Summary
Vi visar hur man använder RNAi utfodring teknik för att slå ner målgener och poäng kroppsstorlek fenotyp i
Abstract
Dubbelsträngat RNA-medierad interferens (RNAi) är en effektiv strategi för att slå ner mål 1-3 genuttryck. Det har använts i många modellsystem, inklusive växter, ryggradslösa djur och ryggradsdjur. Det finns olika metoder för att uppnå RNAi in vivo 4,5. Till exempel kan målgenen omvandlas till en RNAi vektor, och sedan antingen permanent eller tillfälligt omvandlas till cellinjer eller primära celler för att uppnå effekter gen knockdown, alternativt syntetiserade dubbel tråd oligonukleotider från specifika målgener (RNAi oligos) kan tillfälligt omvandlas till cellinjer eller primära celler att tysta målgener, eller syntetiserade dubbelsträngade RNA-molekyler kan mikroinjiceras i en organism. Eftersom nematoden C. elegans använder bakterier som en näringskälla, utfodra djuren med bakterier som uttrycker dubbelsträngat RNA mot målgener ger en hållbar strategi 6. Här presenterar vi en RNAi utfodringmetod att göra mål fenotyp kroppsstorlek. Kroppsstorlek i C. elegans regleras primärt av TGF-β - liknande ligand DBL-1, så denna analys är lämplig för identifiering av TGF-β signalering komponenter 7. Vi använde olika stammar, inklusive två RNAi överkänsliga stammar att upprepa de RNAi utfodring experiment. Våra resultat visade att RRF-3-stammen gav oss den bästa förväntade RNAi fenotyp. Metoden är enkel att utföra, reproducerbar, och lätt kvantifieras. Dessutom minimerar vår protokoll att använda specialutrustning, så det är lämpligt för mindre laboratorier eller de vid övervägande grundutbildningen institutioner.
Protocol
1. Förbereda RNAi Feeding Plattor Redovisat Sequence målgen
- Om du använder kommersiellt tillgängliga RNAi-bibliotek (t.ex. från källan BioScience Lifesciences), fortsätt till steg 1,4. Alternativt klona målsekvenser gen i vektor L4440, ett vanligt mask RNAi plasmiden 8, genom vanlig kloning protokoll.
- Omvandla den rekombinanta plasmiden i bakteriestammen HT115 (DE3), kultur dem på LB-agarplattor med 25 | ig / ml karbenicillin och 12,5 pg / ml tetracyklin, och plocka en enda klon för framtida bruk.
- Samtidigt förvandla tomma vektorn L4440 i bakteriestammen HT115 att använda som en kontroll för experimenten.
- Kultur både rekombinanta och tomma L4440-bärande bakterier i 1 ml LB-buljong med 100 | ig / ml ampicillin över natten vid 37 ° C. Tetracyklin tillsätts inte på grund av det faktum att det minskar RNAi effektivitet.
- Lägga till ytterligare 5 ml LB-buljong med 100 | ig / ml ampicillin i natten kulture, inkubera under ytterligare 4-6 timmar vid 37 ° C.
- Utsäde 0,5 ml rekombinant eller tom L4440-bärande bakteriekultur på de RNAi masken plattorna. Märk alla plattor med klon namn.
- Markera plattorna och inkubera över natten vid 37 ° C för att växa bakteriemattan, som är de RNAi plattor med eller utan mål-gensekvensen. Minst 2 plattor bör göras för varje tillstånd.
2. Kultur Worms på RNAi Feeding Plattor
- Flamsterilisera spetsen på en platinatråd mask plocka. Använd masken plocka plocka 6-10 4. Larvstadiet (L4) hermafroditer varje RNAi platta som innehåller antingen rekombinanta eller tom L4440, djuren kommer att använda bakterier som en näringskälla.
- Låt hermafroditer växa vid 20 ° C (en vanlig kultur förutsättning för C. elegans) över natten, kommer de att bli unga vuxna nästa dag.
- Överför 6-10 unga vuxna i en ny motsvarande märkt och beredd RNAi plattan.
- Låtvuxna lägger ägg för 4-6 timmar, ta sedan bort alla vuxna från plattan, detta steg är att synkronisera avkomman. När mödrarna tas bort, börja räkna tid. Detta är tiden noll.
- Inkubera plattorna vid 20 ° C för att låta djuren växa till specifika utvecklingsstadier, i detta protokoll, väljer vi unga vuxna för fenotypisk analys. För knockdowns som utvecklas i normal takt, är 72 h inkubation djuren att bli unga vuxna. Emellertid olika gener påverkar djur utveckling annorlunda. Om RNAi orsakar djuren att växa i en annan takt, kan unga vuxna identifieras som de inte mer än 24 timmar tidigare L4 med avslutad vulva utveckling och 2-6 embryon i livmodern (om fertil). Att identifiera andra utvecklingsstadier, bör utredaren använda gonadal och vulva utveckling som en guide.
3. Betyg kroppsstorlek fenotyper av RNAi behandlade Worms
- Placera två skikt färgade etikett band på en glasskiva. Gör två av dese-glasskivor. Sedan placera en ny glasskiva mellan de två bilderna med tejp. Smält 2% agaros i vatten, gäller en droppe till mitten av den nya glasskivan och tryck sedan på den andra glasskiva ovanpå för att göra ett tunt lager av 2% agaros som beskrivits tidigare 9.
- När agaros stelnat, ta bort den övre glasskiva, bilden med agaros pad är redo att ladda maskar. Etikett bild med klon namn.
- Tillsätt 10 | il 25 mM NaNj 3 till agarosen dynan; plocka 30-40 djur i NaN 3 lösningen att immobilisera dem, sedan lägga täckglas på toppen, upprepa för både rekombinant och tomma L4440-bärande RNAi-behandlade djur.
- Bild maskarna enligt dissektionsmikroskop med 2.5x objektiv, här använder vi Leica digitalkamera med hjälpprogramvara Qcapture.
- För kalibrering först ta en bild av en standard mikrometer härskare. Öppna sedan bilden i Bild-Pro, klicka på "åtgärd" och välj "kalibrering" och välj sedan"Spatial kalibrering guiden". Med "kalibrera den aktiva bilden" valt, klicka på "nästa". Mata in namnet för kalibrering och se till att de rumsliga referens enheterna är inställda på mikrometer. Kontrollera sedan "Skapa en referens kalibrering"-knappen och klicka på "nästa". Klicka på "draw referenslinje." En referens skalstock visas. Flytta skalfältet att matcha ändarna av mikrometer, sedan indikera att hänvisningen anger 1.000 enheter. Klicka på "OK", "Nästa" och "Slutför".
- När programvaran är kalibrerad, öppna en mask bild. Välj sedan under "åtgärd"-menyn, välj "kalibrering" och klicka sedan på "Välj spatial". I rullgardinsmenyn väljer du filnamnet skapas för mikrometer kalibrering. Därefter, under "åtgärd"-menyn, välj "mätningar". I det fönster som öppnas, välj fritt rita verktyg och spåra en linje genom centrum av djurkroppen från huvud till svans med datormus (figur 1). Längden kommer att redovisas i fönstret. Nuhar du två grupper av data: kroppslängd av djur som behandlats med målgenen RNAi och djur kontroll som behandlats med tomma L4440 vektor.
- Exportera längdmätning till en Microsoft Excel-fil, eller annan lämplig statistisk programvara. Analysera data genom att beräkna medelvärdet och standardavvikelsen för varje prov. Sedan jämföra prover med Students t-test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I vår forskning fokuserar vi på kroppsstorlek reglering av DBL-1/TGF-β vägen. Förlusten av funktionen hos de DBL-1 metabolismvägen leder små kroppsstorlek, inklusive en kortare kroppslängd jämfört med vildtyp djur 7,10,11. Således skärmar för C. elegans kroppsstorlek mutanter har förmåga att identifiera TGF-β signalering komponenter och modifierare. DBL-1 signalering medieras av en konserverad TGF-β signaltransduktionsväg som innefattar cellytreceptorer och intracellulära Smad givare signal 12. För att testa effektiviteten av RNAi genom att mata för identifiering av mutanter kroppsstorlek, använde vi denna teknik för att slå ner DBL-1 pathway komponenter: dbl-1/ligand, sma-2, SMA-3, sma-4/Smads och sma-6/receptor. För vår studie använde vi två olika RNAi överkänslig C. elegans stammar att utföra experimentet: ERI-1, lin-15b och RRF-3 13,14. Samtidigt använde vi också N2 (STAndard vildtyp) stammen och lin-36, en komponent i lin-15 vägen vars RNAi känslighet är emellertid lik N2 13. Våra resultat (figur 2) visar att alla dessa stammar visade den korta fenotypen kroppsstorlek som förväntat (p <0,001), med undantag för SMA-6 RNAi i lin-36 bakgrund. I RRF-3 bakgrund var kroppen längder av unga vuxna efter RNAi behandling 84 ~ 95% av vektor ensam. I ERI-1, lin-15b bakgrund, kropp längder av unga vuxna efter RNAi var 68 ~ 86% av kontrolldjuren. Jämfört med lin-36 och N2-stammar, både av RNAi överkänslig stammarna RRF-3 och ERI-1, lin-15b var mer känsliga.
Figur 1. Representativa bilder av djurkroppen längd som mäts A. djur bild innan mätning.;
Figur 2. Kroppslängd av djur som DBL-1 pathway komponenter har inaktiverats av RNAi utfodring metod. RNAi djur i alla dessa bakgrunden stammar visade den korta fenotypen kroppslängd som förväntat (p <0,001), med undantag för SMA-6 RNAi i lin-36 bakgrund. RNAi i RRF-3 och ERI-1, lin-15b stammar uppvisade en starkare fenotyp än lin-36 och bakgrunder N2.
Figur 3. Schematisk dESKRIVNING att använda RNAi utfodring strategi för att screena för kandidatgener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta protokoll beskriver vi vår metod för identifiering av defekta kroppsstorlek mutanter av C. elegans by RNAi utfodring. Denna metod är lämplig för identifikation av TGF-β signalering komponenter. Eftersom sådana komponenter är högkonserverade genom evolutionen 15, sådana skärmar är relevanta att belysa de molekylära mekanismerna av TGF-β signalering i alla metazoans. Ett viktigt övervägande vid utformningen av en sådan skärm är utgångspunkten stammen. Vi har visat att både ERI-1, lin-15b och RRF-3 är mer känsliga för RNAi utfodring än kontrollgrupperna stammarna, vilket överensstämmer med tidigare studier 12,13. Men även om ERI-l, lin-15b visade den starkaste fenotypen hade djuren växer inte bra och producerade några avkomma. I en storskalig skärm, skulle vi inte ha tillräckligt med djur för att göra poäng fenotyper från denna stam. Som ett resultat, föredrar vi RRF-3-stam för att tillämpaRNAi utfodring teknik för kroppsstorleken reglering. En andra val att överväga i början stammen är om att inleda en skärm med DBL-1 vägen intakt eller att börja med en sensibiliserad stam där DBL-1 vägen antingen äventyras eller överaktiv. Dessa alternativa utgångspunkter kommer sannolikt att leda till identifiering av överlappande men distinkta uppsättningar av signalerande komponenter. Vår protokoll kan också modifieras för att studera andra postembryonic fenotyper. I detta fall kan steget av de djur som ska undersökas med avseende på fenotypen av intresse måste modifieras genom att ändra varaktigheten av tillväxten i steg 2,5. Innan inleda en storskalig skärm för andra fenotyper rekommenderar vi en pilot skärm med gener kända för att producera fenotypen av intresse, såsom vi beskriver här dbl-1, SMA-2, SMA-3 SMA-4 och SMA- 6.
Genom att använda detta protokoll, knacka ner DBL-1 pathway komponenter visade förväntade kroppslängd fenotyp. Tslang RNAi djur var cirka 68-95% i längd jämfört med en kontrollgrupp djur. I tidigare studier, DBL-1 vägen förlust av funktion genetiska mutanter i vuxen ålder är cirka 50% kortare än vildtyp djur 7,10,11. Därför gjorde RNAi utfodring tekniken presenteras här inte helt eliminera gen aktivitet. Sålunda kan metoden vara begränsad i sin förmåga att identifiera pathway komponenter som har en svag fenotyp. Samtidigt, eftersom det finns många gener som reglerar kroppens längd, gener identifierats från skärmen inte heller nödvändigtvis falla i DBL-1-vägen. Ytterligare experiment bör utföras för att placera kandidater i vägar, som är sant för någon annan skärm metod.
Sammanfattningsvis RNAi utfodring skärmar i C. elegans har visat sig användbara för att identifiera gener som är involverade i en process av intresse. I detta protokoll har vi optimerat befintliga protokoll vara mycket effektiv vid identifiering av defekter kroppsstorlek. Den optimerade protokoll kan ytterligaremodifierad för studiet av andra postembryonic fenotyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar James Clark för att ge siffror djur vid olika utvecklings tidpunkter. C. elegans stammar i denna studie erhölls från Caenorhabditis Genetics Center, som stöds av NIH National Center for Research Resources (NCRR). Detta arbete stöddes av CIRG 1817 från CUNY till JL och CSD, samt NIH 1R15GM073678-01 och 1R15GM097692-01 till CSD Vi tackar Dr William J Rice, Dr Nathalia Holtzman, och Melissa Silvestrini för kommentarer på manuskriptet. Detta arbete utfördes i delvis uppfylla kraven för doktorsexamen från Graduate Center på City University i New York (S. Xiong).
Materials
| RNAi worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Add 3 ml 1M IPTG(sterile) and 3 ml 25 mg/ml Carbenicillin(sterile); then pour into 60 mm Petri dishes. Worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 0.6 g Streptomycin Sulfate 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Pour into 60 mm Petri dishes. Worm Medium Mix 55 g Tris-Cl 24 g Tris-OH 310 g Bacto Peptone 800 mg Cholesterol 200 g NaCl Mix thoroughly and be sure to avoid chunks; this powdered mixture can be stored for many months prior to use. 2% agarose 0.5 g Agarose Add 25 ml dH2O. Heat in microwave until dissolved. 1M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 2 g IPTG Dissolve in10 ml dH2O 1M NaN3 6.5 g NaN3 Add dH2O to 100 ml 25 mM NaN3 2.5 ml 1M NaN3 Add dH2O to 100 ml Caenorhabditis elegans from Caenorhabditis Genetics Center L4440 plasmid (carries ampicillin-resistance gene) Bacteria strain HT115 (DE3) (contains IPTG inducible T7 polymerase; deficient for RNAse III gene (a dsRNAse) which also carries tetracycline-resistance gene)16 60 mm Petri dishes 100 mm Petri dishes 14 ml round-bottom Falcon culture tubes glass slides glass coverslips 1-20 μl pipettor 20-200 μl pipettor 200-1000 μl pipettor 1-200 μl pipet tips 200-1000 μl pipet tips 1.5 ml Eppendorf tubes platinum wire worm pick |
References
- Melnyk, C. W., Molnar, A., Baulcombe, D. C. Intercellular and systemic movement of RNA silencing signals. Embo J. 30, 3553-3563 (2011).
- Wall, N. R., Shi, Y. Small RNA: can RNA interference be exploited for therapy. Lancet. 362, 1401-1403 (2003).
- Kalantidis, K., Schumacher, H. T., Alexiadis, T., Helm, J. M. RNA silencing movement in plants. Biol. Cell. 100, 13-26 (2008).
- Shim, M. S., Kwon, Y. J. Efficient and targeted delivery of siRNA in vivo. Febs. J. 277, 4814-4827 (2010).
- Amarzguioui, M., Rossi, J. J., Kim, D. Approaches for chemically synthesized siRNA and vector-mediated RNAi. FEBS Lett. 579, 5974-5981 (2005).
- Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30, 313-321 (2003).
- Savage-Dunn, C., et al. Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFb pathway components. Genesis. 35, 239-247 (2003).
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
- Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).
- Wang, J., Tokarz, R., Savage-Dunn, C. The expression of TGFβ signal transducers in the hypodermis regulates body size in C. elegans. Development. 129, 4989-4998 (2002).
- Liang, J., et al. The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling. Development. 130, 6453-6464 (2003).
- Savage-Dunn, C. TGF-β signaling. WormBook. , 1-12 (2005).
- Simmer, F., et al. Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).
- Wang, D., et al. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436, 593-597 (2005).
- De Robertis, E. M. Evo-devo: variations on ancestral themes. Cell. 132, 185-195 (2008).
- Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263, 103-112 (2001).
