Intravasculaire Perfusie van Carbon Black Ink Hiermee Betrouwbare Visualisatie van hersenvaten

Summary

Analyse van knaagdier cerebrovasculaire anatomie speelt een belangrijke rol in experimenteel onderzoek beroerte. In deze context heeft intravasculaire perfusie met gekleurde latex beschouwd als een standaard hulpmiddel voor meerdere jaren. Deze techniek houdt specifieke technische beperkingen, die de reproduceerbaarheid ondermijnen. Hier beschrijven we een eenvoudige methode om hersenvaten op reproduceerbare wijze te visualiseren. Injectie van een mengsel van twee commercieel verkrijgbare carbon black inkten via de linker ventrikel myocardiale resulteert in adequate vulling van hersenvaten met hoog contrast visualisatie. We hebben met succes gebruikt een techniek die anastomose punten tussen cerebrale vasculaire gebieden van muizen met verschillende genetische achtergronden identificeren. We uiteindelijk aangeven dat deze nieuwe en eenvoudige methode voor kleuring vaartuig kan worden gecombineerd met trifenyltetrazoliumchloride (TTC) kleuring - veel gevallen gebruik te observeren en analyseren infarct volumes in muizen.

Abstract

De anatomische structuur van hersenvaten is een belangrijke determinant voor de hersenen hemodynamiek, alsmede de ernst van verwondingen na ischemische beledigingen. De cerebrale vasculatuur reageert dynamisch verschillende pathofysiologische toestanden en vertoont aanzienlijke verschillen tussen stammen en onder genetische manipulaties. In wezen is een betrouwbare techniek voor intracraniale vaartuig kleuring essentieel om de pathogenese van ischemische beroerte bestuderen. Tot voor kort werd een reeks verschillende technieken toegepast om de cerebrale bloedvaten waaronder injectie van lage viscositeit hars, Araldite F, gelatine gemengd met verschillende kleurstoffen ¹ (dus karmijnrood, India inkt) of latex met ² of ³ zonder roet. Visualiseren Perfusie van witte latex verbinding via de aorta ascendens werd voor het eerst gemeld door Coyle en Jokelainen ^3. Maeda et al.. ² zijn aangepast het protocol door het toevoegen van carbon zwarte inkt aan de latex compound voor een beter contrast visualisatie van de vaten na zoutoplossing perfusie van de hersenen. Echter inefficiënt perfusie en onvoldoende vulling van de vaten dikwijls door de hoge viscositeit van de latex verbinding ⁴ ervaren. Daarom hebben we beschreven een eenvoudige en kosteneffectieve techniek waarbij een mengsel van twee commercieel verkrijgbare carbon black inkt (CB1 en CB2) de cerebrale vasculatuur op reproduceerbare wijze ⁵ visualiseren. We hebben aangetoond dat perfusie met CB1 + CB2 in muizen leidt tot vervuiling van de hersenvaten aanzienlijk kleinere met een hogere dichtheid in vergelijking met latex perfusie ^5. Hier beschrijven we ons protocol de anastomose punten tussen de voorste (ACA) en middelste cerebrale slagaders (MCA) naar vat variaties in muizen met verschillende genetische achtergrond te bestuderen identificeren. Tenslotte tonen we de uitvoerbaarheid van onze techniek in een tijdelijke focale cerebrale ischemie bij muizen door het combineren CB1 +CB2-gemedieerde schip kleuring met TTC kleuring in verschillende graden van ischemische letsels.

Protocol

1. Dieren

1. Experimenten werden uitgevoerd volgens de NIH richtlijnen voor de zorg en het gebruik van proefdieren en goedgekeurd door de lokale autoriteiten. Voor alle experimenten C57Bl6 / J wild type muizen ApolipoproteinE ^{- / -} (ApoE KO) muizen en SV129 (12-16 weken oud, 26-30 g lichaamsgewicht, 5-6 dieren per proefgroep) gebruikt.

2. Kleuring van hersenvaten met gekleurde latex

1. Een mengsel van 25 ul carbon zwarte inkt (Herlitz, Duitsland) met 0,5 ml latex verbinding (Pebeo, Frankrijk) bij een 1:20 verhouding in een EP buis en opwarmen van het mengsel bij 37 ° C in een waterbad. Verzamel het mengsel in een 2 ml spuit met een naald van 28-30G voor verdoven van het dier.
2. Los 50 mg van papavarine hydrochloride poeder in 1 ml steriele fysiologische zoutoplossing. Verzamel de oplossing in een insulinespuit. Breek de naald van een ander steriele insuline spuit. Plaats deze naald aan het einde van een 20 cm lange PE10 buis. Het is makkelijk om dit PE10 buis op de naald van de insuline spuit met papavarine hydrochloride-oplossing te worden toegediend via de femorale ader tot vasodilatatie en een goede vulling van schepen te garanderen.
3. Bereid nog twee insulinespuiten elk 1 ml zoutoplossing. Insuline spuiten is vlotte levering van de geïnjecteerde vloeistof op een precieze locatie. Hierbij dient echter de hoge viscositeit van latex, alternatief 1 ml spuiten met verwijderbare bredere naalden worden gebruikt.
4. Neem alle spuiten en gesteriliseerd ontleden instrumenten in de buurt van het operationele stadium. Spreid een chirurgische manufacturier laken om de operatie podium. De operatie fase moet voldoende verlicht en een operatiemicroscoop kan indien nodig worden gebruikt.
5. Nu kan de lichaamsgewicht van een C57Bl6 / J muis en induceren anesthesie met 5% isofluraan verdampt in 70% N ₂ O en 30% O _2. Verder anesthesie met 1% verdampt isofluraan. Na een goede POSITIONERg van de muis op zijn rug en fixatie van de ledematen, een beoordeling van de diepte van de anesthesie. Snijd vervolgens de huid over het linker femorale ader en zoek de ader. Plaats de scherpe punt van de naald geplaatst PE10 buis langzaam papavarine hydrochloride oplossing te injecteren met een snelheid van 100 ul per min (50 mg / kg lichaamsgewicht).
6. Na de injectie, snijd de buikholte en prik het middenrif. Snij de ribben om het hart bloot zonder beschadiging of kneuzingen het. Clip de thoracale aorta met een slagader forceps. Maak een scherpe snee boven het rechter atrium, zodat het veneuze bloed weglopen. Injecteer 2 ml fysiologische zoutoplossing in de linker ventrikel, gevolgd door injectie van gekleurde latex hand lichte druk op 18-20 sec. Gebruik de voorgevulde spuiten een na de ander. Vermijd het injecteren van alle bubbels.
7. Na injectie van latex, laat het dier gedurende 5 minuten. Onthoofden het dier en verwijder voorzichtig de gehele hersenen. Zorg goed niet aan het schip architectuur en corte verwondenx tijdens het verwijderen van de schedel bot en hersenvliezen. Plaats de hersenen in een 60 mm celcultuur schotel met 6 tot 8 ml 4% PFA om een ​​foto te nemen. Plaats een meet liniaal onder de transparante schotel. Maak foto's met een 25x vergroting van de dorsale en de ventrale oppervlak van de hersenen met een camera aan de operatiemicroscoop. 's Moeten worden genomen bij 90 ° hoek tussen de petrischaal en het microscoopobjectief om de oorspronkelijke afstand kwantificeren.
8. Herhaal de procedure in eens 4-5 dieren.

3. Kleuring van Cerebral Schepen met Mengsel van Carbon Black Inks

1. De resultaten van latex cerebrovasculaire kleuring ons protocol vergelijken, een mengsel van 100 ul Herlitz Stempelfarbe inkt (CB1) met 900 pl Pelican Scribtol Schwarz inkt (CB2) in een 1,5 ml EP buis. Bereid twee EP buisjes tot een totaal volume van 2 ml mengsel van CB1 en CB2 in een 1:9 verhouding maken. Verzamel het mengsel in twee afzonderlijke insulinespuiten (1ml elk). Cap de spuiten en plaats ze in een waterbad te warmen tot 37 ° C. Verzamel 2 ml zoutoplossing in een andere twee met insuline spuiten, en leg ze in een waterbad als goed.
2. Verdoven van het dier en herhaal dezelfde procedure als hierboven beschreven, behalve voor injectie van papavarine hydrochloride. Na injectie van 2 ml salaine in de linker ventrikel, Injecteer 2 ml mengsel van carbon black inkt plaats van de gekleurde latex. Voer de injecties met de hand met lichte druk dan 18 tot 20 seconden per ml. Klem de thoracale aorta voorafgaand aan de injecties.
3. Offer het dier, verwijder de hersenen en foto's maken.
4. Voor langdurige bewaring van de hersenen, zet de hersenen in 4% PFA overnacht gevolgd door incubatie met sucrose met geleidelijk toenemende concentratie tot de drijvende hersenen dompelt volledig (5% gevolgd door 15% en 30%). Hersenen van de dieren geperfundeerd met de gekleurde latex kan ook worden bewaard op dezelfde wijze.
5. Voer deprocedure eens 4-5 dieren. Het verschil in cerebrale vasculaire anatomie door verschillende genetische achtergrond of stammen vergelijken herhalen protocol in evenveel ApoE KO muizen en SV129 respectievelijk.
6. De vasculaire anatomie bestuderen onder ischemische omstandigheden induceren voorbijgaande focale cerebrale ischemie gedurende 45 min en 90 min volgens een standaard protocol van intraluminale occlusie van de MCA onder diepe anesthesie (een gedetailleerde beschrijving van de operatie valt buiten het bestek van dit artikel, de Verwezen wordt naar Doeppner et al.., 2010). Aan het einde van de reperfusieperiode gepland (1 dag of 5 dagen) Voer de vaatverkleuring met CB1 + CB2 inkten alleen en vlekken de gehele hersenen met 2% TTC oplossing bij 37 ° C gedurende 5-10 minuten om het infarctvolume identificeren . TTC wordt tot rood gekleurd formazan door de mitochondriale enzymen (met name succinaat dehydrogenase). Na TTC kleuring, de metabolisch actief weefsel vlekken diep rood terwijl het infarct weefsel overblijft unstained en lijkt wit te wijten aan slecht functionerende en gedenatureerde mitochondriale enzym. Verzamel beelden op dezelfde manier als hierboven beschreven.

4. Studie van Cerebro Vasculair gebieden

1. Om de bruto anatomie van hersenvaten, beelden van het dorsale oppervlak van de hersenen ofwel gekleurd met gekleurde latex of CB1 + CB2 inkten kunnen worden geanalyseerd met ImageJ software (een op Java gebaseerde publieke domein software die wordt gebruikt voor beeldverwerking en-analyse) te analyseren. Hersenen geperfuseerd met gekleurde latex kan blijken variabele mate van kleuring vaartuig op het dorsale oppervlak, terwijl CB1 + CB2 perfusie zal vlekken alle vaartuigen op zowel de ventrale en dorsale oppervlakken.
2. Open een afbeeldingsbestand met ImageJ software. Identificeer de anastomose punten tussen de ACA en de MCA. Een anastomose wordt gedefinieerd als de plaats waar het vaartuig diameter is de smalste en de halve afstand tussen de dichtstbijzijnde vertakkingspunten van de ACA en de MCA takken, respectievelijk ^2.
3. Zet de schaal in mm. Meet de afstand tussen de anastomose lijn en de middellijn van 4 mm caudaal van de frontale pool van de hersenen met behulp van rechte lijn tekengereedschap en "maatregel" tool. Doe hetzelfde aan 6 mm caudaal van de frontale pool. Analyseer 3 tot 4 beelden per dier en bereken de gemiddelde waarde. Vergelijk de waarden voor verschillende groepen dieren de variatie van cerebrovasculaire anatomie identificeren. In C57Bl6 / J dieren kan de anastomose tussen de ACA en de MCA dichter bij de middellijn natrekken dan 4 mm bij 6 mm caudaal van de frontale pool. ApoE KO muizen zal geen significant verschil in dit opzicht. Integendeel, in SV129 muizen de anastomose lijn liggen en verder evenwijdig aan de middellijn zowel 4 mm en 6 mm caudaal van de frontale pool.
4. Om de vasculaire anatomie analyseren in ischemische ziekten, voert u dezelfde berekeningen hierboven vermeld. Identificeer het infarct grens als de rode en witte gekleurde weefsel marge die metabolisch actief weefsel en necrotisch weefsel ongekleurde, respectievelijk. Meet de afstand van het infarct rand van de middellijn op 4 mm en 6 mm caudaal van de frontale pool van de hersenen. Verzamel de gemiddelde waarde 3-4 beelden per dier. Vergelijk de resultaten tussen ischemie en reperfusie periode.

Representative Results

Het protocol hier beschreven overwint de technische beperkingen van conventionele latex gebaseerde visualisatie van knaagdieren cerebrale vaatstelsel. Figuur 1A toont aan dat volgende perfusie van de gekleurde latex, alleen de grote schepen op het ventrale oppervlak zijn gekleurd, waardoor de gehele dorsale oppervlak ongekleurd. Het resultaat is ook zeer variabel. Slechts een dier uit zes shows gedeeltelijke kleuring van de ACA en de MCA zichtbaar op het dorsale oppervlak van de hersenen (data niet getoond). Omgekeerd CB1 + CB2 perfusie resulteert in voldoende vulling van kleine en grote vaten gelijke wijze (Figuur 1B). Kleuring stabiel tot 7 dagen zonder enige verandering van kwaliteit. Met ImageJ programma hebben we gekwantificeerd de afstand van de anastomose punten tussen de ACA en de MCA van de middellijn in wildtype C57Bl6 / J muizen (Figuur 1C). We deze waarden vergeleken met ApoE KO muizen of genetische WIJZIGINGE observerenon had enig effect op de regionale vasculaire anatomie (Figuur 1D). Hoewel het uitspelen van de ApoE had geen invloed op de anatomische structuur van de hersenvaten in C57Bl6 / J muizen werd een significant verschil opgemerkt tussen C57BL/6J en SV129 stammen (figuur 1E, F). Dus kunnen we de uitvoerbaarheid van deze kleuringsprotocol tonen aan de anatomische verschillen van de cerebrale vasculatuur door genetische of stam verschillen in muizen te evalueren.

In experimentele knaagdier takt modellen, is TTC vlekken op grote schaal gebruikt om het infarct volume te observeren. Gelijktijdige visualisatie van hersenvaten en het infarct volume te geven ons de mogelijkheid om morfologische veranderingen na ischemie-reperfusie te analyseren. Daarom hebben we geverifieerd of CB1 + CB2-gemedieerde vaatverkleuring stabiel was bij TTC kleuring in verschillende graden van ischemische reperfusie-letsel (Figuur 2A-H). We hebben verder geanalyseerd de anastomose punten tussen de ACA en de MCA na 45 min of 90 min ischemie gekoppeld met ofwel 1 dag of 5 dagen reperfusie perioden (Figuur I, J). Zoals verwacht, de gemiddelde afstand tussen de middellijn en de anastomose toonden geen significant verschil tussen de groepen (Figuur 2I, J) en was in hetzelfde bereik met niet-ischemische dieren (Figuur 1F). De afstand van de middellijn van de grens infarct significant verschilden, wat de toegenomen infarct volume met hogere mate van ischemie-reperfusieschade (figuur 2K, L). Deze gegevens tonen dat CB1 + CB2 kleuring kunnen worden gereproduceerd in de dieren onderworpen aan verschillende graden van ischemie-reperfusieschade en de stabiliteit van de kleuring in combinatie met TTC kleuring.

374/4374fig1.jpg "/>
Figuur 1. Observatie van de cerebrale vasculaire anatomie in muizen met genetische en stam verschillen. Figuur 1A laat zien dat intravasculaire perfusie van gekleurde latex alleen vlekken grote schepen op het ventrale oppervlak, terwijl het dorsale oppervlak blijft ongekleurd. Omgekeerd CB1 + CB2 perfusie resulteert in permanente vlekken van zowel kleine als grote schepen op de ventrale en het dorsale oppervlak van de hersenen (Figuur 1B). Kwantificering van de afstand van de anastomose punten tussen de anterior cerebrale slagader (ACA) en de middelste cerebrale slagader (MCA) van de middellijn in wildtype C57Bl6 / J muizen (Figuur 1C) geen verschil met hun genetisch mutant ApoE KO tegenhangers (Figuur 1D). Echter significant verschil vastgesteld tussen C57Bl6 / J en SV129 stammen (Figuur 1E, F). Scale bar = 2mm. * Significant verschillend van zowel C57BL6 / J wild type en ApoE KO muizen 4mm, p p <0,01.

Figuur 2. Analyse van vasculaire anatomie in ischemische hersenen. Figuur 2A-H tonen beelden van de ventrale en dorsale oppervlak van de hersenen aan 45 min of 90 min ischemie gevolgd door 1 dag tot 5 dagen reperfusie tijd. Het linkerpaneel toont CB1 + CB2 gemedieerde vasculaire kleuring, terwijl het rechter paneel toont combinatie van de vaatverkleuring en TTC kleuring, waarin de stabiliteit van de vaatverkleuring in verschillende graden van ischemische reperfusie-letsel (Figuur 2A-H). Analyse van de anastomose punten tussen de anterior cerebrale slagader (ACA) en de middelste cerebrale slagader (MCA) na 45 min of 90 min ischemie gekoppeld met ofwel 1 dag of 5 dagen reperfusieperiode dePicten geen significant verschil tussen de groepen (Figuur 2I, J). Kan echter significant verschil opgemerkt in de afstand van de middellijn van de grens infarct, waarin de toename van volume infarct met hogere mate van ischemie-reperfusieschade (figuur 2K, L). Schaal bar = 2 mm. * Significant verschillend van de 45 min ischemie met 1 dag reperfusie, p <0,05, en ** 5 dagen reperfusie, p <0,01. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Discussion

Perfusie van CB1 + CB2 door handmatige injectie kan worden uitgevoerd met succes door zonder intensieve opleiding als het niet gaat om een specifieke apparaat beperken tot bepaalde druk ^2,3 impliceren. De heterogeniteit van de perfusie resultaten in ons protocol is ook te verwaarlozen. Slechts 1 dier van de 16 niet-ischemische dieren en 3 van de 20 ischemische dieren hebben aangetoond onvolledige perfusie. In deze gevallen, integratie van bellen tijdens zoutoplossing perfusie leidt tot occlusie van de schepen was waarschijnlijk de reden van het gebrek aan resultaat.

Hoewel perfusie van latex is oorspronkelijk uitgevoerd door de aorta ascendens ^2,3, alternatieve routes van perfusie ook gerapporteerd waaronder de linkerventrikel ^7,8 of halsslagader ^9. We vonden geen significant verschil in de resultaten na perfusie zowel via de opgaande aorta of de linker ventrikel (ongepubliceerde waarnemingen). Als zodanig was dezeals gevolg van de betere toegankelijkheid gekozen.

Voor keuze van de specifieke carbon black inkten die in deze studie hebben we onderzocht de resultaten van intravasculaire perfusie met een reeks commercieel beschikbare carbon black inkt. CB1 en CB2 worden geselecteerd perfusie efficiëntie en stabiliteit van kleuring. CB1 heeft een zeer lage viscositeit (1,1 mPa / sec) bevattende 2,1% carbon black terwijl CB2 - oorspronkelijk gemaakt als een inkt kalligrafie - bevat 2,5% carbon black met een hogere viscositeit (10-50 mPa / s). Individuele toepassing van deze inkten is gebleken onvoldoende met betrekking tot zowel efficiëntie en stabiliteit van kleuring. Daarom hebben we samen de inkten en getitreerd de combinatie verhoudingen. Perfusie met CB1: CB2 bij een 1:9 verhouding resulteert in een permanente kleuring van zowel grote als kleine schepen. Daarom kan arteriële anastomose punten gemakkelijk te herleiden tot de kruising tussen twee vasculaire gebieden, dat wil zeggen te definiëren. de ACA en de MCA. Deze findings zijn consistent met eerdere rapporten ^2,10,11.

ApoE knock-out muizen presenteren 5-8 keer hogere plasma cholesterol niveau en zijn zeer gevoelig voor het ontwikkelen atherosclerose bij op cholesterol dieet ^12. Of de genetische modificatie beïnvloedt ook de anatomie van hersenvaten is nog niet gerapporteerd. Anderzijds zijn SV129 muizen al gemeld groter infarct volume aanwezig in vergelijking met C57Bl6 / J muizen door hun verschillende vasculaire anatomie ^2. We geverifieerd ons protocol in deze drie groepen van dieren om het verschil in vasculaire anatomie vergelijken.

De kleuringsprotocol in ischemische hersenen geldig is, betrokken voorbijgaande focale cerebrale ischemie reperfusie de effecten zijn in tegenstelling tot eerdere studies, die voornamelijk gericht op permanente occlusie van de MCA ^{2-4, 10,13.} Zoals verwacht, hebben we geen significante verschillen in het patroon van de line van anastomose na verschillende ischemische en reperfusie periode in C57BL6 / J muizen. Geen wijzigingen in vat diameters tussen de ischemische en niet-ischemische hemisferen waargenomen, vermoedelijk dergelijke veranderingen op langere tijden reperfusie, namelijk 2-3 weken na beroerte ^14. Kortom, de door ons protocol blijkt een minder gecompliceerde, kosteneffectieve techniek, die gemakkelijk kan worden gereproduceerd in vergelijking met conventionele latex perfusie cerebrale bloedvaten te visualiseren. Het kan worden beschouwd als een effectief instrument om de bruto anatomie van hersenvaten en vasculaire gebieden in verschillende fysiologische en pathologische omstandigheden te analyseren. Door het combineren van kleuren TTC deze techniek een nieuwe kans om de mate van ischemie identificeren in de context van bloedtoevoer zones in de hersenen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Scribtol Schwarz (CB2)	Pelican, Germany	221 135
Stempelfarbe (CB1)	Herlitz PBS AG, Germany	10417202
Gedeo Latex	Pebeo, France	13042B