Summary
Wir zeigen, wie die RNAi Fütterung Technik nutzen, um knock down Zielgene und Gäste Körpergröße Phänotyp
Abstract
Doppel-Strang-RNA-Interferenz (RNAi) ist eine effektive Strategie, um knock down Zielgenexpression 1-3. Es wurde in viele Modellsysteme einschließlich Pflanzen, Wirbellosen und Wirbeltieren angewendet worden. Es gibt verschiedene Methoden, um RNAi in vivo 4,5 zu erreichen. Zum Beispiel kann das Ziel-Gen kann in einen RNAi Vektor transformiert werden und dann entweder dauerhaft oder transient in Zelllinien oder primäre Zellen nach Gens Knockdown Effekte zu erzielen transformiert, alternativ synthetisierte doppelsträngige Oligonukleotide aus spezifischer Zielgene (RNAi Oligos) kann transient sein transformiert, in Zelllinien oder primäre Zellen nach Zielgene Schweigen; oder synthetisierten Doppelstrang-RNA-Moleküle können in einen Organismus mikroinjiziert werden. Seit dem Fadenwurm C. elegans verwendet Bakterien als Nahrungsquelle, die Fütterung der Tiere mit Bakterien, die doppelsträngige RNA gegen Zielgene bietet eine tragfähige Strategie 6. Hier präsentieren wir eine RNAi FütterungMethode punkten Körpergröße Phänotyp. Körpergröße in C. elegans primär durch die TGF-β reguliert wird - wie Ligand DBL-1, so dass dieser Assay geeignet ist zur Identifizierung von TGF-β Signalkomponenten 7. Wir verwendeten verschiedene Stämme, darunter zwei RNAi überempfindlich Stämme, die RNAi Fütterungsversuche wiederholen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass rrf-3-Stamm gab uns die besten erwarteten RNAi Phänotyp. Die Methode ist einfach durchzuführen, reproduzierbar und leicht zu quantifizieren. Darüber hinaus minimiert unser Protokoll die Verwendung von Spezialgeräten, so ist es für kleinere Laboratorien oder jenen an überwiegend Bachelor-Institutionen.
Protocol
Ein. Vorbereiten RNAi Feeding Plates Tragen Zielgensequenz
- Bei der Verwendung von kommerziell erhältlichen RNAi-Bibliotheken (zB von Quelle BioScience LifeSciences), fahren Sie mit Schritt 1.4. Alternativ klonen Target-Gensequenzen in Vektor L4440, ein häufig verwendetes Wurm RNAi Plasmid 8, Standard-Klonen Protokoll.
- Verwandeln Sie das rekombinante Plasmid in Bakterienstamm HT115 (DE3), Kultur sie auf LB-Agar-Platten mit 25 ug / ml Carbenicillin und 12,5 pg / ml Tetracyclin, und wählen Sie einen einzigen Klon für die zukünftige Verwendung.
- Unterdessen transformieren Leervektor L4440 in Bakterienstamm HT115 als Kontrolle für die Experimente verwendet.
- Kultur sowohl rekombinante und leer L4440-tragenden Bakterien in 1 ml LB-Medium mit 100 ug / ml Ampicillin über Nacht bei 37 ° C. Tetracyclin nicht hinzugefügt wird aufgrund der Tatsache, dass es RNAi Effizienz abnimmt.
- Weitere 5 ml LB-Medium mit 100 ug / ml Ampicillin in die Nacht culture, für etwa 4-6 h bei 37 ° C.
- Seed 0,5 ml rekombinanten oder leer L4440 tragenden Bakterienkultur auf die RNAi-Wurm Platten. Beschriften Sie alle Platten mit Klon Namen.
- Markieren Sie die Platten und Inkubation über Nacht bei 37 ° C bis Bakterienrasen wachsen, das sind die RNAi Platten mit oder ohne Ziel Gensequenz. Mindestens 2 Platten sollten für jede Bedingung vorbereitet werden.
2. Kultur Worms auf den RNAi Feeding Plates
- Flamme sterilisieren die Spitze eines Platin Drahtwurm Wahl. Verwenden Sie den Wurm holen zu holen 6-10 vierten Larvenstadium (L4) Zwitter jedem RNAi Platte, die entweder rekombinante oder leer L4440 enthält; die Tiere werden die Bakterien als Nahrungsquelle zu nutzen.
- Lassen Hermaphroditen bei 20 ° C (ein Standard-Kulturbedingungen für C. elegans) über Nacht wachsen, werden sie als junge Erwachsene am nächsten Tag.
- Übertragen 6-10 jungen Erwachsenen in einer neuen entsprechend gekennzeichnet und vorbereitet RNAi Platte.
- Lassen Sie dieErwachsene legen Eier für 4-6 Stunden, dann entfernen Sie alle Erwachsenen von der Platte; dieser Schritt ist, um die Nachkommenschaft zu synchronisieren. Sobald die Mütter entfernt werden, beginnen zu zählen. Dies ist zeit Null.
- Die Inkubation bei 20 ° C zu lassen Tieren zu bestimmten Entwicklungsstadium wachsen; in diesem Protokoll, wählen wir junge Erwachsene für phänotypische Analyse. Für Niederschlägen, die in einem normalen Tempo zu entwickeln, ist 72-stündigen Inkubation ausreichend für die Tiere zu jungen Erwachsenen geworden. Allerdings wirken sich verschiedene Gene tierischen Entwicklung anders. Wenn RNAi verursacht Tiere mit einer anderen Rate wachsen, können junge Erwachsene wie die nicht mehr als 24 Stunden letzten L4 werden mit abgeschlossener Vulva Entwicklung und 2-6 Embryonen in die Gebärmutter (wenn fruchtbaren) identifiziert. Um andere Entwicklungsstadien zu erkennen, sollte der Prüfer Gonaden und Vulva Entwicklung als Leitfaden verwenden.
3. Ergebnis Body Size Phänotypen der RNAi behandelt Worms
- Zeigen zwei Schichten von farbigen Etikettenbänder auf einem Glasträger. Machen Sie zwei derse Glasträger. Dann legen Sie eine neue Glasplatte zwischen den beiden Folien mit Klebeband. Melt 2% Agarose in Wasser; einen Tropfen in die Mitte des neuen Glasträger; drücken Sie dann die zweite Glasplatte auf der Oberseite eine dünne Schicht von 2% Agarose wie zuvor beschrieben 9 machen.
- Sobald Agarose verfestigt wird, entfernen Sie die obere Glasplatte; der Schlitten mit Agarose-Pad ist bereit, Würmer zu laden. Label slide mit Klon Namen.
- Fügen Sie 10 ul 25 mM NaN 3 zu dem Agarose-Pad; holen 30-40 Tiere in die NaN 3-Lösung, um sie zu immobilisieren; dann legte Deckglas auf der Oberseite; wiederholen sowohl für rekombinante und leer L4440 tragenden RNAi-behandelten Tieren.
- Bild die Würmer unter Binokular mit 2.5x Objektiv; hier benutzen wir Leica Digitalkamera mit unterstützender Software Qcapture.
- Zur Kalibrierung ersten Aufnehmen eines Bildes eines Standard-Mikrometer-Herrscher. Dann öffnen Sie das Bild in Image-Pro Software, die auf "Messen" klicken und wählen Sie "Kalibrierung" und wählen Sie dann"Spatial Calibration Wizard". Mit "kalibrieren das aktive Bild" gewählt haben, auf "weiter" klicken. Geben Sie den Namen für die Kalibrierung und sicherzustellen, dass die Raumbezug Einheiten Mikrometer eingestellt sind. Dann überprüfen Sie die "eine Referenz Kalibrierung" und klicken Sie auf "weiter". Klicken Sie auf "draw Bezugslinie." Ein Verweis Maßstab erscheint. Neupositionierung des Maßstabsbalken, um die Enden des Mikrometers übereinstimmen, dann zeigen, dass die Referenz 1.000 Einheiten anzeigt. Klicken Sie auf "OK", "Weiter" und "Fertigstellen".
- Sobald die Software kalibriert ist, öffnet sich ein Wurm Bild. Dann, unter dem Menü "Messen", wählen Sie "Kalibrierung" und klicken Sie auf "select räumliche". In dem Pull-Down-Menü wählen Sie den Dateinamen für die Mikrometerkalibriervorrichtung erstellt. Dann, unter dem Menü "Messen", wählen Sie "Messungen." In dem sich öffnenden Fenster wählen Sie die freie Zeichnen Werkzeug und eine Linie durch die Mitte des tierischen Körpers von Kopf bis Schwanz mit Computer-Maus (Abbildung 1). Die Länge wird im Fenster anzuzeigen. JetztSie haben zwei Gruppen von Daten: Rumpflänge von Tieren mit Zielgen RNAi und Kontrolltieren mit leeren L4440 Vektor behandelt wurden.
- Exportieren Sie die Längenmessung in eine Microsoft Excel-Datei, oder einem anderen geeigneten statistischen Software. Analyse der Daten durch die Berechnung der Mittelwert und die Standardabweichung für jede Probe. Dann vergleichen Sie Proben mittels Student-t-Test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In unserer Forschung konzentrieren wir uns auf die Körpergröße der Regulierung durch die DBL-1/TGF-β Weg. Der Verlust der Funktion der DBL-1-Weg führt zu geringe Körpergröße, einschließlich einer kürzeren Körper Länge im Vergleich mit Wildtyp-Tieren 7,10,11. So Bildschirme für C. elegans Körpergröße Mutanten, imstande sind, TGF-β-Signalisierung Komponenten und Modifikatoren. DBL-1-Signalisierung wird durch eine konservierte TGF-β Signalübertragungswegs, die Zelloberflächen-Rezeptoren und intrazellulären Smad Signalwandler 12 enthält vermittelt. Um die Wirksamkeit der RNAi durch Zuführen zur Identifizierung von Mutanten Körpergröße zu testen, verwendeten wir diese Technik auf niederzuschlagen DBL-1-Weges Komponenten: dbl-1/ligand; SMA-2, SMA-3, sma-4/Smads, und sma-6/receptor. Für unsere Studie haben wir zwei verschiedene RNAi überempfindlich C. elegans-Stämme, um das Experiment durchzuführen: eri-1; lin-15b und rrf-3 13,14. Inzwischen haben wir auch genutzt N2 (standard Wildtyp) Belastung und lin-36, eine Komponente in der lin-15-Weg, dessen RNAi Empfindlichkeit ist jedoch ähnlich wie N2 13. Unsere Ergebnisse (Abbildung 2) zeigen, dass alle diese Stämme die kurze Körpergröße Phänotyp wie erwartet angezeigt (p <0,001), außer sma-6 RNAi in lin-36 Hintergrund. In rrf-3 Hintergrund waren Körperlängen von jungen Erwachsenen nach RNAi-Behandlung 84 ~ 95% der Vektor alleine. In eri-1; lin-15b Hintergrund, Körperlängen von jungen Erwachsenen nach RNAi waren 68 ~ 86% der Kontrolltiere. Verglichen mit 36 und lin-N2-Stämme, sowohl des RNAi überempfindlich Stämme rrf-3 und eri-1; lin-15b empfindlicher waren.
Abbildung 1. Repräsentative Bilder tierischen Körper gemessenen Länge A. Tier Bild vor der Messung.
Abbildung 2. Körperlänge von Tieren, bei denen DBL-1-Weg Komponenten durch RNAi Fütterungsmethode wurden inaktiviert. RNAi Tieren in all diesen Hintergrund Stämme erscheint die kurze Körperlänge Phänotyp wie erwartet (p <0,001), außer sma-6 RNAi in lin-36 Hintergrund. RNAi von rrf-3 und eri-1; lin-15b Stämme zeigte eine stärkere Phänotyp als die lin-36 und N2 Hintergründen.
Abbildung 3. Schematische deschreibung der Verwendung RNAi Fütterung Strategie für Kandidatengene zu screenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In diesem Protokoll beschreiben wir unsere Methode zur Identifizierung von Körpergröße Defektmutanten von C. elegans durch RNAi Fütterung. Dieses Verfahren ist anwendbar auf die Identifizierung von TGF-β-Signalisierung Komponenten. Da diese Komponenten stark durch Evolution 15 konserviert sind, sind solche Bildschirme relevant zur Aufklärung der molekularen Mechanismen der TGF-β-Signalisierung in allen Metazoen. Eine wichtige Überlegung bei der Gestaltung eines solchen Bildschirms ist der Ausgangsstamm. Wir haben gezeigt, dass sowohl eri-1; lin-15b und rrf-3 empfindlicher auf RNAi Fütterung als die Kontrolltiere Stämme, die im Einklang mit früheren Studien 12,13 ist sind. Jedoch obwohl eri-l; lin-15b demonstriert die stärkste Phänotyp haben die Tiere nicht gut wachsen und produzierte einige Nachkommen. So wird in einer großen Leinwand, hätten wir nicht genug Tiere für Scoring Phänotypen aus diesem Stamm. Als Ergebnis, favorisieren wir die rrf-3-Stamm der AnwendungRNAi Fütterung Technik zur Körpergröße Regulierung. Eine zweite Wahl im Ausgangsstamm prüfen ist, ob ein Bild mit der DBL-1-Weg intakt initiieren oder mit einer sensibilisierten Stamm, in dem der DBL-1-Weg entweder gefährdet ist oder überaktive beginnen. Diese alternativen Startpunkte sind wahrscheinlich auf die Identifizierung von sich überlappenden, aber unterschiedliche Sätze von Signalisierungs-Komponenten führen. Unsere Protokoll kann auch zur Untersuchung anderer postembryonalen Phänotypen modifizieren. In diesem Fall kann die Stufe der Tiere für den Phänotyp von Interesse erzielt werden müssen, um durch Veränderung der Dauer des Wachstums in Schritt 2.5 verändert werden. Vor Einleiten in großem Maßstab Bildschirm für andere Phänotypen, würden wir eine Pilot-Bildschirm mit Genen bekannt, den Phänotyp von Interesse produzieren empfehlen wie hier Beschriebenen für DBL-1, SMA-2, SMA-3 SMA-4 und SMA- 6.
Durch die Verwendung dieses Protokolls, umzuwerfen DBL-1-Weg Komponenten zeigte erwarten Körperlänge Phänotyp. TSchlauch RNAi Tiere waren etwa 68-95% in der Länge im Vergleich zu Kontrolltieren. In früheren Studien sind DBL-1-Weg Verlust der Funktion genetische Mutanten im Erwachsenenalter etwa 50% kürzer als Wildtyp-Tieren 7,10,11. Daher hat die RNAi Fütterung hier vorgestellte Technik nicht vollständig beseitigen Genaktivität. Somit kann das Verfahren in seiner Fähigkeit, Stoffwechselweg Komponenten, die eine schwache Phänotyp zu identifizieren begrenzt. Währenddessen, da es viele Gene, die Körperlänge regulieren sind, aus der Gene Screen identifiziert könnten auch nicht notwendigerweise in der DBL-1-Weges fallen. Weitere Experimente durchgeführt werden, um Kandidaten in Bahnen zu platzieren, wie es für jeden anderen Bildschirm Methode true zurück.
Zusammenfassend RNAi Fütterung Bildschirme in C. elegans Bewährt haben sich in der Identifizierung von Genen in einem Verfahren von Interesse beteiligt. In diesem Protokoll haben wir bestehende Protokolle optimiert als hoch wirksam bei der Identifizierung von Defekten Körpergröße. Das optimierte Protokoll weitergeändert für die Untersuchung anderer postembryonalen Phänotypen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir danken James Clark für die Bereitstellung Figuren von Tieren in verschiedenen Entwicklungs-Zeitpunkten. C. elegans-Stämme in dieser Studie wurden vom Caenorhabditis Genetics Center, das durch die NIH National Center for Research Resources (NCRR) getragen wird erhalten. Diese Arbeit wurde von CIRG 1817 vom CUNY JL und CSD unterstützt und durch NIH 1R15GM073678-01 und 1R15GM097692-01 bis CSD Wir danken Dr. William J Rice, Dr. Nathalia Holtzman und Melissa Silvestrini für Kommentare zum Manuskript. Diese Arbeit wurde in teilweiser Erfüllung der Anforderungen für eine Promotion an der Graduate Center der City University of New York (S. Xiong) durchgeführt.
Materials
| RNAi worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Add 3 ml 1M IPTG(sterile) and 3 ml 25 mg/ml Carbenicillin(sterile); then pour into 60 mm Petri dishes. Worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 0.6 g Streptomycin Sulfate 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Pour into 60 mm Petri dishes. Worm Medium Mix 55 g Tris-Cl 24 g Tris-OH 310 g Bacto Peptone 800 mg Cholesterol 200 g NaCl Mix thoroughly and be sure to avoid chunks; this powdered mixture can be stored for many months prior to use. 2% agarose 0.5 g Agarose Add 25 ml dH2O. Heat in microwave until dissolved. 1M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 2 g IPTG Dissolve in10 ml dH2O 1M NaN3 6.5 g NaN3 Add dH2O to 100 ml 25 mM NaN3 2.5 ml 1M NaN3 Add dH2O to 100 ml Caenorhabditis elegans from Caenorhabditis Genetics Center L4440 plasmid (carries ampicillin-resistance gene) Bacteria strain HT115 (DE3) (contains IPTG inducible T7 polymerase; deficient for RNAse III gene (a dsRNAse) which also carries tetracycline-resistance gene)16 60 mm Petri dishes 100 mm Petri dishes 14 ml round-bottom Falcon culture tubes glass slides glass coverslips 1-20 μl pipettor 20-200 μl pipettor 200-1000 μl pipettor 1-200 μl pipet tips 200-1000 μl pipet tips 1.5 ml Eppendorf tubes platinum wire worm pick |
References
- Melnyk, C. W., Molnar, A., Baulcombe, D. C. Intercellular and systemic movement of RNA silencing signals. Embo J. 30, 3553-3563 (2011).
- Wall, N. R., Shi, Y. Small RNA: can RNA interference be exploited for therapy. Lancet. 362, 1401-1403 (2003).
- Kalantidis, K., Schumacher, H. T., Alexiadis, T., Helm, J. M. RNA silencing movement in plants. Biol. Cell. 100, 13-26 (2008).
- Shim, M. S., Kwon, Y. J. Efficient and targeted delivery of siRNA in vivo. Febs. J. 277, 4814-4827 (2010).
- Amarzguioui, M., Rossi, J. J., Kim, D. Approaches for chemically synthesized siRNA and vector-mediated RNAi. FEBS Lett. 579, 5974-5981 (2005).
- Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30, 313-321 (2003).
- Savage-Dunn, C., et al. Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFb pathway components. Genesis. 35, 239-247 (2003).
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
- Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).
- Wang, J., Tokarz, R., Savage-Dunn, C. The expression of TGFβ signal transducers in the hypodermis regulates body size in C. elegans. Development. 129, 4989-4998 (2002).
- Liang, J., et al. The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling. Development. 130, 6453-6464 (2003).
- Savage-Dunn, C. TGF-β signaling. WormBook. , 1-12 (2005).
- Simmer, F., et al. Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).
- Wang, D., et al. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436, 593-597 (2005).
- De Robertis, E. M. Evo-devo: variations on ancestral themes. Cell. 132, 185-195 (2008).
- Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263, 103-112 (2001).
