Neuroscience

זלוף intravascular של דיו שחור פחם מאפשר הדמיה אמינה של כלי מוחות

Published: January 4, 2013 doi: 10.3791/4374

Mohammad R. Hasan¹, Josephine Herz¹, Dirk M. Hermann¹, Thorsten R. Doeppner¹

¹Department of Neurology, University of Duisburg-Essen Medical School

Summary

ניתוח של כלי דם במוח האנטומיה מכרסם משחק תפקיד חשוב במחקר ניסויי שבץ. בהקשר זה, זלוף intravascular עם לטקס צבעוני כבר נחשב כלי סטנדרטי במשך כמה שנים. עם זאת, טכניקה זו מרמזת מגבלות טכניות שונות, המערערים את השחזור שלה. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה לדמיין כולים מוחיים באופן שחזור. הזרקה של תערובת של שני צבעים שחורים פחם מסחרי זמינים דרך תוצאות חדר לב השמאליות של שריר הלב במילוי נאות של כולים מוחיים עם הדמית ניגודיות גבוהה. יש לנו ליישם בהצלחה בטכניקה זו כדי לזהות נקודתי anastomotic בין שטחי כלי דם מוחיים של עכברים עם רקע גנטי שונה. סוף הסוף אנחנו נותנים ראיות לכך שהשיטה חדשה ופשוטה לצביעת כלי יכולה להיות משולבת עם כלוריד triphenyltetrazolium (TTC) צביעה - כלי בשימוש נרחב כדי להתבונן ולנתח כמויות אוטם בעכברים.

Abstract

המבנה האנטומי של כולים מוחיים הוא גורם מפתח עבור פרמטרים המודינמיים במוח, כמו גם את חומרת פציעה בעקבות עלבונות איסכמי. מערכת כלי הדם במוח באופן דינמי מגיבה למצבים שונים pathophysiological והוא מציג הבדלים משמעותיים בין זנים ובתנאים של מניפולציות גנטיות. בעיקרו של דבר, טכניקה אמינה לצביעת כלי שיט תוך גולגולת היא חיונית כדי ללמוד בפתוגנזה של שבץ איסכמי. עד לאחרונה, אוסף של טכניקות שונות כבר מועסק לדמיין vasculature המוחין כולל הזרקה של שרף צמיגות נמוך, araldite F, ג'לטין מעורב עם צבעים ¹ (כלומר ארגמן אדום, הודו דיו) או לטקס שונים עם ² או ³ ללא הפחם שחור. טפטוף של מתחם לטקס לבן דרך אב העורקים עולה כבר דווח לראשונה על ידי קויל וJokelainen ^3. מאדה et al. ² שינה את הפרוטוקול על ידי הוספת carboדיו שחור n למתחם הלטקס להדמית ניגוד משופרת של הכולים לאחר זלוף המלוח של המוח. עם זאת, זלוף לא יעיל ומילוי לקוי של הכולים לעתים קרובות חוו עקב צמיגות גבוהה של מתחם הלטקס ^4. לכן, יש לנו תארנו טכניקה פשוטה וחסכונית באמצעות תערובת של שני צבעים שחורים פחם זמינים מסחרי (CB1 ו CB2) כדי להמחיש את מערכת כלי הדם במוח באופן לשעתק ^5. הראנו שזלוף עם CB1 CB2 + בתוצאות עכברים בצביעת כולים מוחיים קטנים משמעותי בצפיפות גבוהה יותר בהשוואה לזלוף הלטקס ^5. כאן, אנו מתארים הפרוטוקול שלנו לזהות את נקודתי anastomotic בין הקדמי (ACA) ועורקי מוח אמצעיים (MCA) ללמוד וריאציות כולים בעכברים עם רקע גנטי שונה. לבסוף, אנו להוכיח את ההיתכנות של הטכניקה שלנו במודל חולף מוקד מוחות איסכמיה בעכברים על ידי שילוב CB1 +צביעת כולים CB2 בתיווך עם כתמי TTC בדרגות שונות של פציעות איסכמי.

Protocol

1. בעלי חיים

ניסויים בוצעו על פי הנחיות NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי הרשויות המקומיות. לכל הניסויים, C57Bl6 / י עכברים ברי סוג, ApolipoproteinE ^{- / -} (ApoE KO) וSV129 עכברים (12-16 שבועות ישנים, משקל גוף, גרם 26-30 5-6 חיות לקבוצת ניסוי) היו בשימוש.

2. צביעת כלי מוחות עם אטקס הצבעוני

הכן תערובת של דיו 25 μl פחם שחור (הרליץ, גרמניה) עם 0.5 מ"ל של תרכובת לטקס (Pebeo, צרפת) בשעת 1:20 ביחס צינור EP ולחמם את התערובת על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. לאסוף את התערובת במזרק מ"ל 2 עם מחט של 28-30G לפני מרדים בעלי החיים.
להמס 50 מ"ג של אבקת הידרוכלוריד papavarine לתוך 1 מ"ל של תמיסת מלח הרגיל סטרילי. אסוף את הפתרון במזרק אינסולין. לנתק את המחט ממזרק אינסולין אחר סטרילי. הנח מחט זה בסוף 20 גמ 'PE10 צינור ארוך. עכשיו לצרף צינור PE10 זה במחט של מזרק האינסולין המכיל פתרון הידרוכלוריד papavarine להיות מוזרקים דרך וריד הירך כדי להבטיח vasodilatation ומילוי תקין של כלי דם.
הכן שני מזרקי אינסולין עוד כל מ"ל מכיל 1 מתוך תמיסת מלח. מזרקי אינסולין לאפשר אספקה חלקה של הנוזל שהוזרק במיקום מדויק. עם זאת, בשל צמיגות גבוהה של לטקס, חלופה 1 מיליליטר מזרקים עם מחטים נשלפות רחבות יותר יש להשתמש.
קח את כל המזרקים והמכשירים מבתרים מעוקרים הקרובים לשלב ההפעלה. פרש יריעת דרייפר כירורגית סביב במת המבצע. שלב הפעולה צריך להיות מואר מספיק ומיקרוסקופ ניתן להשתמש במידת צורך.
עכשיו למדוד את משקל גופו של עכבר C57Bl6 / י ולאחר מכן לגרום להרדמה של 5% מתאדים isoflurane ב70% N ₂ O ו 30% O _2. המשך להרדמה של 1% מisoflurane מתאדה. לאחר positionin התקיןגרם של העכבר על הגב וקיבועה של הגפיים, להעריך את עומק ההרדמה. ואז לחתוך את העור מעל וריד ירך שמאל ולאתר את הווריד. הכנס את הקצה החד של המחט שהונחה על PE10 צינורית ולהזריק פתרון הידרוכלוריד papavarine לאט בקצב של 100 לדקה μl (משקל 50 מ"ג / קילו משקל גוף).
לאחר ההזרקה, לחתוך את חלל הבטן ולנקב את הסרעפת. חותך את הצלעות לחשוף את הלב מבלי לפגוע או חבורותיו. קליפ אב עורקים החזי יורד עם כ מלקחיים עורקים. הפוך קיצוץ חד בעלייה הימנית כדי לאפשר לדם הוורידים לנקז החוצה. להזריק 2 מ"ל של תמיסת מלח לתוך החדר השמאלי, ואחריו על ידי ההזרקה באופן ידני עם הלטקס הצבעוני לחץ קל על 18-20 שניות. השתמש במזרקים הממולאים מראש בזה אחר זה. הימנע מהזרקה כל בועות.
לאחר ההזרקה של לטקס, לעזוב את החיים למשך 5 דקות. לערוף את החיה ולהסיר את המוח כולו בזהירות. תשמרו על עצמך טוב שלא לפגוע בכלי הדם ובארכיטקטורת קורטהx תוך הסרת עצם הגולגולת וקרומי המוח. מניח את המוח בצלחת תרבית תאים 60 מ"מ המכילה 6-8 מ"ל של 4% PFA לקחת תמונה. הנח שליט מדידה תחת הצלחת השקופה. קח את התמונות בהגדלה של 25x גב ופני שטח הגחון של המוח עם מצלמה המחוברת למיקרוסקופ. תמונות יש לקחת בזווית של 90 מעלות בין צלחת הפטר והאובייקטיבי במיקרוסקופ כדי לכמת את המרחק המקורי.
חזור על התהליך בחי 4-5 נוספות.

3. צביעת כלי מוחות עם תערובת של סוגי דיו פחם שחורים

כדי להשוות את התוצאה של הכתמת לטקס מבוססת מוחות כלי דם בפרוטוקול שלנו, להכין תערובת של 100 μl של הרליץ Stempelfarbe דיו (CB1) עם 900 μl של שקנאי Scribtol שוורץ דיו (CB2) בצינור 1.5 מ"ל EP. הכן שני צינורות EP לעשות נפח כולל של תערובת 2 מ"ל של CB1 ו CB2 ביחס 01:09. לאסוף את התערובת בשני מזרקי אינסולין נפרדים (1מ"ל כל אחד). מכסה את המזרקים ולמקם אותם באמבט מים כדי לחמם עד 37 מעלות צלזיוס איסוף 2 מ"ל של תמיסת מלח במזרקי אינסולין 2 נוספים, ולמקם אותם באמבט מים גם כן.
הרדם את החיה וחוזר על אותו התהליך כפי שתואר לעיל, פרט להזרקת hydrochloride papavarine. בעקבות זריקה של 2 המ"ל salaine לחדר השמאלי, מזריק תערובת 2 מ"ל של צבע שחור פחם במקום לטקס הצבעוני. לבצע את הזריקות ביד עם לחץ קל על 18-20 שניות למ"ל. קליפ אב העורקים החזי יורד לפני את הזריקות.
להקריב את החיה, הסר את המוח ולצלם.
לשימור לטווח הארוך של המוח, לשים את המוח ב4% PFA הלילה אחרי דגירה עם סוכרוז בריכוז גובר בהדרגה, עד שהמוח הצף טובלות לחלוטין (אחרי 5% ב 15% ולאחר מכן 30%). מוחם של בעלי חי perfused עם הלטקס הצבעוני גם יכול להישמר באותו אופן.
בצעהליך בחיות 4-5 נוספות. כדי להשוות את ההבדלים באנטומיה של כלי דם במוח בשל רקע גנטי שונה או זנים, חזור על הפרוטוקול במספר שווה של ApoE KO וSV129 עכברים, בהתאמה.
כדי ללמוד את האנטומיה של כלי הדם בתנאי איסכמי, לגרום לאיסכמיה המוחית חולפת מוקד ל45 דקות או 90 דקות בהתאם לפרוטוקול סטנדרטי של חסימת intraluminal של MCA תחת הרדמה עמוקה (תיאור מפורט של הניתוח הוא מעבר להיקף של מאמר זה; הקורא נקרא Doeppner et al., 2010). בסוף תקופת reperfusion המתוכננת (יום 1 או 5 ימים), לבצע את צביעת כלי הדם עם CB1 CB2 + דיו בלבד וכתם את המוח כולו עם 2% פתרון TTC על 37 מעלות צלזיוס במשך 5-10 דקות כדי לזהות את נפח האוטם . TTC מצטמצם formazan צבע האדום על ידי אנזימי המיטוכונדריה (דהידרוגנז במיוחד succinate). לאחר מכתים TTC, את כתמי הרקמות הפעילות מטבולית עמוק האדומים ואילו רקמות infarcted נשארה unstaiהנד ונראה לבן בשל אנזים המיטוכונדריאלי מתפקד ומפוגל. לאסוף תמונות באותו אופן כפי שתואר לעיל.

4. מחקר של כלי דם במוח שטחים

כדי לנתח את האנטומיה הברוטו של כולים מוחיים, תמונות של פני השטח הגבי של המוח או המוכתם עם לטקס צבעוני או CB1 CB2 + דיו ניתן לנתח עם ImageJ תוכנה (תוכנה מבוססת ג'אווה ציבור תחום המשמשת לעיבוד תמונה וניתוח). מוחות perfused עם לטקס צבעוני עשויים להראות מעלות משתנות של כתמי כלי ממוקמים על פני שטח הגבו, בעוד CB1 CB2 + זלוף יהיה כתם לכל הכולים משני משטחי הגחון וגב.
פתח קובץ תמונה עם תוכנת ImageJ. לזהות את כל נקודתי anastomotic בין ACA ו-MCA. נקודת anastomotic מוגדרת כאתר שבו קוטר הכלי הוא מרחק החצי בין הנקודות הקרובות ביותר ההסתעפות של ACA וענפי MCA, בהתאמה ² או צר.
הגדר את ההיקף במ"מ. מדוד את המרחק בין קו anastomotic וקו האמצע ב4 מ"מ זנב לקוטב הקדמי של המוח באמצעות כלי קו ישר וציור כלי "מידה". לעשות את אותו הדבר בגיל 6 המ"מ caudally מהקוטב החזיתי. מנתח את תמונות 3-4 לבעלי חיים ולחשב את הערך הממוצע. השווה את הערכים בין קבוצות שונות של בעלי חיים כדי לזהות את הווריאציה של האנטומיה מוחית. בבעלי החיים C57Bl6 / י, קו anastomotic בין ACA ו-MCA ניתן לייחס קרוב יותר לקו האמצע ב4 מ"מ מגיל 6 המ"מ caudally מהקוטב החזיתי. עכברי KO APOE יציגו הבדל משמעותי מבחינה זו. להיפך, בSV129 עכברי קו anastomotic ישקר ועוד במקביל לקו האמצע הן ב4 מ"מ ו 6 מ"מ caudally מהקוטב החזיתי.
כדי לנתח את האנטומיה של כלי הדם אניn תנאי איסכמי, לבצע את החישובים שהוזכרו לעיל. זהה את גבול האוטם כשולי רקמות בצבעים אדומים ולבנים מייצגים את הרקמה פעילה מבחינת חילוף חומרים ורקמות נמקית כתם, בהתאמה. מדוד את המרחק של גבול מהאוטם בקו אמצע 4 מ"מ ובזנב 6 מ"מ מהמוט הקדמי של המוח. אסוף את הערך הממוצע מתמונות 3-4 לבעלי חיים. השווה את התוצאות בין איסכמיה השונה ותקופות reperfusion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הפרוטוקול המתואר כאן מתגבר על המגבלות הטכניות של הדמיה מבוססת לטקס הקונבנציונלית של מערכת כלי דם במוח מכרסם. האיור 1A מראה כי זלוף הבא של הלטקס הצבעוני, רק הכלי גדול על פני שטח הגחון הוא מוכתם, עוזב את פני השטח הגבי כל כתם. התוצאה היא גם משתנית מאוד. רק חיה אחת מתוך שישה מופעים חלקית צביעה של ACA ו-MCA הגלוי על פני השטח הגבי של המוח (מידע לא מוצג). לעומת זאת, CB1 CB2 + תוצאות זלוף במילוי מספיק של כולים קטנים וגדולים באופן שווה (1B איור). הצביעה היא יציבה עד 7 ימים ללא כל שינוי באיכות. באמצעות תכנית ImageJ, יש לנו לכמת את המרחק מנקודתי anastomotic בין ACA ו-MCA מקו האמצע בסוג פראי C57Bl6 / עכברי J (האיור 1C). אנחנו לעומת ערכים אלה עם עכברי APOE ק.א. כדי לראות אם זה או לא modificati הגנטיבהייתה כל השפעה על האנטומיה של כלי הדם האזורית (1D איור). למרות דפיקות מתוך ApoE לא השפיעה על המבנה האנטומי של הכולים המוחיים בעכברי C57Bl6 / J, הבדל משמעותי בין לב C57bl/6J וSV129 זני 1E (איור, F). לפיכך, אנו מסוגלים להראות את ההיתכנות של פרוטוקול מכתים זה להעריך את ההבדלים אנטומיים של מערכת כלי הדם במוח כתוצאה מהבדלים גנטיים או מאמץ בעכברים.

במודלים של שבץ מכרסם ניסיוניים, מכתים TTC נעשה שימוש נרחב כדי לבחון את נפח האוטם. הדמיה סימולטני של כולים מוחיים ונפח האוטם לתת לנו את ההזדמנות כדי לנתח שינויים מורפולוגיים בעקבות איסכמיה reperfusion. לכן, יש לנו לאמת או לא CB1 + צביעת כלי הדם CB2 בתיווך הייתה יציבה עם מכתים TTC בדרגות שונות של פציעות-reperfusion איסכמי (איור 2A-H). נתחנו נוסף anastomotic נקודות בין ACA ו-MCA לאחר 45 דקות או 90 דקות של איסכמיה מתאימות עם או יום 1 או 5 תקופות reperfusion ימים (איורי, י '). כצפוי, את המרחק הממוצע בין קו האמצע ואת נקודתי anastomotic לא הראה הבדל משמעותי בין הקבוצות (האיור ט 2, י ') והיה באותו הטווח עם בעלי חיים שאינם איסכמיים (האיור 1F). עם זאת, המרחק מהקו האמצע לגבול האוטם שונה משמעותי, המשקף את נפח האוטם המוגבר עם רמה גבוהה יותר של פציעת איסכמיה reperfusion (האיור 2K, L). נתונים אלו מראים כי CB1 CB2 + צביעה יכולה להיות מועתקת בחיות החשופות לדרגות שונות של פציעת איסכמיה reperfusion והיציבות של הכתמים בשילוב עם מכתים TTC.

374/4374fig1.jpg "/>
איור 1. התצפית של האנטומיה של כלי הדם במוח בעכברים עם הבדלים גנטיים ומאמץ. האיור 1A מראה כי זלוף intravascular של כתמים רק לטקס צבעוניים כלי גדול על פני שטח הגחון, בעוד המשטח הגבה נשאר בתוליים. לעומת זאת, CB1 CB2 + תוצאות זלוף בצביעה קבועה של שני כולים דם קטנים וגדולים על הגחון ומשטחי הגב של המוח (1B איור). כימות של מרחק מנקודתי anastomotic בין העורק הקדמי המוחי (ACA) ועורק המוח האמצעי (MCA) מקו האמצע בסוג פראי C57Bl6 / עכברי J (האיור 1C) לא הראה הבדל עם עמיתיהם גנטיים מוטצית APOE ק.א. (איור 1D). עם זאת, הבדל משמעותי הוא הבחין בין C57Bl6 / J וSV129 זני 1E (איור, F). היקף בר = 2 מ"מ. * שונה באופן משמעותי משני עכברי APOE ק.א. סוג ופראי C57BL6 / י ב4 מ"מ, עמ ' p <0.01.

איור 2. ניתוח של האנטומיה של כלי דם במוח איסכמי. תמונות מראים איור 2A-H של משטחי הגחון והגבו של המוח נתון לאיסכמיה דקות 45 דקות או 90 ואחרי היום 1 או זמן reperfusion ימים 5. הפנל השמאלי מציג CB1 + צביעת כלי דם CB2 תיווך, ואילו החלון השמאלי מציג שילוב של שניהם מכתימי כלי הדם וכתמי TTC, המעיד על היציבות המכתימה כלי הדם בדרגות שונות של פציעות-reperfusion איסכמי (איור 2A-H). ניתוח של נקודתי anastomotic בין העורק הקדמי המוחי (ACA) ועורק המוח האמצעי (MCA) לאחר איסכמיה דקות 45 דקות או 90 תאמה גם עם תקופת reperfusion יום 1 או 5 ימים דההפיקטים לא נמצאים הבדל משמעותי בין הקבוצות (האיור ט 2, י '). עם זאת, הבדל משמעותי ניתן לציין במרחק מקו האמצע לגבול האוטם, המעיד על הגידול של נפח אוטם בדרגה גבוהה יותר של פציעת איסכמיה reperfusion (האיור 2K, L). סרגל קנה מידה = 2 מ"מ. * שונה באופן משמעותי מאיסכמיה 45 דקות עם reperfusion 1 יום, P <0.05, ו** reperfusion 5 ימים, P <0.01. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הטפטוף של CB1 CB2 + על ידי הזרקת הוראות יכול להתבצע בהצלחה על ידי ללא הכשרה נמרצת, מאחר שאינו כרוך בכל מכשיר ספציפי לרמוז לחץ מסוים ^2,3. ההטרוגניות של תוצאות זלוף בפרוטוקול שלנו היא גם זניחה. רק חית 1 מתוך 16 בעלים חיים שאינם איסכמיים ו3 מתוך 20 בעלי חי איסכמי הראו זלוף לא שלם. במקרים אלה, שילוב של בועות במהלך זלוף המלוח שמוביל לחסימה של כולים היה ככל הנראה הסיבה לתוצאה המוצלחת.

למרות הטפטוף של לטקס שהמקור בוצע דרך אב העורקים עולה ^2,3, מסלולים חלופיים של זלוף הם דיווחו גם כוללים חדר השמאלי ^7,8 או עורק התרדמה המשותף ^9. אנחנו לא מצאנו הבדל משמעותי בתוצאות בעקבות זלוף דרך אב עורקים או עולה או החדר השמאלי (תצפיות שלא פורסמו). ככזה, עליו היהנבחר בשל נגישותו הקלה יותר.

לפני הבחירה את הצבע השחור הפחם הספציפי שהוזכר במחקר זה, העריך את התוצאות של זלוף intravascular עם מגוון של צבעי דיו שחורים פחם זמינים מסחרי. CB1 ו CB2 נבחר ליעילותם זלוף ויציבות של הכתמה. CB1 יש צמיגות נמוכה מאוד (1.1 MPA / שני) המכילה 2.1% פחמן שחור ואילו CB2 - מיוצר במקור כדיו קליגרפיה - מכיל פחמן שחור עם צמיגות גבוהה יותר (10-50 MPA / ים) 2.5%. יישום בודד של צבע אלה כבר מצא להיות מספיקים לגבי שניהם יעילות ויציבות של הכתמה. כתוצאה מכך, יש לנו שילוב צבעי הדיו וטיטרציה יחסי הקומבינציה. זלוף עם CB1: CB2 בתוצאות היחס 01:09 בצביעה קבועה של שני כלי שיט גדולים וקטנים. לכן, נקודות עורקות anastomotic ניתן לעקוב בקלות להגדיר את הצומת שבין שני שטחים, כלומר בכלי דם. ACA ו-MCA. אלה findings עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים ^2,10,11.

עכברי KO APOE להציג רמת כולסטרול בדם גבוהה פי 5-8 והם רגישים מאוד לפיתוח טרשת עורקת כאשר לשים על דיאטה עשירה כולסטרול ^12. אם השינוי הגנטי משפיע גם על האנטומיה של כולים מוחיים לא דווח עד כה. מצד השני, SV129 עכברים כבר דיווחו להציג נפח אוטם גדול יותר בהשוואה לעכברי C57Bl6 / J עקב האנטומיה של כלי הדם השונה שלהם ^2. אנחנו אומתו פרוטוקולנו בשלוש קבוצות של בעלי חיים כדי להשוות את ההבדלים באנטומיה של כלי דם.

כדי לאמת את הפרוטוקול המכתים במוח איסכמי, אנו מעורבים איסכמיה מוחית חולפת מוקד לכלול השפעות של reperfusion בניגוד למחקרים קודמים, שהתמקדו בעיקר בחסימה קבועה של MCA ^{2-4, 10,13.} כצפוי, לא חגג שום הבדלים משמעותיים בדפוסי line של השקה לאחר תקופות איסכמי וreperfusion שונים בC57BL6 / עכברי J. אין שינויים בקוטר כלי דם בין שני חצאים מוח איסכמי וללא איסכמי נצפו, כנראה, שינויים כאלה מתרחשים בזמני reperfusion ארוכים יותר, כלומר לאחר השבץ ¹⁴ 2-3 שבועות. לסיכום, הפרוטוקול שהפגין הוא טכניקה פחות מסובכת, עלות אפקטיבית, שניתן לשחזרו בקלות בהשוואה לזלוף המבוסס הקונבנציונלי לטקס לדמיין vasculature מוחות. זה יכול להיחשב ככלי יעיל לניתוח האנטומיה הברוטו של כולים מוחיים וטריטוריות כלי דם במצבים פיסיולוגיים ופתולוגיים שונים. על ידי שילוב עם TTC מכתים טכניקה זו מספקת הזדמנות חדשה לזיהוי היקף עלבון איסכמי בהקשר של אזורי אספקת כלי דם במוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgments

ברצוננו להודות לריטה Kaltwasser על סיועה המצוין הטכני ומאהש קומאר עומד לספר לארגן הכנת צילומי וידאו.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Scribtol Schwarz (CB2)	Pelican, Germany	221 135
Stempelfarbe (CB1)	Herlitz PBS AG, Germany	10417202
Gedeo Latex	Pebeo, France	13042B