Summary
우리는에서 대상 유전자와 점수 몸 크기 표현형을 노크 RNAi 먹이 기술을 사용하는 방법을 보여줍니다
Abstract
두 번 스트랜드 RNA로 인한 간섭 (RNAi)는 대상 유전자 표현 1-3를 비판 할 효과적인 전략이다. 그것은 식물, 무척추 동물 및 vertebrates 등 많은 모델 시스템에 적용되었습니다. 생체 4,5에서 RNAi를 달성하기위한 다양한 방법이 있습니다. 예를 들어, 대상 유전자는 RNAi 벡터로 변환 한 후 영구적 또는 transiently 셀 라인 또는 유전자 최저 효과를 달성 할 기본 세포로 변환 될 수 있으며, 대안 특정 대상 유전자 (RNAi oligos)에서 두 번 스트랜드의 oligonucleotides를 합성 transiently 수 있습니다 대상 유전자를 침묵하는 세포 라인 또는 기본 세포로 변환, 또는 합성 두 번 좌초 RNA 분자는 생명체로 microinjected 할 수 있습니다. 선충류 C. 이후 elegans는 박테리아가 대상 유전자에 대한 이중 가닥 RNA을 표현과 함께 동물 먹이, 식품 소스로 박테리아를 사용하는 가능한 전략 6 제공합니다. 여기 RNAi 먹이를 제공방법은 몸 크기 표현형의 점수를합니다. C. 몸 크기 elegans는 주로 TGF-β에 의해 규제되어 있습니다 - 같은 리간드 DBL-1,이 분석은 TGF-β 신호 구성 요소를 7 식별에 적합합니다. 우리는 RNAi 먹이 실험을 반복하는 두 RNAi 지나치게 긴장 등의 다양한 변종을 사용. 우리의 결과는 rrf-3 스트레인가 우리에게 가장 예상 RNAi의 표현형 준 것으로 나타났다. 방법은 수행 할 수 쉽게 재현, 쉽게 계량입니다. 또한, 우리의 프로토콜은 특수 장비의 사용을 최소화하기 때문에 작은 실험실 또는 주로 대학 기관에서 사람들에게 적합합니다.
Protocol
1. 대상 유전자 시퀀스을 지니고 RNAi 수유 플레이트 준비
- 상업적으로 이용 가능한 RNAi 라이브러리 (예를 들면 소스 BioScience LifeSciences에서) 사용하는 경우, 1.4 단계로 진행합니다. 또한, 표준 복제 프로토콜, 벡터 L4440, 8 RNAi 플라스미드 일반적으로 사용되는 웜으로 대상 유전자 시퀀스를 복제.
- 박테리아 변종 HT115 (DE3), 25 μg / ML carbenicillin과 LB 한천 플레이트에 문화를 및 12.5 μg / ML의 테트라 사이클린에 재조합 플라스미드를 변환하고, 향후 사용을위한 단일 클론을 선택합니다.
- 한편, 실험에 대한 제어로 사용하기 위해 박테리아 변종 HT115에 빈 벡터 L4440을 변환 할 수 있습니다.
- 37 번 하루 아침에 100 μg / ML 암피실린 1 ML LB의 국물 ° C.의 문화 재조합과 빈 모두 L4440 운반 세균 테트라 사이클린은이 RNAi 효율을 감소한다는 사실로 인해 추가되지는 않습니다.
- 밤새 cultu에 100 μg / ML 암피실린과 함께 앞으로 5 ML의 LB의 국물을 추가다시, 37에서 다른 4-6 시간에 품다 ° C.
- 종자 0.5 ML 재조합 또는 빈 L4440 운반 RNAi 웜 접시에 박테리아 문화를. 클론 이름으로 모든 접시를 붙입니다.
- 접시를 선택 37에서 하룻밤 배양 ° C 세균 잔디를 성장하기 위해, 이것들은 목표 유전자 순서에 상관없이 RNAi 판입니다. 최소 2 플레이트는 각 조건에 대해 준비해야합니다.
2. RNAi 수유 접시에 문화 웜
- 불꽃은 백금 와이어 웜 피크의 끝을 소독. 6-10 네번째 애벌레의 단계 (L4)이 중 재조합 또는 빈 L4440를 포함 각 RNAi 판에 나온 것 데리러 선택 웜을 사용, 동물 식품 소스로 박테리아를 사용합니다.
- 광고에 나온 것 ... 20 ° C (C. elegans에 대한 표준 문화 조건) 밤에 성장하자, 그들은 다음 날 젊은 성인이 될 것입니다.
- 새로운 상응 표시 및 준비 RNAi 판에 6-10 청소년을 전송합니다.
- 하자성인 4-6 시간에 알을 낳고, 다음 판의 모든 성인을 제거,이 단계는 자손을 동기화하는 것입니다. 어머니가 제거되면 시간을 계산하기 시작합니다. 이 시간 제로입니다.
- 20 접시를 길러 ° C 동물이 특정 발달 단계에기를,이 프로토콜에, 우리는 phenotypic 분석을위한 청년를 선택합니다. 정상적인 속도로 개발 knockdowns를 들어, 72 시간의 배양은 젊은 성인이되는 동물 충분합니다. 그러나, 여러 유전자가 다른 동물의 개발에 영향을 미칩니다. RNAi가 다른 속도로 성장 동물을가 발생하면, 젊은 성인은 자궁에 완료 외음부 개발 및 2-6 배아 (비옥 한 경우)과 L4를지나 그 더 이상 24 이상의 시간으로 식별 할 수 있습니다. 다른 발달 단계를 확인하려면 수사관이 가이드로 생식샘과 외음부 개발을 사용해야합니다.
3. RNAi의 점수 바디 크기 Phenotypes이 웜을 치료
- 유리 슬라이드에 색상 라벨 테이프의 두 레이어를 놓습니다. 의 두 개SE 유리 슬라이드. 그런 다음 테이프 두 슬라이드 사이에 새 유리 슬라이드를 놓습니다. 물에 2% 아가로 오스를 녹여, 새로운 유리 슬라이드의 중심에 한 방울을 적용 한 후 아가로 오스는 이전과 같이 구 설명 2 %의 얇은 층을 만들기 위해 상단에 두 번째 유리 슬라이드를 누릅니다.
- 아가로 오스가 확정되면, 상단 유리 덮개를 제거, 아가로 오스 패드와 슬라이드 웜을로드 할 준비가되어 있습니다. 클론 이름 라벨 슬라이드.
- 아가로 오스 패드에 10 μl 25 MM 앤 3 추가,이를 고정하는 할머니 3 솔루션으로 30-40 동물을 선택 한 후 상단에 coverslip을 넣어, 재조합과 빈 모두 RNAi - 처리 동물을 L4440-수행하기위한 반복.
- 이미지 2.5x 목적 렌즈를 사용하여 해부 현미경으로 웜, 여기에 우리가 소프트웨어 Qcapture을 지원과 함께 Leica 디지털 카메라를 사용합니다.
- 교정을 위해 먼저 표준 마이크로 미터 통치자의 이미지를 캡처합니다. 그런 다음 이미지 Pro 소프트웨어에서 이미지를 열고 선택한 다음 "측정"을 클릭하고 "보정"을 선택"공간 보정 마법사". 선택 "활성화 된 이미지를 보정"으로, "다음"을 클릭하십시오. 입력 보정을위한 이름과 공간 참조 단위 마이크로 미터로 설정되어 있는지 확인합니다. 그런 다음 "만들기 참조 보정"버튼을 확인하고 "다음"을 클릭합니다. 을 클릭 "그리기 기준선." 참조 규모 줄이 나타납니다. 마이크로 미터의 끝과 일치 할 수있는 규모의 바 위치를 변경 한 다음 참조가 1,000 대를 나타냅니다 나타냅니다. , "OK", "다음", 그리고 "마침"을 클릭합니다.
- 소프트웨어가 교정되면, 웜 이미지를 엽니 다. 그런 다음, "선택 공간"을 클릭 한 다음 '보정'을 선택하고 '측정'메뉴에서 선택합니다. 풀다운 메뉴에서 마이크로 미터 교정을 위해 만든 파일 이름을 선택합니다. 그런 다음 '측정'메뉴에서 '측정'을 선택합니다. 열리는 창에서 자유 그리기 도구를 선택하고 컴퓨터를 마우스 (그림 1)과 꼬리에 머리에서 동물 몸의 중심을 통해 라인을 그린다. 길이는 창에보고됩니다. 지금대상 유전자 RNAi와 빈 L4440 벡터로 처리 제어 동물로 치료 동물의 몸 길이 : 당신이 데이터의 두 그룹이 있습니다.
- Microsoft Excel 파일, 또는 다른 적절한 통계 소프트웨어로 길이 측정을 보냅니다. 각 샘플에 대한 평균과 표준 편차를 계산하여 데이터를 분석 할 수 있습니다. 그런 다음 학생의 t-테스트를 사용하여 샘플을 비교합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
우리의 연구에서, 우리는 DBL-1/TGF-β 경로의 몸 크기 조절에 중점을두고 있습니다. 야생 형 동물 7,10,11에 비해 짧은 몸 길이 등의 작은 몸 크기 DBL-1 경로 결과의 함수의 손실. C.에 따라서 화면 elegans의 몸 크기 돌연변이 TGF-β 신호 구성 요소와 수식을 식별 할 수 있습니다. DBL-1 신호는 세포 표면 수용체와 세포 Smad 신호 변환기 12 포함 보존 TGF-β 신호 전달 경로에 의해 중재됩니다. dbl-1/ligand, SMA-2, SMA-3, sma-4/Smads 및 : 신체 사이즈 돌연변이의 식별을 위해 먹이가 RNAi의 효과를 테스트하기 위해, 우리는 DBL-1 경로 구성 요소를 다운 노크도이 기술을 사용 sma-6/receptor. 우리의 연구를 들어, 두 개의 서로 다른 RNAi 지나치게 C.를 사용 elegans는 긴장 실험을 수행 할 수 : eri-1, 린 - 15B와 rrf-3 13,14. 한편, 우리는 또한 (역 N2를 사용ndard 야생 형) 변형과 린-36, RNAi 감도 N2 13 그럼에도 불구하고 유사합니다 린-15 경로의 구성 요소입니다. 린-36 배경에 SMA-6 RNAi를 제외하고 (P <0.001) 예상 한대로 이러한 변종의 모든 짧은 몸 크기 표현형을 표시하는 결과 (그림 2)를 보여줍니다. rrf-3 배경에서 RNAi 치료 후 젊은 성인의 몸 길이는 84 ~ 혼자 벡터의 95 %이었다. eri-1에서, 젊은 성인의 린 - 15B 배경, 바디 길이 RNAi는 제어 동물의 68 ~ 86% 한 이후. 린 - 15B 더 민감했다, 린-36과 N2 긴장, RNAi 지나치게 긴장 rrf-3 eri-1 모두 비교했다.
1 그림. 동물 몸 길이의 대표 이미지가 측정되는 A. 동물 이미지를 측정하기 전에.;
그림 2. 이러한 배경 변종의 모든 DBL-1 경로 구성 요소가 RNAi 먹이 방법에 의해 inactivated 된있는 동물의 몸 길이입니다. RNAi 동물 린-36의 SMA-6 RNAi를 제외하고 (P <0.001) 예상대로 짧은 몸 길이 표현형을 표시 배경. rrf-3 eri-1의 RNAi, 린 - 15B의 변종은 린-36과 N2 배경보다 강한 표현형을 보여 주었다.
그림 3. 개략적 인 D후보 유전자에 대한 검진 RNAi 먹이 전략을 사용 escription.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 프로토콜에서는, 우리는 C.의 몸 크기 결함이있는 돌연변이의 식별을위한 우리의 방법을 설명 RNAi 먹이로 elegans. 이 방법은 TGF-β 신호 구성 요소의 식별에 적용됩니다. 이러한 구성 요소가 매우 진화 15 일까지 보존되어 있으므로, 이러한 화면은 metazoans에서 TGF-β 신호의 분자 메커니즘을 elucidating에 관련이 있습니다. 이러한 화면 설계의 중요한 고려 사항은 시작 변형입니다. 린 - 15B와 rrf-3 이전 연구 12,13와 일치 제어 변종보다 RNAi 먹이에 더 민감합니다, 우리는 모두 eri-1이 그렇게 보여주고 있습니다. eri - 나에도 불구 그러나, 린 - 15B는 강한 표현형을 보여, 동물 잘 성장하고 몇 자손을 생산 없습니다. 따라서, 대규모 화면에서, 우리는이 긴장의 phenotypes 점수를 충분히 동물이없는 것입니다. 결과적으로, 우리는 rrf-3 스트레인을 적용 할 선호몸 크기 조절에 대한 RNAi 먹이 기술. 시작 변형에 고려해야 할 두 번째 선택은 그대로 DBL-1 경로와 화면을 시작하거나 DBL-1 경로가 중 손상이나 활약이 지나친되는 sensitized 부담으로 시작할지 여부입니다. 이러한 대안 시작 지점은 중복을 식별하지만 신호 구성 요소의 고유 한 세트로 이어질 가능성이 높습니다. 우리 프로토콜은 다른 postembryonic phenotypes의 연구에 수정할 수 있습니다. 이 경우, 관심있는 표현형에 대한 채점 할 동물의 단계는 단계 2.5 성장의 기간을 변경하여 수정해야 할 수 있습니다. 이전 다른 phenotypes에 대한 대규모 화면을 시작하기 위해, 우리는 우리가 dbl-1, SMA-2, SMA-3 SMA-4, 및 SMA-보시려면 여기를 설명하는 등 관심의 표현형을 생산하는 것으로 알려진 유전자 파일럿 화면을 권장 6.
이 프로토콜을 사용하여 DBL-1 경로 구성 요소를 쓰러 트립니다으로 예상 몸 길이 표현형이 나타났다. 티호스 RNAi 동물 관리 동물에 비해 길이는 68-95 % 정도이었다. 이전 연구에서 성인의 기능 유전자 돌연변이의 DBL-1 경로 손실이 야생 형 동물 7,10,11보다 50 % 단축됩니다. 따라서 여기에 제시된 RNAi 먹이 기술은 완전히 유전자 활동을 제거 없습니다. 따라서, 방법은 약한 표현형이 경로 구성 요소를 식별하는 능력에 제한 될 수 있습니다. 몸의 길이를 조절 많은 유전자가 있기 때문에 한편, 화면에서 확인 유전자는 반드시 DBL-1 경로에 빠지지 않을 수도 있습니다. 다른 화면 방법으로 사실로 더 실험은 경로에 후보를 배치 할 수행해야합니다.
C.의 요약에서 RNAi 먹이 화면 elegans 관심의 과정에 참여 유전자를 식별하는 데 유용 입증했습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 몸 크기 결함의 식별에 매우 효과적인 것으로 기존의 프로토콜을 최적화했습니다. 최적화 된 프로토콜은 더 할 수 있습니다다른 postembryonic phenotypes의 연구에 대한 수정.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
우리는 다양한 개발 시간 지점에서 동물의 숫자를 제공하기 위해 제임스 클락을 감사드립니다. C. 본 연구의 elegans 변종은 연구 자원에 대한 NIH 국립 센터 (NCRR)에 의해 지원됩니다 Caenorhabditis 유전학 센터에서 얻은되었습니다. 이 작품은 CUNY에서 JL과 CSD에 CIRG 1817에 의해 지원되었다, 그리고 NIH 1R15GM073678-01와 CSD로 1R15GM097692-01에 의해 우리는 원고에 대한 의견에 박사 윌리엄 J 쌀, 박사 Nathalia Holtzman, 그리고 멜리사 Silvestrini 감사드립니다. 이 작품은 뉴욕시 대학 (S. Xiong)의 대학원 센터에서 박사 학위에 대한 요구 사항의 일부 이행 실시되었다.
Materials
| RNAi worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Add 3 ml 1M IPTG(sterile) and 3 ml 25 mg/ml Carbenicillin(sterile); then pour into 60 mm Petri dishes. Worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 0.6 g Streptomycin Sulfate 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Pour into 60 mm Petri dishes. Worm Medium Mix 55 g Tris-Cl 24 g Tris-OH 310 g Bacto Peptone 800 mg Cholesterol 200 g NaCl Mix thoroughly and be sure to avoid chunks; this powdered mixture can be stored for many months prior to use. 2% agarose 0.5 g Agarose Add 25 ml dH2O. Heat in microwave until dissolved. 1M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 2 g IPTG Dissolve in10 ml dH2O 1M NaN3 6.5 g NaN3 Add dH2O to 100 ml 25 mM NaN3 2.5 ml 1M NaN3 Add dH2O to 100 ml Caenorhabditis elegans from Caenorhabditis Genetics Center L4440 plasmid (carries ampicillin-resistance gene) Bacteria strain HT115 (DE3) (contains IPTG inducible T7 polymerase; deficient for RNAse III gene (a dsRNAse) which also carries tetracycline-resistance gene)16 60 mm Petri dishes 100 mm Petri dishes 14 ml round-bottom Falcon culture tubes glass slides glass coverslips 1-20 μl pipettor 20-200 μl pipettor 200-1000 μl pipettor 1-200 μl pipet tips 200-1000 μl pipet tips 1.5 ml Eppendorf tubes platinum wire worm pick |
References
- Melnyk, C. W., Molnar, A., Baulcombe, D. C. Intercellular and systemic movement of RNA silencing signals. Embo J. 30, 3553-3563 (2011).
- Wall, N. R., Shi, Y. Small RNA: can RNA interference be exploited for therapy. Lancet. 362, 1401-1403 (2003).
- Kalantidis, K., Schumacher, H. T., Alexiadis, T., Helm, J. M. RNA silencing movement in plants. Biol. Cell. 100, 13-26 (2008).
- Shim, M. S., Kwon, Y. J. Efficient and targeted delivery of siRNA in vivo. Febs. J. 277, 4814-4827 (2010).
- Amarzguioui, M., Rossi, J. J., Kim, D. Approaches for chemically synthesized siRNA and vector-mediated RNAi. FEBS Lett. 579, 5974-5981 (2005).
- Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30, 313-321 (2003).
- Savage-Dunn, C., et al. Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFb pathway components. Genesis. 35, 239-247 (2003).
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
- Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).
- Wang, J., Tokarz, R., Savage-Dunn, C. The expression of TGFβ signal transducers in the hypodermis regulates body size in C. elegans. Development. 129, 4989-4998 (2002).
- Liang, J., et al. The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling. Development. 130, 6453-6464 (2003).
- Savage-Dunn, C. TGF-β signaling. WormBook. , 1-12 (2005).
- Simmer, F., et al. Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).
- Wang, D., et al. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436, 593-597 (2005).
- De Robertis, E. M. Evo-devo: variations on ancestral themes. Cell. 132, 185-195 (2008).
- Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263, 103-112 (2001).
