Intravaskulær Perfusjon av Carbon Black Ink lar pålitelig Visualisering av Cerebral Fartøy

Summary

Analyse av gnager cerebrovaskulær anatomi spiller en viktig rolle i eksperimentell slag forskning. I denne sammenheng, har intravaskulær perfusjon med farget lateks vært ansett som en standard verktøy for flere år. Innebærer imidlertid denne teknikken distinkte tekniske begrensninger, som undergraver sin reproduserbarhet. Her beskriver vi en enkel metode for å visualisere cerebrale fartøy i en reproduserbar måte. Injeksjon av en blanding av to kommersielt tilgjengelige karbon svart blekk gjennom venstre myokardielle ventrikkel fører tilstrekkelig fylling av cerebrale kar med høy kontrast visualisering. Vi har med hell brukt denne teknikken for å identifisere Anastomotisk poeng mellom cerebral vaskulær territorier av mus med ulike genetiske bakgrunn. Vi endelig gi bevis for at denne romanen og enkel metode for fartøy farging kan kombineres med triphenyltetrazolium klorid (TTC) farging - et mye brukt verktøy for å observere og analysere infarkt volumer i mus.

Abstract

Den anatomiske strukturen av cerebrale kar er en viktig determinant for hjernen hemodynamikk så vel som alvorlighetsgraden av skade etter ischemiske fornærmelser. Hjernens blodforsyning reagerer dynamisk til ulike patofysiologiske tilstander og det viser betydelige forskjeller mellom stammer og under forhold med genetiske manipulasjoner. I hovedsak er en pålitelig teknikk for intrakraniell fartøy farging avgjørende for å studere patogenesen av hjerneinfarkt. Inntil nylig har et sett av forskjellige teknikker blitt anvendt for å visualisere den cerebrale vaskulatur herunder injeksjon av lettflytende harpiks, Araldite F, gelatin blandet med forskjellige fargestoffer ^en (dvs. karminrød, tusj) eller lateks med ^to eller uten ³ kjønrøk. Perfusjon av hvit latex forbindelsen via oppstigende aorta er først rapportert av Coyle og Jokelainen ^3. Maeda et al. ² har endret protokollen ved å legge carbon svart blekk til latex sammensatt for forbedret kontrast visualisering av skip etter saltløsning perfusjon av hjernen. Imidlertid ineffektiv perfusjon og utilstrekkelig fylling av fartøyene ofte oppleves grunnet høy viskositet av lateksen forbindelse ^4. Derfor har vi beskrevet en enkel og kostnadseffektiv teknikk ved hjelp av en blanding av to kommersielt tilgjengelige karbon svart blekk (CB1 og CB2) for å visualisere den cerebrale vaskulatur i en reproduserbar måte ^5. Vi har vist at perfusjon med CB1 + CB2 i mus resulterer i misfarging av betydelig mindre cerebrale kar på en høyere tetthet i forhold til lateks perfusjon ^5. Her beskriver vi vår protokoll for å identifisere Anastomotisk poeng mellom fremre (ACA) og middels cerebrale arterier (MCA) for å studere fartøy variasjoner i mus med ulike genetiske bakgrunn. Til slutt viser vi mulighetene for teknikken vår i en forbigående fokal cerebral iskemi modell i mus ved å kombinere CB1 +CB2-mediert fartøy farging med TTC flekker i ulike grader av iskemiske skader.

Protocol

1. Dyr

1. Forsøkene ble utført i henhold til NIH retningslinjer for omsorg og bruk av forsøksdyr og godkjent av lokale myndigheter. For alle eksperimenter, C57Bl6 / J villtype mus, ApolipoproteinE ^{- / -} (APOE KO) og SV129 mus (12-16 uker gamle, 26-30 g kroppsvekt, 5-6 dyr per eksperimentelle gruppen) ble brukt.

2. Farging av Cerebral Fartøy med farget Latex

1. Lag en blanding av 25 ul kjønrøk blekk (Herlitz, Tyskland) med 0,5 ml av lateks forbindelse (Pebeo, Frankrike) ved en 1:20 forhold i et EP rør og varme opp blandingen ved 37 ° C i et vannbad. Samle blandingen i en 2 ml sprøyte med en nål på 28-30G før bedøvende dyret.
2. Oppløs 50 mg papavarine hydroklorid pulver inn 1 ml steril normal saltløsning. Samle løsningen i en insulin sprøyte. Bryt av nålen fra en annen steril insulinsprøyte. Plasser denne nålen ved enden av en 20 cm lang PE10 rør. Nå feste denne PE10 rør på nålen på insulin sprøyte med papavarine hydrochloride løsning som skal injiseres via femoral vein å sikre vasodilatasjon og riktig fylling av skip.
3. Forbered ytterligere to insulin sprøyter som hver inneholder 1 ml saltvann. Insulin sprøyter tillate jevn levering av den injiserte fluid ved en presis lokalisering. Imidlertid bør på grunn av høy viskositet av lateks, alternativ 1 ml sprøyter med uttakbare bredere nåler brukes.
4. Ta alle sprøyter og sterilisert dissecting instrumenter nær operativsystemet scenen. Spre et kirurgisk Draper ark rundt driften scenen. Operasjonen stadiet bør være tilstrekkelig belyst og en drifts mikroskop kan brukes om nødvendig.
5. Nå måle kroppsvekt av en C57Bl6 / J mus, og deretter indusere anestesi med 5% fordampes isofluran i 70% N ₂ O og 30% O _2. Fortsett anestesi med 1% av fordampet isofluran. Etter riktig positioning av musen på ryggen og fiksering av beina, vurdere anestesidybden. Deretter kutte huden over venstre femoralvenepunksjon og finn vein. Sett skarpe nålespissen plasseres på PE10 rør og injiser langsomt papavarine hydroklorid oppløsning ved en hastighet på 100 pl pr min (50 mg / kg kroppsvekt).
6. Etter injeksjonen, kutt bukhulen og pierce mellomgulvet. Skjær ribbeina å eksponere hjertet uten å skade eller blåmerke det. Klippe synkende thorakalaorta med en arterie tang. Gjøre en skarp kutt over høyre atrium til tillate veneblod renne ut. Injiser 2 ml saltvann inn i venstre hjertekammer, etterfulgt av å injisere farget lateks manuelt med et lett trykk i 18-20 sek. Bruk ferdigfylte sprøytene etter hverandre. Unngå å injisere noen bobler.
7. Etter injeksjon av lateks, la dyret i 5 min. Halshogge dyret og forsiktig fjerne hele hjernen. Ta godt vare så du ikke skader skipet arkitektur og cortex mens du fjerner skallen bein og hjernehinnene. Plasser hjernen i en 60 mm cellekultur tallerken med 6-8 ml 4% PFA å ta et bilde. Plasser en måling hersker under det gjennomsiktige parabolen. Ta bilder på en 25x forstørrelse av dorsal og ventrale overflaten av hjernen med et kamera festet til drifts-mikroskop. Bilder bør tas ved 90 ° vinkel mellom petriskålen og mikroskopet målet for å kvantifisere den opprinnelige avstand.
8. Gjenta prosedyren i en annen 4-5 dyr.

3. Farging av Cerebral Fartøy med blanding av karbon svart blekk

1. Å sammenligne utfallet av latex baserte cerebral vaskulær farging med protokoll vår, utarbeide en blanding av 100 ul Herlitz Stempelfarbe blekk (CB1) med 900 ul av Pelican Scribtol Schwarz blekk (CB2) i 1,5 ml EP tube. Forbered to EP rør for å lage en total volum på 2 ml blanding av CB1 og CB2 ved et 01:09-forhold. Samle blandingen i to separate insulin sprøyter (1ml hver gang). Cap sprøyter og plassere dem i et vannbad for å varme opp til 37 ° C. Samle 2 ml saltvann i ytterligere to insulin sprøyter, og plassere dem i et vannbad i tillegg.
2. Anesthetize dyret og gjenta den samme fremgangsmåte som beskrevet ovenfor, med unntak for injeksjon av papavarine hydroklorid. Etter injeksjon av 2 ml salaine inn i venstre hjertekammer, injiserer en 2 ml blanding av carbon black blekk istedenfor den fargede lateks. Utføre injeksjoner for hånd med et lett trykk i 18-20 sek per ml. Klippe synkende thorakalaorta før injeksjoner.
3. Ofre dyr, fjerne hjernen og ta bilder.
4. For langsiktig bevaring av hjernen, sette hjernen i 4% PFA natten etterfulgt av inkubasjon med sukrose med gradvis økende konsentrasjon inntil flytende hjernen submerges helt (5% etterfulgt av 15% og deretter 30%). Hjernen dyrene perfusert med den fargede lateks kan også bevares på samme måte.
5. Utførprosedyren i en annen 4-5 dyr. Å sammenligne forskjellen i cerebral vaskulær anatomi på grunn av forskjellige genetisk bakgrunn eller stammer, gjenta protokollen i like mange ApoE KO og SV129 mus, henholdsvis.
6. For å studere den vaskulære anatomi henhold iskemiske betingelser, indusere transient fokal cerebral ischemi i 45 minutter eller 90 minutter i henhold til en standard protokoll for intraluminal okklusjon av MCA under dyp anestesi (en detaljert beskrivelse av operasjonen er utenfor omfanget av denne artikkelen, den leseren omtales Doeppner mfl.., 2010). På slutten av den perioden reperfusion planlagt (1 dag eller 5 dager), utfør vaskulær farging med CB1 + CB2 blekk bare og beis hele hjernen med 2% TTC oppløsning ved 37 ° C i 5-10 minutter til identifisere infarktvolum . TTC er redusert til rødfarget formazanforbindelsen etter mitokondrie enzymer (spesielt succinat dehydrogenase). Etter TTC flekker, metabolsk aktive vev flekker mørkerøde mens infarcted vev gjenstår unstained og vises hvit grunnet dysfunksjonell og denaturert mitokondrie enzymet. Samle inn bilder på samme måte som beskrevet ovenfor.

4. Studie av cerebral vaskulær territorier

1. Å analysere brutto anatomi av cerebrale kar, bilder av dorsal overflaten av hjernen enten farget med farget latex eller CB1 + CB2 blekk kan analyseres med ImageJ programvare (en Java-basert public domain programvare som brukes for bildebehandling og analyse). Hjerner perfusert med farget lateks kan vise varierende grad av fartøy flekker ligger på framsiden, mens CB1 + CB2 perfusjon vil farge alle skipene på både ventral og dorsal overflater.
2. Åpne en bildefil med ImageJ programvare. Identifisere alle Anastomotisk poeng mellom ACA og MCA. En anastomotisk punkt defineres som området hvor fartøyet diameter er den smaleste eller halv avstand mellom de nærmeste grenpunkt til ACA og MCA grener, henholdsvis ^2.
3. Still skalaen i mm. Mål avstanden mellom anastomotisk linje og midtlinjen ved 4 mm kaudal til frontpartiet polen hjernen bruke rett strektegning verktøyet og "måle"-verktøyet. Gjør det samme på 6 mm caudally fra frontpartiet pol. Analyser 3-4 bilder per dyr og beregne middelverdien. Sammenligne verdiene blant ulike grupper av dyr til å identifisere variasjonen av cerebrovaskulær anatomi. I C57Bl6 / J dyr kan anastomotisk linjen mellom ACA og MCA spores nærmere midtlinjen ved 4 mm enn ved 6 mm kaudalt fra frontpartiet pol. APOE KO mus vil presentere noen signifikant forskjell i så måte. Tvert imot, i SV129 musene anastomotisk linjen vil ligge lenger og parallelt med midtlinjen både ved 4 mm og 6 mm kaudalt fra frontpartiet polen.
4. Å analysere vaskulær anatomi in iskemiske tilstander, utføre de samme beregningene som er nevnt ovenfor. Identifisere hjerteinfarkt grensen som den røde og hvite farget vev margin representerer metabolsk aktive vev og nekrotisk unstained vev, henholdsvis. Måle avstanden fra et infarkt grensen fra midtlinjen ved 4 mm og ved 6 mm kaudal fra frontpartiet polen av hjernen. Samle middelverdien 3-4 bilder per dyr. Sammenlikne resultatene mellom ulikt iskemi og reperfusjon perioder.

Representative Results

Protokollen er beskrevet her overvinner de tekniske begrensningene i konvensjonelle latex baserte visualisering av gnager hjernens blodforsyning. Figur 1a viser at følgende perfusjon av den fargede latex, bare de store fartøy på ventral overflaten er farget, forlater hele framsiden unstained. Resultatet er også svært variabel. Bare ett dyr av seks viser delvis farging av ACA og MCA synlig på dorsal overflaten av hjernen (data ikke vist). Omvendt, CB1 + CB2 perfusjon resulterer i tilstrekkelig fylling av både små og store skip i en likestilt måte (Figur 1B). Farging er stabil inntil 7 dager uten noen endring av kvalitet. Bruke ImageJ programmet har vi kvantifisert avstand av de anastomotisk punktene mellom ACA og MCA fra midtlinjen i villtype C57Bl6 / J mus (figur 1C). Vi sammenlignet disse verdiene med APOE KO mus for å observere hvorvidt genetisk modificatipå hadde noen effekt på den regionale vaskulær anatomi (figur 1D). Selv slå ut av APOE ikke påvirke den anatomiske strukturen i cerebrale kar i C57Bl6 / J mus ble en signifikant forskjell merke mellom C57bl/6J og SV129 stammer (figur 1E, F). Således, er vi i stand til å vise gjennomførbarheten av denne farging protokollen å evaluere de anatomiske forskjeller fra den cerebrale vaskulatur grunn av genetiske eller belastning forskjeller i mus.

I eksperimentelle gnager takts modellene er TTC flekker mye brukt til å observere hjerteinfarkt volum. Samtidig visualisering av cerebrale kar og infarkt volum gir oss mulighet til å analysere morfologiske endringer etter iskemi-reperfusjon. Derfor har vi bekreftet hvorvidt CB1 + CB2-mediert vaskulær farging var stabilt med TTC flekker i ulike grader av iskemisk-reperfusjon skader (Figur 2A-H). Vi har videre analysert anastomotisk punktene mellom ACA og MCA etter 45 minutter eller 90 minutter av iskemi matchet med enten 1 dag eller 5 dager reperfusjon perioder (figur I, J). Som forventet, viste den midlere avstanden mellom midtlinjen og anastomotisk punkter ikke signifikant forskjell mellom gruppene (figur 2I, J), og var i det samme området med ikke-ischemiske dyr (figur 1F). Varierte imidlertid avstanden fra midtlinjen til infarkt grensen betydelig, noe som reflekterer den økte infarkt volumet med større grad av iskemi-reperfusjonsskade (Figur 2K, L). Disse dataene viser at CB1 + CB2 farging kan reproduseres i dyrene utsettes for forskjellige grader av iskemi-reperfusjonsskade og stabiliteten av farging når det kombineres med TTC farging.

374/4374fig1.jpg "/>
Figur 1. Observasjon av cerebral vaskulær anatomi hos mus med genetiske og press forskjeller. Figur 1a viser at intravaskulær perfusjon av fargede latex bare flekker store fartøyer på ventral overflaten, mens framsiden forblir unstained. Omvendt, CB1 + CB2 perfusjon resulterer i permanent farging av både små og store fartøy på ventrale og dorsale overflater av hjernen (figur 1B). Kvantifisering av avstanden av de anastomotisk punktene mellom fremre cerebral arterie (ACA) og den midtre cerebral arterie (MCA) fra midtlinjen i villtype C57Bl6 / J mus (figur 1C) viser ingen forskjell med deres genetisk mutant apoE KO motstykker (Figur 1D). Betydelig forskjell merke mellom C57Bl6 / J og SV129 stammer (Figur 1E, F). Målestokk = 2mm. * Signifikant forskjellig fra både C57BL6 / J villtype og APOE KO mus ved 4mm, p p <0,01.

Figur 2. Analyse av vaskulær anatomi i ischemiske hjerner. Figur 2A-H viser bilder av de ventrale og dorsale overflater av hjernen underkastet 45 minutter eller 90 minutter iskemi etterfulgt av en dag eller 5 dager reperfusion tid. Det venstre panelet viser CB1 + CB2 mediert vaskulær farging, mens det høyre panelet viser kombinasjon av både vaskulære farging og TTC farging, indikerer stabiliteten av vaskulære farging i forskjellige grader av iskemisk-reperfusjon skader (Figur 2A-H). Analyse av anastomotisk punktene mellom fremre cerebral arterie (ACA) og den midtre cerebral arterie (MCA) etter 45 minutter eller 90 minutter iskemi matchet med enten 1 dag eller 5 dager reperfusion periode depikterne ingen signifikant forskjell mellom gruppene (Figur 2I, J). Imidlertid kan betydelig forskjell noteres i avstanden fra midtlinjen til infarkt grensen, indikerer økningen av infarkt volum med høyere grad av iskemi-reperfusjonsskade (Figur 2K, L). Målestokk = 2 mm. * Signifikant forskjellig fra 45 min iskemi med 1 dag reperfusjon, p <0,05, og ** 5 dager reperfusjon, p <0,01. Klikk her for å se større figur .

Discussion

Perfusjon av CB1 + CB2 ved manuell injeksjon kan utføres med hell av uten intensiv trening som det ikke innebærer noen spesiell enhet for å antyde bestemt trykk ^2,3. Heterogene perfusjon utfall i protokollen vår er også ubetydelig. Bare 1 dyr ut av 16 ikke-iskemisk dyr og 3 av 20 iskemiske dyr har vist ufullstendig perfusjon. I disse tilfellene var inkorporering av bobler under saltvann perfusjon fører til okklusjon av fartøy sannsynligvis grunnen av mislykkede utfallet.

Selv perfusjon av lateks har opprinnelig blitt utført gjennom oppstigende aorta ^2,3, er alternative ruter av perfusjon også rapportert inkludert venstre hjertekammer ^7,8 eller den felles halsarterie ^9. Vi fant ingen signifikant forskjell i resultatene etter perfusjon gjennom enten stigende aorta eller venstre ventrikkel (upubliserte observasjoner). Som sådan var sistnevntevalgt på grunn av sin lettere tilgjengelighet.

Før du velger de spesifikke karbon svart blekk som er nevnt i denne studien har vi evaluert resultatene av intravaskulær perfusjon med en rekke kommersielt tilgjengelige karbon svart blekk. CB1 og CB2 er valgt for sin perfusjon effektivitet og stabilitet av farging. CB1 har meget lav viskositet (1,1 mPa / sek) inneholdende 2,1% kjønrøk, mens CB2 - opprinnelig produsert som et kalligrafi blekk - inneholder 2,5% kjønrøk med en høyere viskositet (10-50 mPa / s). Individuell anvendelse av disse blekk er funnet å være utilstrekkelig hensyn både effektivitet og stabilitet av farging. Derfor har vi kombinert blekk og titreres kombinasjonen forholdstall. Perfusjon med CB1: CB2 på en 01:09 ratio resulterer i permanent farging av både store og små fartøy. Derfor kan arterielle anastomose poeng lett spores til å definere krysset mellom to vaskulære territorier, dvs.. ACA og MCA. Disse findings er i samsvar med tidligere rapporter ^2,10,11.

APOE KO mus presentere 5-8 ganger høyere plasmakolesterolnivået og er svært utsatt for å utvikle atherosclerosis da satt på kolesterol kosthold ^12. Hvorvidt genmodifisering også påvirker anatomi cerebrale kar har ikke blitt rapportert ennå. På den annen side, er SV129 mus allerede rapportert å presentere større infarkt volum i forhold til C57Bl6 / J mus på grunn av deres forskjellige vaskulær anatomi ^2. Vi bekreftet vår protokoll i disse tre grupper av dyr for å sammenligne forskjellen i vaskulær anatomi.

Å validere farging protokollen i iskemiske hjerne, involverte vi forbigående fokale cerebral iskemi å inkludere effekter av reperfusjon i motsetning til tidligere studier, som i hovedsak fokusert på permanent okklusjon av ^{2-4 MCA, 10,13.} Som forventet, vi ikke observere noen signifikante forskjeller i mønsteret av line av anastomose etter ulike iskemiske og reperfusjon perioder i C57BL6 / J mus. Ingen endringer i fartøyets diametre mellom den ischemiske og ikke-ischemiske halvkuler ble observert, formodentlig, slike forandringer oppstår ved lengre reperfusjon ganger, dvs 2-3 uker etter hjerneslag ^14. Som konklusjon, er protokollen demonstrert av oss en mindre komplisert, kost-effektiv teknikk, som lett kan reproduseres i forhold til konvensjonell latex basert perfusjon å visualisere hjernens blodforsyning. Det kan betraktes som et effektivt verktøy for å analysere brutto anatomi av cerebrale kar og vaskulære territorier i ulike fysiologiske og patologiske forhold. Ved å kombinere med TTC farging denne teknikk gir en ny mulighet for å identifisere omfanget av en iskemisk fornærmelse i sammenheng av vaskulære forsyning soner i hjernen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Scribtol Schwarz (CB2)	Pelican, Germany	221 135
Stempelfarbe (CB1)	Herlitz PBS AG, Germany	10417202
Gedeo Latex	Pebeo, France	13042B