Summary
Abbiamo dimostrato come utilizzare la tecnica di alimentazione RNAi per abbattere i geni bersaglio e corpo fenotipo punteggio dimensione in
Abstract
Doppio filamento di RNA-mediata interferenza (RNAi) è una strategia efficace per abbattere l'espressione del gene bersaglio 1-3. Esso è stato applicato a sistemi modello molti tra piante, invertebrati e vertebrati. Ci sono vari metodi per raggiungere RNAi in vivo 4,5. Ad esempio, il gene bersaglio può essere trasformato in un vettore RNAi, e quindi permanentemente o transitoriamente trasformati in linee cellulari o cellule primarie per ottenere effetti atterramento gene; alternativamente sintetizzati oligonucleotidi a doppio filamento da geni specifici (oligo RNAi) può essere transitoriamente trasformati in linee cellulari o cellule primarie per mettere a tacere i geni bersaglio, o di sintesi del doppio filamento molecole di RNA possono essere microiniettato in un organismo. Poiché il nematode C. elegans utilizza batteri come fonte di cibo, nutrire gli animali con i batteri che esprime a doppio filamento di RNA contro geni bersaglio fornisce una strategia sostenibile 6. Qui vi presentiamo una alimentazione RNAimetodo per segnare dimensioni fenotipo corpo. Taglia corpo in C. elegans è regolato principalmente dal TGF-β - come ligando DBL-1, quindi questo saggio è appropriato per l'identificazione dei componenti di segnalazione TGF-β 7. Abbiamo usato diversi ceppi tra due ceppi ipersensibili RNAi per ripetere gli esperimenti di alimentazione RNAi. I nostri risultati hanno dimostrato che RRF-3 ceppo ci ha dato il miglior fenotipo atteso RNAi. Il metodo è di facile esecuzione, riproducibile e facilmente quantificato. Inoltre, il nostro protocollo minimizza l'uso di attrezzature specializzate, quindi è adatto per piccoli laboratori o quelli a istituzioni prevalentemente universitari.
Protocol
1. Preparazione di piastre di alimentazione RNAi trasporto Gene sequenza bersaglio
- Se si utilizzano le librerie disponibili in commercio (ad esempio da RNAi LifeSciences Fonte BioScience), passare al punto 1.4. In alternativa, clonare sequenze di geni bersaglio in vettoriale L4440, un worm comunemente usato RNAi plasmide 8, dal protocollo standard di clonazione.
- Trasformare il plasmide ricombinante in ceppo batterico HT115 (DE3), cultura loro su piastre di agar LB con 25 ug / ml carbenicillina e 12,5 ug / ml di tetraciclina, e scegliere un singolo clone per uso futuro.
- Nel frattempo, trasformare la L4440 vettore vuoto nel ceppo batterico HT115 usare come controllo per gli esperimenti.
- Cultura sia ricombinanti e vuoto L4440-trasportano batteri in 1 ml di brodo LB con 100 pg / ml ampicillina notte a 37 ° C. Tetraciclina non viene aggiunto a causa del fatto che essa diminuisce l'efficienza RNAi.
- Aggiungere un altro 5 ml di brodo LB con 100 pg / ml ampicillina nella notte culre, incubare per un altro 4-6 ore a 37 ° C.
- Seed 0,5 ml ricombinante o vuoto L4440 porta-coltura batterica su piastre a vite senza fine le RNAi. Etichettare tutti i piatti con il nome del clone.
- Contrassegnare le piastre ed incubare una notte a 37 ° C per crescere prato batterica, queste sono le piastre RNAi con o senza sequenza target gene. Almeno 2 piastre devono essere preparati per ogni condizione.
2. Worms cultura sui piatti che alimentano il RNAi
- Fiamma sterilizzare la punta di un pick verme filo di platino. Utilizzare il worm sceglie di prendere 6-10 quarto stadio larvale (L4) ermafrodite a ciascuna piastra micro-RNA che contiene o ricombinante o vuota L4440, gli animali si utilizzano i batteri come fonte di cibo.
- Lasciate ermafroditi crescere a 20 ° C (condizione standard per la cultura C. elegans) durante la notte, diventeranno giovani adulti il giorno successivo.
- Trasferimento 6-10 giovani adulti in una nuova piastra corrispondente etichettati e pronti RNAi.
- Lasciate che iladulti depongono le uova per 4-6 ore, quindi rimuovere tutti gli adulti dalla piastra, questa fase è quello di sincronizzare la progenie. Una volta che le madri vengono rimossi, inizia il conteggio del tempo. Questo è il tempo zero.
- Incubare le piastre a 20 ° C per far crescere gli animali a specifico stadio di sviluppo, in questo protocollo, abbiamo scelto i giovani adulti per l'analisi fenotipica. Per abbattimenti che si sviluppano ad un ritmo normale, 72 ore di incubazione è sufficiente per gli animali di diventare giovani adulti. Tuttavia, vari geni influenzano sviluppo animale diverso. Se RNAi induce gli animali a crescere ad un ritmo diverso, i giovani adulti possono essere identificati come quelli che ora più di 24 passato L4 con completato lo sviluppo vulvare e 2-6 embrioni in utero (se fertile). Per identificare gli altri stadi di sviluppo, lo sperimentatore deve usare lo sviluppo delle gonadi e vulvare come guida.
3. Risultato Fenotipi Corpo di ampiezza degli RNAi trattati Worms
- Posizionare due strati di nastri etichette colorate su un vetrino. Rendono due deivetrini sé. Quindi, posizionare una nuova diapositiva di vetro tra le due slitte con nastro. Melt agarosio al 2% in acqua, applicare una goccia al centro del vetrino nuovo, premere la seconda slitta di vetro sopra per fare un sottile strato di agarosio al 2% come precedentemente descritto 9.
- Una volta agarosio è solidificato, rimuovere la slitta superiore in vetro, il vetrino con agarosio pad è pronto a caricare i vermi. Diapositiva Etichetta con nome clone.
- Aggiungere 10 microlitri 25 mM NaN 3 al pad agarosio; raccogliere animali 30-40 nella soluzione 3 NaN fermarli, poi mettere coprioggetto sulla parte superiore, sia per la ripetizione ricombinante e vuoto L4440-contabile RNAi animali trattati.
- Immagine i vermi sotto microscopio da dissezione con lente 2.5x obiettivo; qui usiamo Leica fotocamera digitale con supporto Qcapture software.
- Per la calibrazione, prima di catturare l'immagine di un sovrano micrometro standard. Quindi aprire l'immagine in Image-Pro, cliccare su "misura" e scegliere "calibrazione" e poi scegliere"Wizard calibrazione spaziale". Con "calibrare l'immagine attiva" selezionato, fare clic su "Avanti". Immettere il nome per la calibrazione e garantire che le unità spaziali di riferimento sono impostate micrometro. Quindi, selezionare la casella "creare una calibrazione di riferimento" e fare clic su "Avanti". Clicca su "Linea di pareggio". Una barra di scala di riferimento verrà visualizzata. Riposizionare la barra di scala per unire le due estremità del micrometro, quindi indicare che il riferimento indica 1.000 unità. Fare clic su "OK", "Avanti" e "Fine".
- Una volta che il software è stato calibrato, aprire un'immagine verme. Quindi, selezionare nel menu "misura", selezionare "Calibrazione" quindi cliccare su "select spaziale". Nel menu a discesa, selezionare il nome del file creato per la calibrazione micrometro. Poi, sotto il menu "misura", selezionare "misure". Nella finestra che si apre, selezionare la free-disegnare strumento e tracciare una linea attraverso il centro del corpo animale dalla testa alla coda con il mouse del computer (Figura 1). La lunghezza sarà riportato nella finestra. Oraci sono due gruppi di dati: lunghezza corpo di animali trattati con gene target RNAi e animali di controllo trattati con vuoto L4440 vettore.
- Esportare le misure di lunghezza di un file di Microsoft Excel o altri software statistico adeguato. Analizzare i dati calcolando la media e la deviazione standard per ciascun campione. Quindi confrontare i campioni utilizzando Student t-test.
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Representative Results
Nella nostra ricerca, ci concentriamo sulla regolamentazione dimensioni del corpo attraverso la via DBL-1/TGF-β. La perdita di funzione delle DBL-1 risultati della via in dimensioni contenute, tra cui una lunghezza del corpo più breve rispetto a wild-type animali 7,10,11. Così, protezioni per C. elegans mutanti dimensioni del corpo sono in grado di identificare TGF-β componenti di segnalazione e modificatori. DBL-1 segnalazione è mediata da una conservata TGF-β pathway di trasduzione del segnale che include recettori della superficie cellulare e trasduttori di segnale intracellulare Smad 12. Per verificare l'efficacia di RNAi alimentando per l'identificazione di mutanti dimensioni del corpo, abbiamo utilizzato questa tecnica per abbattere DBL-1 componenti della via: dbl-1/ligand; sma-2, sma-3, sma-4/Smads e sma-6/receptor. Per il nostro studio, abbiamo utilizzato due differenti RNAi ipersensibile C. elegans ceppi per eseguire l'esperimento: eri-1; lin-15b e RRF-3 13,14. Nel frattempo, abbiamo anche utilizzato N2 (STAndard wild-type) e ceppo lin-36, un componente nel lin-15 pathway RNAi cui sensibilità è comunque analogo a N2 13. I nostri risultati (Figura 2) mostrano che tutti questi ceppi visualizzata la breve fenotipo dimensioni del corpo come previsto (p <0,001), ad eccezione di sma-6 RNAi in lin-36 di sfondo. In RRF-3 sfondo, lunghezza del corpo di giovani adulti dopo il trattamento RNAi sono 84 ~ 95% del vettore da solo. In eri-1, lin-15b sfondo, lunghezza del corpo di giovani adulti dopo RNAi è stato del 68 ~ 86% di animali di controllo. Rispetto ai ceppi lin-36 e N2, entrambi del ipersensibile RNAi ceppi RRF-3 e eri-1; lin-15b erano più sensibili.
Figura 1. Immagini rappresentative della lunghezza del corpo degli animali oggetto di valutazione degli animali A. immagine prima della misurazione.;
Figura 2. Lunghezza del corpo di animali in cui DBL-1 componenti della via sono stati inattivati con il metodo di alimentazione RNAi. Animali RNAi in tutti questi ceppi sfondo visualizzato il fenotipo breve lunghezza del corpo come previsto (p <0,001), ad eccezione di sma-6 RNAi in lin-36 sfondo. RNAi di RRF-3 e eri-1, lin-15b ceppi hanno dimostrato un fenotipo più forte di quella di lin-36 e sfondi N2.
Figura 3. Schema descrizione di utilizzare la strategia di alimentazione RNAi per lo screening di geni candidati.
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Discussion
In questo protocollo, si descrive il nostro metodo per l'identificazione di mutanti difettosi delle dimensioni del corpo C. elegans di alimentazione RNAi. Questo metodo è applicabile alla identificazione di TGF-β componenti segnalazione. Dal momento che tali componenti sono altamente conservati nel corso dell'evoluzione 15 schermi che abbiano una connessione a chiarire i meccanismi molecolari di TGF-β segnalazione in tutti i metazoi. Una considerazione importante nel progettare tale schermata è il ceppo di partenza. Abbiamo dimostrato che sia eri-1, lin-15b e RRF-3 sono più sensibili alla alimentazione RNAi che i ceppi di controllo, il che è in linea con gli studi precedenti 12,13. Tuttavia, anche se eri-l; lin-15b ha dimostrato il più forte fenotipo, gli animali non crescono bene e prodotto progenie pochi. Così, in un grande schermo, non ci sarebbe abbastanza animali per aver fenotipi di questo ceppo. Come risultato, si favorisce il-3 rrf ceppo di applicare laRNAi tecnica di alimentazione alla regolamentazione del corpo dimensioni. Una seconda scelta da considerare nel ceppo di partenza è se avviare una schermata con il DBL-1 via intatti o iniziare con un ceppo sensibilizzato in cui il DBL-1 via o è compromesso o iperattiva. Questi punti di partenza alternativi possono portare alla identificazione dei sovrapposte ma distinte serie di componenti di segnalazione. Il nostro protocollo può essere modificato anche allo studio di altri fenotipi postembrionale. In questo caso, la fase degli animali da ottenuto per il fenotipo di interesse può essere necessario modificare alterando la durata della crescita in fase 2.5. Prima di iniziare un grande schermo scala per fenotipi di altri, si consiglia uno schermo pilota con geni noti per produrre il fenotipo di interesse come si descrive qui per dbl-1, sma-2, sma sma-3-4, e sma- 6.
Utilizzando questo protocollo, abbattendo DBL-1 componenti della via ha previsto fenotipo lunghezza del corpo. Ttubo animali RNAi erano circa 68-95% in lunghezza rispetto agli animali di controllo. In studi precedenti, DBL-1 Perdita percorso di mutanti funzione genetiche in età adulta sono circa il 50% inferiore a wild-type animali 7,10,11. Pertanto, la tecnica di alimentazione RNAi qui presentato non elimina completamente l'attività del gene. Pertanto, il metodo può essere limitato nella sua capacità di identificare componenti della via che hanno un fenotipo debole. Nel frattempo, dato che ci sono molti geni che regolano la lunghezza del corpo, geni identificati dallo schermo, inoltre, non potrebbe necessariamente cadere in camera doppia-1 via. Ulteriori esperimenti devono essere eseguiti per posizionare i candidati nei percorsi, come è vero per qualsiasi metodo di altra schermata.
In sintesi, schermi di alimentazione RNAi in C. elegans sono dimostrati utili per identificare geni coinvolti in un processo di interesse. In questo protocollo, abbiamo ottimizzato protocolli esistenti di essere altamente efficace nella identificazione di difetti dimensioni del corpo. Il protocollo può essere ulteriormente ottimizzatamodificato per lo studio di altri fenotipi postembrionale.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Ringraziamo James Clark per la fornitura di figure di animali in vari momenti dello sviluppo. C. ceppi elegans in questo studio sono stati ottenuti dalla Genetics Caenorhabditis Center, che è supportato dal National Center for NIH Research (NCRR). Questo lavoro è stato sostenuto da CIRG 1817 della CUNY a JL e CSD, e dal NIH 1R15GM073678-01 e 1R15GM097692-01 al CSD Ringraziamo il Dott. William J. Rice, il dottor Nathalia Holtzman, e Melissa Silvestrini per i commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato svolto in adempimento parziale dei requisiti per un dottorato di ricerca del Graduate Center della City University di New York (S. Xiong).
Materials
| RNAi worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Add 3 ml 1M IPTG(sterile) and 3 ml 25 mg/ml Carbenicillin(sterile); then pour into 60 mm Petri dishes. Worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 0.6 g Streptomycin Sulfate 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Pour into 60 mm Petri dishes. Worm Medium Mix 55 g Tris-Cl 24 g Tris-OH 310 g Bacto Peptone 800 mg Cholesterol 200 g NaCl Mix thoroughly and be sure to avoid chunks; this powdered mixture can be stored for many months prior to use. 2% agarose 0.5 g Agarose Add 25 ml dH2O. Heat in microwave until dissolved. 1M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 2 g IPTG Dissolve in10 ml dH2O 1M NaN3 6.5 g NaN3 Add dH2O to 100 ml 25 mM NaN3 2.5 ml 1M NaN3 Add dH2O to 100 ml Caenorhabditis elegans from Caenorhabditis Genetics Center L4440 plasmid (carries ampicillin-resistance gene) Bacteria strain HT115 (DE3) (contains IPTG inducible T7 polymerase; deficient for RNAse III gene (a dsRNAse) which also carries tetracycline-resistance gene)16 60 mm Petri dishes 100 mm Petri dishes 14 ml round-bottom Falcon culture tubes glass slides glass coverslips 1-20 μl pipettor 20-200 μl pipettor 200-1000 μl pipettor 1-200 μl pipet tips 200-1000 μl pipet tips 1.5 ml Eppendorf tubes platinum wire worm pick |
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