Intravaskulær Perfusion af Carbon Black Ink tillader pålidelig Visualisering af cerebrale kar

Summary

Analyse af gnaver cerebrovaskulær anatomi spiller en vigtig rolle i eksperimentel slagtilfælde forskning. I den forbindelse har intravaskulær perfusion med farvet latex blevet betragtet som et standardværktøj i flere år. Men denne teknik indebærer forskellige tekniske begrænsninger, som underminerer dens reproducerbarhed. Her beskriver vi en simpel metode til at synliggøre cerebrale kar på en reproducerbar måde. Injektion af en blanding af to kommercielt tilgængelige carbon sort blæk gennem venstre ventrikel myocardiale resulterer i tilstrækkelig fyldning af cerebrale kar med høj kontrast visualisering. Vi har nu anvendt denne teknik til at identificere anastomotiske punkter mellem cerebrale vaskulære områder i mus med forskellige genetiske baggrunde. Vi endelig at bevise, at denne hidtil ukendte og enkel fremgangsmåde til fartøjets farvning kan kombineres med triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)-farvning - en meget anvendt værktøj til at observere og analysere infarktvolumener i mus.

Abstract

Den anatomiske struktur af cerebrale kar er afgørende for hjernen hæmodynamikken og sværhedsgraden af ​​skade efter iskæmiske angreb. Den cerebrale vaskulatur dynamisk reagerer på forskellige patofysiologiske tilstande, og det udviser betydelige forskelle mellem stammer og under betingelser med genetiske manipulationer. Væsentlige en pålidelig teknik til intrakraniel fartøj farvning er vigtig for at studere patogenesen af ​​iskæmisk slagtilfælde. Indtil for nylig har en række forskellige teknikker blevet anvendt til at visualisere den cerebrale vaskulatur herunder injektion af lav viskositet harpiks, Araldite F, gelatine blandet med forskellige farvestoffer ¹ (dvs. Karminrød, India blæk) eller latex med ² eller uden ³ kønrøg. Perfusion af hvid latexblanding gennem aorta ascendens først er blevet rapporteret af Coyle og Jokelainen ^3. Maeda et al. ² har ændret protokollen ved at tilsætte carbon sort blæk til latexen forbindelse til forbedret kontrast visualisering af fartøjer efter saltvand perfusion af hjernen. Imidlertid ineffektive perfusion og utilstrækkelig fyldning af beholderne ofte opleves på grund af høj viskositet af latex forbindelse ^4. Derfor har vi beskrevet en enkel og omkostningseffektiv teknik under anvendelse af en blanding af to kommercielt tilgængelige carbon sort blæk (CB1 og CB2) at visualisere den cerebrale vaskulatur på en reproducerbar måde ^5. Vi har vist, at perfusion med CB1 + CB2 i mus resulterer i farvning af betydeligt mindre cerebrale kar ved en højere tæthed i forhold til latex perfusion ^5. Her beskriver vi vores protokol til at identificere de anastomotiske steder mellem den forreste (ACA) og midterste cerebrale arterier (MCA) at studere fartøjets variationer i mus med forskellige genetiske baggrunde. Endelig vil vi påvise, at vor teknik i en transient fokal cerebral iskæmi-model i mus ved at kombinere CB1 +CB2-medieret fartøj farvning med TTC-farvning i forskellige grader af iskæmiske skader.

Protocol

1. Dyr

1. Eksperimenter blev udført i overensstemmelse med NIH retningslinier for pasning og anvendelse af laboratoriedyr og godkendt af de lokale myndigheder. For alle eksperimenter, vildtypemus, ApolipoproteinE C57BL6 / J ^{- / -} (ApoE KO) og SV129 mus (12-16 uger gamle, 26-30 g legemsvægt, 5-6 dyr per forsøgsgruppe) blev anvendt.

2. Farvning af cerebrale kar med farvet latex

1. Der fremstilles en blanding af 25 ul carbon sort blæk (Herlitz, Tyskland) med 0,5 ml latexblanding (Pebeo, Frankrig) i et 1:20-forhold i en EP-rør og opvarme blandingen ved 37 ° C i et vandbad. Opsaml blandingen i en 2 ml sprøjte med en nål på 28-30G, før bedøve dyret.
2. Opløs 50 mg papavarine hydrochlorid-pulver i 1 ml sterilt normalt saltvand. Opsaml opløsningen i en insulinsprøjte. Bræk nålen fra en anden steril insulinsprøjte. Placere denne nålen ved afslutningen af ​​en 20 cm lang PE10 rør. Nu vedhæfte denne PE10 rør på nålen af ​​insulinsprøjte indeholdende papavarine hydrochloridopløsning, der skal injiceres gennem den femorale vene for at sikre vasodilatation og korrekt fyldning af fartøjer.
3. Udarbejde yderligere to insulinsprøjter hver indeholder 1 ml saltvand. Insulinsprøjter tillader jævn levering af det injicerede fluidum ved en præcis placering. Imidlertid bør på grund af høj viskositet latex, alternative 1 ml injektionssprøjter med aftagelige bredere nåle anvendes.
4. Tag alle de sprøjter og steriliserede dissekere instrumenter tæt på driftsfasen. Sprede en kirurgisk Draper ark rundt om operationstrin. Operationen fase bør være tilstrækkeligt belyst, og et operationsmikroskop kan anvendes, hvis nødvendigt.
5. Nu måle kropsvægt af en C57BL6 / J mus og derefter inducere anæstesi med 5% fordampes isofluran i 70% _N2O og _30% O2. Fortsat anæstesi med 1% af fordampet isofluran. Efter grundig POSITIONSBg af musen på ryggen og fiksering af benene, vurdere dybden af ​​bedøvelse. Derefter skæres huden over den venstre lårvene og finde venen. Sæt skarpe spids af nålen anbragt på PE10 rør og langsomt injicere papavarine hydrochloridopløsning med en hastighed på 100 pi pr min (50 mg / kg legemsvægt).
6. Efter injektionen, bughulen og gennembore membranen skæres. Skær ribbenene for at blotlægge hjertet uden at beskadige eller blå mærker det. Klip den nedadgående thorakalaorta med en arterie pincet. Foretage en skarp snit i højre atrium for at tillade venøse blod løbe ud. Injiceres 2 ml saltvand i den venstre ventrikel, efterfulgt af injektion af farvet latex manuelt med et let tryk i 18 til 20 sek. Anvende de fyldte injektionssprøjter efter hinanden. Undgå injektion eventuelle bobler.
7. Efter injektion af latex, dyret forlade for 5 min. Halshugge dyret og forsigtigt fjerne hele hjernen. Pas godt på ikke at skade skibet arkitektur og cortex og samtidig fjerne kraniet og meninges. Placer hjernen i en 60 mm cellekultur skål med 6-8 ml 4% PFA at tage et billede. Placer en måling lineal under den gennemsigtige skål. Tag billeder på en 25x forstørrelse af den dorsale og den ventrale overflade af hjernen med et kamera fastgjort til operationsmikroskopet. Billeder bør tages ved 90 ° vinkel mellem petriskål og mikroskopet mål for at kvantificere den oprindelige afstand.
8. Gentag proceduren i endnu 4-5 dyr.

3. Farvning af cerebrale kar med blanding af carbonsort blæk

1. At sammenligne resultatet af latexbaseret cerebral vaskulær farvning med vores protokol, fremstille en blanding af 100 gl Herlitz Stempelfarbe blæk (CB1) med 900 ul Pelican Scribtol Schwarz blæk (CB2) i et 1,5 ml EP rør. Fremstille to EP rør til opnåelse af et totalvolumen på 2 ml blanding af CB1 og CB2 i et 01:09-forhold. Opsaml blandingen i to separate insulinsprøjter (1ml hver). Cap sprøjterne og læg dem i et vandbad for at varme op til 37 ° C. Indsaml 2 ml saltvand i yderligere to insulinsprøjter, og læg dem i et vandbad så godt.
2. Bedøve dyret og gentage den samme fremgangsmåde som beskrevet ovenfor bortset fra injektion af papavarine hydrochlorid. Efter injektion af 2 ml salaine i den venstre ventrikel, en 2 ml blanding af carbon black blæk i stedet for den farvede latex injicere. Udfør injektioner i hånden med let tryk over 18-20 sek per ml. Klem nedadgående thorakalaorta før injektionerne.
3. Sacrifice dyret, fjern hjernen og tage billeder.
4. For langtidsbevaring af hjernen, sætte hjernen i 4% PFA natten over efterfulgt af inkubering med saccharose med gradvist stigende koncentration indtil den flydende hjerne dykker fuldstændig (5% efterfulgt af 15% og derpå 30%). Hjernen hos dyrene perfuseret med den farvede latex kan også opbevares på samme måde.
5. UdførProceduren i endnu 4-5 dyr. At sammenligne forskellen i cerebral vaskulær anatomi grund af forskellige genetiske baggrund eller stammer, gentages protokollen i lige stort antal ApoE KO og SV129 mus hhv.
6. At studere den vaskulære anatomi under iskæmiske tilstande, inducere transient fokal cerebral iskæmi i 45 min eller 90 min efter en standardprotokol af intraluminal okklusion af MCA under dyb anæstesi (en detaljeret beskrivelse af operationen er uden for rammerne af denne artikel; den henvises læseren til Doeppner et al. 2010). Ved afslutningen af ​​reperfusionsperioden planlagte (1 dag eller 5 dage), udfører det vaskulære farvning med CB1 + CB2 trykfarver alene og plette hele hjernen med 2% TTC opløsning ved 37 ° C i 5-10 minutter for at identificere infarktvolumen . TTC er reduceret til rødt farvet formazan ved mitochondrielle enzymer (især succinatdehydrogenase). Efter TTC-farvning, mens metabolisk aktive væv pletter dyb rød infarcted væv forbliver unstaineret og ser hvid ud på grund af dysfunktionelle og denatureret mitochondrial enzym. Indsamle billeder på samme måde som beskrevet ovenfor.

4. Undersøgelse af cerebral vaskulær områder

1. For at analysere grov anatomi cerebrale kar, billeder af den dorsale overflade af hjernen enten farvet med farvet latex eller CB1 + CB2 trykfarver kan analyseres med ImageJ software (en Java baseret offentlig domæne software til billedbehandling og analyse). Brains perfunderet med farvet latex kan udvise variable grader af fartøjets farvning placeret på den dorsale overflade, mens CB1 + CB2 perfusion farver alle de fartøjer på både de ventrale og dorsale overflader.
2. Åbn en billedfil med ImageJ software. Identificer alle de anastomotiske point mellem ACA og MCA. Et anastomotisk er defineret som det sted, hvor fartøjet diameter er den smalleste eller den halve afstand mellem de nærmeste forgreningspunkter i ACA-og MCA-grene, henholdsvis ^2.
3. Indstil skalaen i mm. Mål afstanden mellem det anastomotiske linje og midterlinjen på 4 mm caudalt til frontalt pol af hjernen ved hjælp af rette linje tegneværktøj og "mål" værktøj. Gør det samme ved 6 mm caudalt fra det frontale pol. Analyser 3-4 billeder pr dyr og beregne det gennemsnitlige værdi. Sammenligne værdierne mellem forskellige grupper af dyr at identificere variation af cerebrovaskulær anatomi. I C57BL6 / J dyr, kan det anastomotiske linje mellem ACA og MCA spores tættere på midterlinjen på 4 mm end ved 6 mm caudalt fra den forreste pol. ApoE KO mus vil udgøre nogen væsentlig forskel i denne henseende. Tværtimod det anastomotiske linie i SV129 mus vil ligge yderligere og parallelt med midterlinjen både på 4 mm og 6 mm caudalt fra den forreste pol.
4. For at analysere den vaskulære anatomi in iskæmiske tilstande, udføre de samme beregninger som nævnt ovenfor. Identificer infarkt grænse som den røde og hvide farvet væv margin repræsenterer metabolisk aktive væv og nekrotisk ufarvet væv, hhv. Måle afstanden af ​​infarkt kant fra midterlinien på 4 mm og 6 mm caudalt fra den forreste pol af hjernen. Saml middelværdien 3 til 4 billeder pr dyr. Sammenlign resultaterne mellem forskellige iskæmi og reperfusion perioder.

Representative Results

Protokollen beskrevet her overvinder de tekniske begrænsninger ved konventionelle latexbaseret visualisering af gnaver cerebrale vaskulatur. Figur 1A viser, at der efter perfusion af farvet latex, kun de store kar på den ventrale overflade er farves, så hele den dorsale overflade ufarvet. Resultatet er også meget variabel. Kun et dyr ud af seks viser delvis farvning af ACA-og MCA synlig på den dorsale overflade af hjernen (data ikke vist). Omvendt CB1 + CB2 perfusion resulterer i tilstrækkelig fyldning af både små og store fartøjer i lige måde (figur 1B). Farvningen er stabil indtil 7 dage uden nogen ændring af kvaliteten. Ved hjælp ImageJ programmet har vi kvantificeret afstanden af de anastomotiske steder mellem ACA-og MCA fra midterlinjen i vildtype C57BL6 / J mus (figur 1C). Vi sammenlignede disse værdier med ApoE KO-mus for at observere, om den genetiske ÆNDRINGpå haft nogen effekt på den regionale vaskulære anatomi (Figur 1D). Selv banke ud af ApoE ikke påvirkede den anatomiske struktur af de cerebrale kar i C57BL6 / J mus sås en signifikant forskel bemærket mellem C57BL/6J og SV129 stammer (Figur 1E, F). Således er vi i stand til at demonstrere gennemførligheden af ​​denne farvningsprotokol at evaluere de anatomiske forskelle i det cerebrale kar som følge af genetiske eller stamme forskelle i mus.

I eksperimentelle gnavermodeller takts modeller er TTC-farvning vid udstrækning til at observere infarkt volumen. Samtidig visualisering af cerebrale kar og infarkt volumen giver os mulighed for at analysere morfologiske ændringer efter iskæmi-reperfusion. Derfor har vi konstateret, om CB1 + CB2-medieret vaskulær farvning var stabil med TTC-farvning i forskellige grader af iskæmisk-reperfusionsskader (figur 2A-H). Vi har yderligere analyseret anastomotiske punkter mellem ACA-og MCA efter 45 min eller 90 min med iskæmi matches med enten 1 dag eller 5 dage reperfusion perioder (fig. I, J). Som forventet er den gennemsnitlige afstand mellem midterlinjen og det anastomotiske punkter viste ingen signifikant forskel mellem grupperne (figur 2I, J) og var i det samme område med ikke-iskæmiske dyr (figur 1F). Imidlertid er afstanden fra midterlinien til infarkt kant varierede signifikant, hvilket afspejler den forøgede infarkt volumen med højere grad af iskæmi-reperfusionsskade (figur 2K, L). Disse data viser, at CB1 + CB2 farvning kan gengives i de dyr, der udsættes for forskellige grader af iskæmi-reperfusionsskade og stabiliteten af ​​farvningen, når det kombineres med TTC-farvning.

374/4374fig1.jpg "/>
Figur 1. Observation af cerebral vaskulær anatomi hos mus med genetiske og stamme forskelle. Figur 1A viser, at intravaskulær perfusion af farvede latex kun pletter store skibe i den ventrale overflade, medens den dorsale overflade forbliver ufarvede. Omvendt CB1 + CB2 perfusion resulterer i permanent farvning af både store og små fartøjer på ventrale og dorsale overflader af hjernen (figur 1 B). Kvantificering af afstanden af de anastomotiske steder mellem den anteriore cerebrale arterie (ACA), og den midterste cerebrale arterie (MCA) fra midterlinien i vildtype C57BL6 / J mus (figur 1C) viser ingen forskel med deres genetisk mutant ApoE KO modstykker (figur 1D). Imidlertid signifikant forskel bemærket mellem C57BL6 / J og SV129 stammer (figur 1E, F). Scale bar = 2 mm. * Signifikant forskellig fra både C57BL6 / J vildtype og ApoE KO mus på 4mm, s. p <0,01.

Figur 2. Analyse af vaskulære anatomi i iskæmiske hjerner. Figur 2A-H viser billeder af de ventrale og dorsale overflade af hjernen udsættes for 45 min eller 90 min iskæmi efterfulgt af 1 dag eller 5 dage reperfusion tid. Det venstre panel viser CB1 + CB2 medieret vaskulær farvning, medens det højre panel viser kombination af både den vaskulære farvning og TTC-farvning, hvilket indikerer stabilitet af det vaskulære farvning i forskellige grader af iskæmisk-reperfusionsskader (figur 2A-H). Analyse af de anastomotiske steder mellem den anteriore cerebrale arterie (ACA), og den midterste cerebrale arterie (MCA) efter 45 min eller 90 min iskæmi matches med enten 1 dag eller 5 dage reperfusionsperioden dePikterne ingen signifikant forskel mellem grupperne (figur 2I, J). Imidlertid kan signifikant forskel bemærkes i afstanden fra midterlinien til infarkt grænse, indikerer forøgelsen af infarkt volumen med højere grad af iskæmi-reperfusionsskade (figur 2K, L). Scale bar = 2 mm. * Signifikant forskellig fra den 45 min iskæmi med 1 dag reperfusion, p <0,05, og ** 5 dage reperfusion, p <0,01. Klik her for at se større figur .

Discussion

Perfusion af CB1 + CB2 ved manuel indsprøjtning kan udføres med succes af uden intensiv træning, da den ikke indebærer nogen specifik enhed til at indebære vist pres ^2,3. De forskelligartede perfusion resultater i vores protokol er også ubetydelig. Kun 1 dyr ud af 16 ikke-iskæmiske dyr og 3 ud af 20 iskæmiske dyr har viste ufuldstændig perfusion. I disse tilfælde var inkorporering af bobler under saltvand perfusion fører til okklusion af fartøjer mest sandsynligt på grund af den negative udfald.

Selv om perfusion af latex oprindeligt er blevet udført gennem opstigende aorta ^2,3, er alternative veje til perfusion også rapporteret herunder den venstre ventrikel ^7,8 eller den fælles carotidarterie ^9. Vi fandt ingen signifikant forskel i resultaterne efter perfusion gennem enten den opadgående aorta eller den venstre ventrikel (upublicerede observationer). Som sådan var det sidstnævntevalgt på grund af dets lette tilgængelighed.

Før du vælger de specifikke carbon sort blæk, der er nævnt i denne undersøgelse, har vi evalueret resultaterne af intravaskulær perfusion med en række kommercielt tilgængelige carbon black blæk. CB1 og CB2 er udvalgt for deres perfusion effektivitet og stabilitet i farvning. CB1 har en meget lav viskositet (1,1 mPa / sek) indeholdende 2,1% kønrøg, mens CB2 - oprindeligt fremstillet som en kalligrafiblæk - indeholder 2,5% kønrøg med en højere viskositet (10-50 mPa / s). Individuel anvendelse af disse trykfarver er blevet fundet utilstrækkelige med hensyn til både effektivitet og stabilitet af farvning. Derfor har vi kombineret blæk og titreres kombinationen nøgletal. Perfusion med CB1: CB2 på en 1:9-forhold resulterer i permanent farvning af både store og små skibe. Derfor kan arterielle anastomotiske point let spores til at definere forbindelsen mellem to vaskulære områder, dvs. ACA og MCA. Disse findings er i overensstemmelse med tidligere rapporter ^2,10,11.

ApoE KO-mus udgør 5-8 gange højere plasma cholesterol niveau og er stærkt modtagelige for udvikling af atherosklerose, når de sættes på cholesterol rig diæt ^12. Om den genetiske modifikation påvirker også anatomi cerebrale kar er ikke blevet rapporteret endnu. På den anden side er SV129 mus allerede rapporteret at præsentere større infarkt volumen i forhold til C57BL6 / J mus på grund af deres forskellige vaskulære anatomi ^2. Vi bekræftet vores protokol i disse tre grupper af dyr for at sammenligne forskellen i vaskulære anatomi.

For at validere farvningsprotokol i iskæmiske hjerner, vi er involveret transient fokal cerebral iskæmi at omfatte effekter af reperfusion i modsætning til tidligere undersøgelser, som primært fokuserede på permanent okklusion af MCA ^{2-4, 10,13.} Som forventet, vi ikke observere nogen signifikante forskelle i mønstret for line af anastomose efter forskellige iskæmiske og reperfusion perioder i C57BL6 / J mus. Ingen ændringer i fartøjernes diametre mellem iskæmiske og ikke-iskæmiske hemisfærer blev observeret, formodentlig sådanne ændringer forekommer ved længere reperfusion gange, dvs 2-3 uger efter slagtilfælde ^14. Som konklusion er den protokol påvist af os en mindre kompliceret, omkostningseffektiv teknik, som nemt kan reproduceres i sammenligning med konventionelle latexbaseret perfusion at visualisere cerebrale vaskulatur. Det kan betragtes som et effektivt redskab til at analysere den brutto anatomi af cerebrale fartøjer og vaskulære territorier i forskellige fysiologiske og patologiske tilstande. Ved at kombinere med TTC-farvning denne teknik tilvejebringer en ny mulighed for at identificere omfanget af et iskæmisk anfald i forbindelse med vaskulær forsyning zoner i hjernen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Scribtol Schwarz (CB2)	Pelican, Germany	221 135
Stempelfarbe (CB1)	Herlitz PBS AG, Germany	10417202
Gedeo Latex	Pebeo, France	13042B