血管内灌注的碳黑色墨水可实现可靠的可视化脑血管

Summary

分析啮齿类动物的脑解剖实验中风研究中起着重要的作用。在这方面，一直被认为是血管内灌注有色乳胶作为标准工具数年。然而，这种技术意味着不同的技术限制，破坏了它的可重复性。在这里，我们将介绍一个简单的方法来可视化脑血管在一个可重复的方式。注射液的混合物的两种市售碳黑色油墨通过在足够的填充具有高对比度的可视化的脑血管的左心肌心室结果。我们已经成功地应用这种技术来识别不同的遗传背景的小鼠脑血管领土之间的吻合点。最后，我们提供的证据表明，这种新的和简单的方法，容器染色可与氯化三苯基四氮唑（TTC）染色 - 一种广泛使用的工具，来观察和分析小鼠梗死体积。

Abstract

脑血管的解剖结构的一个重要因素就是对大脑血流动力学以及对缺血损伤的严重程度。脑血管系统动态响应各种病理生理状态与株之间的遗传操作的情况下，它表现出相当大的差异。从本质上讲，一个可靠的颅内血管染色技术研究缺血性中风的发病机制是必不可少的。直到最近，一组不同的技术已被用于可视化的脑血管包括注射低粘度树脂，ARALDITE F，明胶与各种染料^1（ 即胭脂红，印度墨水）或胶乳与²或无³炭黑混合。白乳胶化合物通过升主动脉灌注已报道由科伊尔和Jokelainen ^3。 Maeda 等人 ²已修改的协议通过添加碳氮化Ň黑色墨盐水灌注后的大脑血管的对比度提高的可视化的胶乳化合物。然而，低效的灌注和船只填充不足经常经历由于高粘度胶乳化合物^4。因此，我们已经描述了一个简单的和成本有效的技术，使用的混合物的两种市售碳黑色墨水（CB1和CB2）可视化的脑血管在可重复的方式^5。我们已经表明，灌注与CB1 + CB2在小鼠的结果，在胶乳灌注⁵相比在更高的密度的显着较小的脑血管染色。在这里，我们描述的协议来识别之间的吻合点前（ACA）和大脑中动脉（MCA），研究不同遗传背景的小鼠的血管变化。最后，我们证明了我们的技术可行性相结合，在局灶性脑缺血小鼠模型中CB1 +CB2-介导的血管染色与TTC染色不同程度的缺血性损伤。

Protocol

1。动物

1. 根据美国国立卫生研究院的保养和使用实验动物的指导方针进行了实验和地方当局的批准。对于所有的实验中，C57BL6 / J野生型小鼠，载脂蛋白^{- / -} （ApoE基因KO）和SV129小鼠（12-16周龄，体重26-30克，每实验组5-6动物）。

2。彩色乳胶脑血管染色

1. 准备为25μl炭黑油墨（茨博士，德国）的混合物用0.5毫升的胶乳化合物（贝碧欧，法国）以1:20的比例在EP管，并在水浴中，将混合物在37℃下预热。收藏报错在2 ml注射器的混合物与28-30G的针前麻醉动物。
2. 溶解50毫克到1毫升无菌生理盐水的papavarine盐酸盐粉末。收集的溶液中的胰岛素注射器。从另一个无菌胰岛素注射器的针折断。这种针放置在端部的的20米长的PE10管。立即附加此PE10管上的针的胰岛素注射器含有papavarine盐酸盐溶液被注入，以确保通过股静脉血管舒张和适当的填补船只。
3. 准备另外两个胰岛素注射器各含1毫升的生理盐水。胰岛素注射器的注射液可以顺利交付的准确位置。然而，由于高粘度的乳液，另一种可移动的更广泛的针1毫升注射器应该被使用。
4. 以所有的注射器和消毒解剖仪器靠近的操作阶段。传播的手术的布店表周围的操作阶段。的操作阶段，应充分地照射，如有必要，也可以使用在手术显微镜。
5. 立即测量C57BL6 / J小鼠的体重，然后用5％的汽化在70％N _{2 O}和O _2的 30％的异氟烷诱导麻醉。继续用1％的蒸发，异氟醚麻醉。经过适当的positionin克鼠标在它的背部和四肢固定的，评估麻醉深度。然后在左侧股静脉切开皮肤，找到静脉。插入针的尖锐的尖端放在PE10管，并在100微升（每分钟）（50毫克/公斤体重）的速率缓慢​​注入papavarine盐酸盐溶液。
6. 在注射之后，切断的腹腔和刺穿隔膜。切肋骨，暴露心脏，而不会损坏或瘀伤。夹胸降主动脉的动脉钳。车型右心房的大幅削减超过允许静脉血排出。进入左心室注入2毫升盐水，随后通过手动有轻微压力超过18-20秒注入着色胶乳。使用预充式注射器此起彼伏。避免注入任何气泡。
7. 注射后的乳胶，动物离开5分钟。杀头的动物，小心地取出整个大脑。照顾好，不要伤到血管构筑和科尔特X，而去除颅骨和脑膜。将大脑中的一个60毫米的细胞培养皿中含有6-8毫升的4％PFA拍摄照片。将测量标尺下透明的菜。以25倍的放大倍数在手术显微镜摄像头的背侧和腹侧脑组织表面的照片。应采取照片之间的陪替氏培养皿和显微镜的物镜，在90°角，以量化的原始距离。
8. 重复该过程在另一个4-5动物。

3。脑血管染色的碳黑色墨水的混合物

1. 要比较的结果与我们的协议的的胶乳基于脑血管染色，用900μl的鹈鹕Scribtol施瓦茨墨水（CB2）在1.5ml EP管中制备的混合物中加入100μl，茨博士Stempelfarbe墨（CB1）。准备两个EP管中，使总体积为2毫升CB1和CB2的混合物按1:9的比例。在两个单独的胰岛素注射器（1收集混合物毫升）。盖上注射器，并将其放置在水浴中预热至37℃。收藏2毫升的生理盐水另外两个胰岛素注射器，并将其放置在水浴中。
2. 麻醉动物，并重复相同的过程，除了注射papavarine盐酸如上所述。继左心室注射2毫升salaine，注入2毫升的混合物的碳黑色墨水，而不是着色胶乳。执行注射每毫升超过18-20秒的手有轻微的压力。夹胸降主动脉去打针之前。
3. 牺牲的动物，消除大脑和拍照。
4. 对于长期保存的大脑，把大脑中的4％PFA过夜，然后逐渐增加浓度的蔗糖培养，直到浮动的大脑完全淹没（5％，15％和30％）。有色乳胶灌注的动物的大脑也可以以同样的方式被保留。
5. 执行4-5动物的过程中。比较差异脑血管解剖，由于不同遗传背景或品系，重复的协议，在同等数量的ApoE KO和SV129小鼠，分别。
6. 研究缺血条件下的血管解剖，引起局灶性脑缺血45分钟或90分钟，根据腔内阻塞的MCA深麻醉下（在手术的详细描述超出了本文的范围，是一个标准的协议;读者可以参考Doeppner等人，2011）。在再灌注期间的末尾计划（1天或5天，），执行血管染色CB1 + CB2油墨只与和染色全脑，用2％TTC溶液，在37℃下为5-10分钟，以确定梗死体积。由线粒体酶（特别是琥珀酸脱氢酶），TTC减少到红色的有色的甲。 TTC染色后，污渍深红色的代谢活跃的组织，而心肌梗死的组织仍然unstai的非执行董事，并出现白色的，由于功能失调，变性线粒体酶。在如上所述的相同的方式收集的图像。

4。研究脑血管新界的

1. 要分析的大体解剖脑血管，图像的大脑背表面任何沾上了颜色的乳液或CB1和CB2油墨可以分析ImageJ软件（基于Java的公共领域，用于图像处理和分析软件）。脑灌注彩色乳胶可能会出现不同程度的血管染色位于背表面上，，而CB1 + CB2灌注染色腹侧和背侧表面上的所有船只。
2. ImageJ软件中打开图像文件。确定所有的ACA和MCA之间的吻合点。的吻合血管直径的部位是最窄的或最近的分支点的ACA和MCA分支之间的一半距离，分别为^2的点被定义为。
3. 设置规模在毫米。测量的吻合线之间的距离，和在4毫米，尾鳍使用直线绘图工具和“测量”工具的大脑额极的中线。做同样的尾部从额极，6毫米。分析3-4每只动物的图像，并计算平均值。不同种类的动物之间的比较值，，识别脑血管解剖结构的变化。在C57BL6 / J的动物，ACA和MCA之间的吻合线可以追溯更接近中线在4毫米超过6毫米，尾端从额极。载脂蛋白E基因敲除小鼠在这方面不存在显着的差异。与此相反，在SV129小鼠的吻合线将在于进一步的和平行的中​​线在4毫米和6毫米尾端从正面极。
4. 要分析的血管解剖我Ň缺血的条件下，进行上述同样的计算。确定梗死边框的红色和白色代表代谢活跃的组织和未染色的组织坏死的组织保证金。测量的距离在4毫米和6毫米的尾鳍从额极的大脑从中线梗死边界。收集平均值动物图像，每3-4。不同缺血再灌注期间的结果进行比较。

Representative Results

这里所描述的协议，克服了技术上的限制，传统的乳胶的可视化啮齿类动物的脑血管。 图1A表明，以下的彩色乳胶灌注，大血管的腹侧表面有污渍，使整个背表面不染。的结果也充满变数。只有一个动物，满分6示出在ACA和MCA大脑（数据未示出）的背表面上可见的部分染色。相反，CB1 +的CB2灌注结果以平等的方式（ 图1B）的小型和大型船舶在充分填充。染色是稳定的，直到7天无任何质量变化。我们已量化使用ImageJ的计划，ACA和MCA的吻合点之间的距离，从中线野生型C57BL6 / J小鼠（ 图1C）。我们比较这些值与ApoE KO小鼠，以观察是否遗传修正性有任何影响区域的血管解剖（ 图1D）。的ApoE基因敲虽然不影响C57BL6 / J小鼠在脑血管的解剖结构，C57BL/6J和SV129株（ 图1E，F）之间有显着性差异。因此，我们能够证明这种染色协议的可行性评估的脑血管由于遗传或品系小鼠中的差异，在解剖学上的差异。

在实验啮齿动物中风模型中被广泛使​​用，TTC染色观察脑梗死体积。同时脑血管和脑梗死体积的可视化让我们有机会来分析缺血再灌注损伤后的形态变化。因此，我们已经验证是否不CB1 + CB2介导的的血管染色是稳定的与TTC染色中不同程度的缺血再灌注损伤（ 图2A-H）。我们进一步分析了吻合口点之间的ACA和MCA后45分钟或90分钟的缺血是1天或5天，再灌注期间（ 图I，J）相匹配。正如预期的那样，中线和吻合口点之间的平均距离没有表现出显着的组间差异（ 图2I，J），并在同一范围内与非缺血性动物（ 图1F）。然而，从中线到梗死边界的距离差异显着，反映了更高程度的缺血-再灌注损伤（ 图2K，L）的增加的梗死体积。这些数据表明，CB1 + CB2染色可以在动物TTC染色结合时进行不同程度的缺血 - 再灌注损伤和稳定的染色再现。

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图1。与遗传和应变差异小鼠的脑血管解剖观察图1A示出了仅有色乳胶污渍的腹面上的大血管，血管内灌注，而背侧表面保持不染。相反，CB1 + CB2灌注永久染色结果在小型和大型船舶的腹侧和背侧表面的大脑（ 图1B）。量化的吻合点之间的距离，大脑前动脉（ACA），大脑中动脉（MCA）从中线野生型C57BL6 / J小鼠（ 图1C），表明没有差异与基因突变的载脂蛋白E KO同行（ 图1D）。然而，显着不同的是注意到C57BL6 / J和SV129株（图1E，F）之间。比例尺= 2毫米。 *显着不同，同时从C57BL6 / J野生型的和ApoE基因敲除小鼠在4毫米，P ，P <0.01。

图2。缺血性脑血管解剖分析。图2A-H显示图像的大脑的腹侧和背侧表面进行到45分钟或90分钟缺血后1天或5天再灌注时间。左边的面板显示CB1 + CB2介导的血管染色，而右边的面板显示血管染色和TTC染色的组合，表示血管染色在不同程度的缺血-再灌注损伤（ 图2A-H）的稳定性。之间的前脑动脉（ACA）和后45分钟或90分钟，1天或5天再灌注期间德匹配缺血的大脑中动脉（MCA）的吻合点分析皮克特没有显着的组间差异（ 图2I，J）。然而，重要的差异可以在梗死边界从中线的距离另外，更高程度的缺血-再灌注损伤（ 图2K，L）表示增加的梗塞体积。比例尺= 2毫米。 *显着不同，45分钟缺血1天再灌注，P <0.05，** 5天再灌注，P <0.01。 点击这里查看大图 。

Discussion

CB1 + CB2通过人工注射灌注成功地进行了不密集的训练，因为它不涉及任何特定的设备意味着一定的压力^2,3。灌注在我们的协议结果的异质性也可以忽略不计。动物的16个非缺血性的动物只有1和3 20缺血性动物显示不完整的灌注。在这种情况下，将泡在盐水灌注导致血管闭塞是最有可能的原因不成功的结果。

虽然灌注胶乳原本进行通过升主动脉^2,3，替代路线的灌注也报道包括左心室^7,8或常见的颈动脉^9。我们没有发现显着差异的结果后，灌注通过升主动脉或左心室（未发表意见）。因此，后者是选择因为它更容易的辅助功能。

选择本研究中提到的特定的碳黑色墨水之前，我们已经评估的结果与市售碳黑色墨水的范围内的血管内灌注。 CB1和CB2选择为他们的灌注染色的效率和稳定性。 CB1具有非常低的粘度（1.1毫帕/秒），其中包含2.1％的碳黑，而CB2 - 最初作为书法油墨制造 - 含有2.5％的炭黑具有较高的粘度（10-50毫帕/秒）。这些油墨的单独的应用程序已被发现关于染色效率和稳定性的不足。因此，我们已经结合了的油墨，和滴定的组合比率。灌注与CB1 CB2永久染色的大型和小型船只在1:9的比例。因此，动脉吻合点，可以很容易地追溯到定义， 即两个血管地区之间的交界处。 ACA和MCA。这些F与以前的报告^2,10,11 indings是一致的。

载脂蛋白E基因敲除小鼠呈现高5-8倍，血浆胆固醇水平和富含胆固醇的饮食¹²时，动脉粥样硬化发展是高度敏感的。是否遗传修饰也影响脑血管解剖尚未见报道。另一方面，已经报道SV129小鼠相比C57BL6 / J小鼠由于其不同的血管解剖²呈现较大的梗死体积。我们验证了我们的协议在这三组动物比较不同的血管解剖。

为了验证缺血性脑染色协议，涉及局灶性脑缺血再灌注的影响，包括以前的研究，主要集中在永久性闭塞MCA ^{2-4，10,13。}正如预期的那样，我们没有发现任何显着的差异模式的L国家统计局C57BL6 / J小鼠缺血再灌注后不同时期的吻合。没有缺血性和非缺血性脑半球之间的血管直径的变化进行了观察，据推测，这些变化发生在再灌注时间较长， 即 2-3周后中风^14。最后，我们证明了的协议是一个不太复杂的，成本有效的技术，它可以很容易地再现相比传统的胶乳基灌注脑血管可视化。它可以被视为一个有效的工具来分析大体解剖脑血管和血管在不同的生理和病理条件下的领土。 TTC染色这项技术的结合提供了一个新的机会，确定的背景下，在大脑中的血管供应区的缺血性损伤的程度。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Scribtol Schwarz (CB2)	Pelican, Germany	221 135
Stempelfarbe (CB1)	Herlitz PBS AG, Germany	10417202
Gedeo Latex	Pebeo, France	13042B