation af kropsstørrelse defekter. Den optimerede protokol kan yderligeremodificeret til undersøgelse af andre postembryonic fænotyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi takker James Clark til tilvejebringelse af tal for dyr på forskellige udviklingsmæssige tidspunkter. C. elegans stammer i denne undersøgelse blev indhentet fra Caenorhabditis Genetics Center, som er støttet af NIH National Center for Forskning Ressourcer (NCRR). Dette arbejde blev støttet af CIRG 1817 fra CUNY til JL og CSD, og ved NIH 1R15GM073678-01 og 1R15GM097692-01 til CSD Vi takker Dr. William J. Rice, Dr. Nathalia Holtzman, og Melissa Silvestrini om kommentarer til manuskriptet. Dette arbejde blev udført i delvis opfyldelse af kravene til en ph.d.-grad fra Graduate Center of the City University of New York (S. Xiong).
Materials
| RNAi worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Add 3 ml 1M IPTG(sterile) and 3 ml 25 mg/ml Carbenicillin(sterile); then pour into 60 mm Petri dishes. Worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 0.6 g Streptomycin Sulfate 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Pour into 60 mm Petri dishes. Worm Medium Mix 55 g Tris-Cl 24 g Tris-OH 310 g Bacto Peptone 800 mg Cholesterol 200 g NaCl Mix thoroughly and be sure to avoid chunks; this powdered mixture can be stored for many months prior to use. 2% agarose 0.5 g Agarose Add 25 ml dH2O. Heat in microwave until dissolved. 1M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 2 g IPTG Dissolve in10 ml dH2O 1M NaN3 6.5 g NaN3 Add dH2O to 100 ml 25 mM NaN3 2.5 ml 1M NaN3 Add dH2O to 100 ml Caenorhabditis elegans from Caenorhabditis Genetics Center L4440 plasmid (carries ampicillin-resistance gene) Bacteria strain HT115 (DE3) (contains IPTG inducible T7 polymerase; deficient for RNAse III gene (a dsRNAse) which also carries tetracycline-resistance gene)16 60 mm Petri dishes 100 mm Petri dishes 14 ml round-bottom Falcon culture tubes glass slides glass coverslips 1-20 μl pipettor 20-200 μl pipettor 200-1000 μl pipettor 1-200 μl pipet tips 200-1000 μl pipet tips 1.5 ml Eppendorf tubes platinum wire worm pick |
References
- Melnyk, C. W., Molnar, A., Baulcombe, D. C. Intercellular and systemic movement of RNA silencing signals. Embo J. 30, 3553-3563 (2011).
- Wall, N. R., Shi, Y. Small RNA: can RNA interference be exploited for therapy. Lancet. 362, 1401-1403 (2003).
- Kalantidis, K., Schumacher, H. T., Alexiadis, T., Helm, J. M. RNA silencing movement in plants. Biol. Cell. 100, 13-26 (2008).
- Shim, M. S., Kwon, Y. J. Efficient and targeted delivery of siRNA in vivo. Febs. J. 277, 4814-4827 (2010).
- Amarzguioui, M., Rossi, J. J., Kim, D. Approaches for chemically synthesized siRNA and vector-mediated RNAi. FEBS Lett. 579, 5974-5981 (2005).
- Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30, 313-321 (2003).
- Savage-Dunn, C., et al. Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFb pathway components. Genesis. 35, 239-247 (2003).
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
- Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).
- Wang, J., Tokarz, R., Savage-Dunn, C. The expression of TGFβ signal transducers in the hypodermis regulates body size in C. elegans. Development. 129, 4989-4998 (2002).
- Liang, J., et al. The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling. Development. 130, 6453-6464 (2003).
- Savage-Dunn, C. TGF-β signaling. WormBook. , 1-12 (2005).
- Simmer, F., et al. Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).
- Wang, D., et al. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436, 593-597 (2005).
- De Robertis, E. M. Evo-devo: variations on ancestral themes. Cell. 132, 185-195 (2008).
- Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263, 103-112 (2001).
