Karbon Siyah Mürekkep İntravasküler Perfüzyon Serebral Gemiler Güvenilir Görselleştirme verir

Summary

Kemirgen serebrovasküler anatomi Analiz deneysel inme araştırmalarında önemli bir rol oynar. Bu çerçevede, renkli lateks ile intravasküler perfüzyon birkaç yıldır standart bir araç olarak kabul edilmiştir. Ancak, bu tekniğin tekrarlanabilirliği zayıflatmak farklı teknik sınırlamaları, ifade eder. Burada, tekrarlanabilir bir şekilde beyin damarlarının görselleştirmek için basit bir yöntem tarif. Yüksek kontrast görselleştirme ile beyin damarlarının yeterli dolgu sol ventrikül miyokard sonuçları ile iki ticari karbon siyah mürekkepler karışımı Enjeksiyon. Biz başarıyla farklı genetik geçmişleri olan farelerin serebral vasküler ülkelerle arasındaki anastomoz noktaları belirlemek için bu tekniği uyguladık. Farelerde infarkt hacimleri gözlemlemek ve analiz etmek için yaygın olarak kullanılan bir araçtır - Sonunda geminin boyanması için bu yeni ve basit bir yöntemdir Triphenyftetrazoliumchlorid (TTC) boyama ile kombine edilebilir olduğunu ifade vermek.

Abstract

Beyin damarlarının anatomik yapısı beyin hemodinami için önemli bir belirleyici yanı sıra iskemik hakaret takip yaralanma şiddeti olduğunu. Beyin damarlarında dinamik çeşitli patofizyolojik devletler yanıt verir ve suşları arasındaki genetik manipülasyon koşullarında önemli farklılıklar sergilemektedir. Esasen, intrakraniyal damar boyama için güvenilir bir tekniktir iskemik inme patogenezinde çalışmak için esastır. Yakın zamana kadar, farklı teknikler bir dizi düşük viskoziteli reçine, araldit F enjeksiyonunu içeren beyin damarlarında, jelatin ² veya siyah ³ karbon olmadan çeşitli boyalar ¹ (yani karmin kırmızı, çini mürekkebi) veya lateks ile karıştırılır. Görselleştirmek için istihdam edilmiştir Asendan aorta yoluyla beyaz lateks bileşik Perfüzyon ilk Coyle ve Jokelainen ³ tarafından rapor edilmiştir. Maeda et al. ² karbo ekleyerek değiştirilmiş olan protokolbeynin fizyolojik perfüzyon sonrası damarlarının gelişmiş kontrast görselleştirme için lateks bileşik n siyah mürekkep. Ancak, verimsiz perfüzyon ve gemilerin yetersiz dolum sık lateks bileşik ⁴ yüksek viskozitesi nedeniyle yaşanmaktadır. Bu nedenle, bir tekrarlanabilir bir şekilde ⁵ beyin damarlarında görselleştirmek için ticari olarak satılan iki karbon siyah mürekkep (CB1 ve CB2) oluşan bir karışım kullanılarak bir basit ve düşük maliyetli bir teknik tarif var. Biz lateks perfüzyon ⁵ ile karşılaştırıldığında daha yüksek bir yoğunlukta önemli ölçüde daha küçük beyin damarlarının boyama farelerde sonuç CB1 + CB2 ile bu perfüzyon göstermiştir. Burada, anterior (ACA) ve farklı genetik geçmişleri olan farelerde damar değişikliklerin incelenmesi orta serebral arter (MCA) arasındaki anastomoz noktaları belirlemek için protokol açıklar. Son olarak, CB1 birleştirerek farelerde bir geçici fokal serebral iskemi modelinde, bizim teknik olarak uygulanabileceğini göstermek +Iskemik yaralanma çeşitli derecelerde TTC boyama ile CB2-aracılı damar boyama.

Protocol

1. Hayvanlar

1. Deneyler laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için NIH kılavuzunda göre yürütülen ve yerel otoriteler tarafından onaylanmıştır. Tüm deneyler için, C57Bl6 / J yabani tip fareler, Apolipoprotein ^{- / -} (ApoE KO) ve (12-16 haftalık, 26-30 g vücut ağırlığı, deneysel grup başına 5-6 hayvan) SV129 fareler kullanılmıştır.

2. Renkli Latex ile Serebral Gemiler Boyanması

1. EP bir tüp içinde bir 01:20 oranında lateks bileşiğin 0.5 ml (Pebeo, Fransa) ile 25 ul karbon siyah mürekkep (Herlitz, Almanya) oluşan bir karışım hazırlayın ve bir su banyosu içinde 37 ° C 'de karışım ısıtın. Hayvan bayıltmadan önce 28-30G bir iğne ile bir 2 ml şırınga içinde karışım toplayın.
2. Steril serum fizyolojik 1 ml içine papavarine hidroklorür toz 50 mg çözülür. Bir insülin şırınga çözümü toplayın. Başka steril insülin şırınga iğne kopartıp. Bir 20 ° C sonunda bu iğne yerleştirinm uzunluğunda PE10 tüp. Şimdi vazodilatasyon ve damarların uygun dolgu sağlamak için femoral ven yoluyla enjekte edilecek papavarine hidroklorür solüsyonu içeren insülin şırınga iğnesi bu PE10 tüp takın.
3. Başka bir iki insülin şırıngası tuzlu her birini içeren 1 ml hazırlayın. İnsülin iğneleri kesin bir yerde enjekte edilen sıvı düzgün teslimat sağlar. Ancak, lateks, alternatif hareketli daha geniş bir iğne ile 1 ml şırınga yüksek viskoziteye bağlı olarak kullanılmalıdır.
4. İşletme aşamasında yakın tüm şırınga ve steril kesme aletleri alın. Operasyon sahne etrafında bir cerrahi manifaturacı levha yayın. Işlem aşama yeterince ışıklı edilmesi ve gerekirse bir ameliyat mikroskobu kullanılabilir.
5. Şimdi bir C57Bl6 / J fare vücut ağırlığı ölçmek ve daha sonra% 5% 70 N ₂ O ve% 30 O ₂ izofluran buharlaşmış anestezi neden. Buharlaşmış izofluran% 1 ile anestezi devam edin. Uygun Positionin sonraekstremitelerin sırtını ve fiksasyon üzerinde fare g, anestezi derinliği değerlendirmek. Sonra sol femoral ven üzerinde cilt kesmek ve damar bulun. PE10 boru üzerine yerleştirilen iğne sivri ucu takın ve yavaş yavaş dakika başına 100 ul (50 mg / kg vücut ağırlığı) bir oranda papavarine hidroklorür çözelti enjekte edilir.
6. Enjeksiyonu takiben karın boşluğu ve delgi diyafram kesti. Bu zarar veya morarma olmadan kalp açığa kaburga kesin. Bir arter forsepsi ile inen torasik aorta klipsleyin. Venöz kan dışarı akmasını sağlamak için sağ atrium üzerinde keskin bir kesim olun. 18-20 sn üzerinde hafif basınç ile elle renkli lateks enjekte ardından, sol ventrikül içine serum fizyolojik 2 ml enjekte edilir. Önceden doldurulmuş şırıngalar birbiri ardına kullanın. Herhangi kabarcıklar enjekte kaçının.
7. Lateks enjeksiyonundan sonra 5 dakika için hayvan bırakın. Hayvan başını kesmek ve dikkatlice tüm beyin çıkarın. Gemi mimarisi ve corte kesmemeye iyi bakx kafatası kemiği ve meninks çıkarırken. Fotoğraf çekmek için% 4 PFA 6-8 ml'lik 60 mm hücre kültür çanak beyin yerleştirin. Şeffaf çanak altında bir ölçüm cetvel yerleştirin. Operasyon mikroskobu bağlı bir kamera ile dorsal ve beynin ventral yüzeyi bir 25x büyütme fotoğraflar çekin. Resimler orijinal mesafeyi ölçmek amacıyla Petri kabı ve mikroskop objektif arasındaki 90 ° açıyla alınmalıdır.
8. Başka 4-5 hayvanlarda işlemi tekrarlayın.

3. Karbon Siyahı Mürekkepler karışımı ile Serebral Gemiler Boyanması

1. Bizim protokol ile lateks bazlı serebral vasküler boyanma sonuçlarını karşılaştırmak için, bir 1.5 ml EP tüp Pelican Scribtol Schwarz mürekkep (CB2) 900 ul Herlitz Stempelfarbe mürekkep (CB1) 100 ul karışımı hazırlayın. Bir 01:09 oranında CB1 ve CB2 2 ml karışımının bir toplam hacim yapmak için iki EP tüp hazırlanır. Iki ayrı insülin şırıngası (1 içinde karışım toplayınml her). 37 ° C'ye kadar ısınmasını şırınga kap ve su banyosu koyun Başka iki insülin şırıngaları salin 2 ml toplayın, ve de bir su banyosunda koyun.
2. Hayvan anestetize ve papavarine hidroklorür enjeksiyon için haricinde yukarıda açıklandığı gibi aynı prosedür tekrarlayın. Sol ventrikül içine 2 ml salaine enjeksiyonu takiben, karbon siyah mürekkep yerine renkli bir lateks 2 ml karışımı enjekte edilir. Ml başına 18-20 sn üzerinde hafif basınç ile elle enjeksiyonları gerçekleştirin. Enjeksiyonları öncesinde inen torasik aorta klipsleyin.
3. Hayvan Kurban, beyin çıkarın ve fotoğraf çekmek.
4. Yüzen beyin tamamen submerges kadar beynin uzun süreli korunması için, (% 5% 15 izledi ve ardından% 30) giderek artan konsantrasyon ile sukroz ile inkübasyon PFA gecede izledi% 4 beyin koymak. Renkli lateks ile perfüze hayvanların beyinlerinin de aynı şekilde muhafaza edilebilir.
5. GerçekleştirinBaşka 4-5 hayvanlarda prosedürü. Farklı genetik arka plan veya suşları nedeniyle serebral vasküler anatomi farkı karşılaştırmak için, sırasıyla, ApoE KO ve SV129 farelerin eşit sayıda protokol tekrarlayın.
6. Derin anestezi (cerrahi ayrıntılı bir açıklama bu makalenin kapsamı dışındadır altında MCA intraluminal tıkanıklığı standart bir protokole göre 45 dakika veya 90 dakika boyunca geçici fokal serebral iskemi neden, iskemik koşullarda vasküler anatominin incelenmesi; okuyucu Doeppner ve diğ., 2010) ifade edilir. Infarkt hacmi tanımlamak için reperfüzyon dönemi (1 gün veya 5 gün) planlanan sonunda, CB1 + CB2 mürekkepler yalnızca vasküler boyanma gerçekleştirmek ve 5-10 dakika süreyle 37 ° C'de% 2 TTC çözeltisi ile tüm beyin leke . TTC mitokondrial enzimler (özellikle süksinat dehidrogenaz) tarafından kırmızı renkli formazan düşürülür. TTC boyama sonra, enfarkte doku unstai derin kırmızı metabolik olarak aktif doku lekeleri kalırkenned ve nedeniyle işlevsiz ve denatüre mitokondrial enzim beyaz görünür. Yukarıda tarif edildiği gibi aynı şekilde görüntü toplayın.

4. Serebral Vasküler Toprakları Çalışması

1. Serebral damarlar, + CB2 mürekkepler ImageJ yazılım (görüntü işleme ve analiz için kullanılan bir Java tabanlı kamuya açık yazılım) ile analiz edilebilir renkli lateks veya CB1 ile beyin ya lekeli dorsal yüzeyinin görüntülerin gros anatomisinin analiz etmek. CB1 + CB2 perfüzyon ventral ve dorsal yüzeyleri hem tüm gemiler leke olurken renkli lateks ile perfüze edilen beyinler, dorsal yüzeyi üzerinde bulunan geminin boyanması değişik derecelerde gösterebilir.
2. ImageJ yazılım ile bir resim dosyası açın. ACA ve MCA arasındaki tüm anastomoz noktaları belirleyin. Anastomotik nokta damar çapı en dar ya da sırasıyla ACA en yakın dallanma noktaları ve MCA dalları arasındaki yarı mesafe, ^2, yer olarak tanımlanır.
3. Mm çaplı ayarlayın. Anastomoz hattı ve düz hat çizim aracı ve "ölçü" aracını kullanarak beynin frontal kutup kaudal 4 mm orta hat arasındaki mesafeyi ölçün. Kaudal frontal kutbundan 6 mm aynısını yapın. Hayvan başına 3-4 görüntüleri analiz eder ve ortalama değer hesaplayabilirsiniz. Serebrovasküler anatomi varyasyonu belirlemek için hayvanların farklı gruplar arasındaki değerleri karşılaştırın. C57Bl6 / J hayvanlarda, ACA ve MCA arasındaki Anastomoz hattı kaudal frontal kutbundan 6 mm den 4 mm daha yakın orta hat izlenebilmektedir. ApoE KO fareler bu açıdan anlamlı farklılık sunacak. Aksine, SV129 farelerde anastomoz hat ön kutup kaudale ileri ve 4 mm orta hattı hem de paralel ve 6 mm ortaya çıkacaktır.
4. Vasküler anatominin analiz etmek in iskemik durumlar, yukarıda belirtilen aynı hesaplamaları yapar. Sırasıyla, metabolik olarak aktif doku ve nekrotik unstained doku temsil kırmızı ve beyaz renkli doku marjı olarak infarktüsü sınır belirleyin. 4 mm ve beynin ön direğe yerden kaudal 6 mm orta hattan infarktüsü sınırın mesafeyi ölçün. Hayvan başına 3-4 görüntüleri ortalama değer toplayın. Farklı iskemi ve reperfüzyon dönemleri arasında sonuçları karşılaştırın.

Representative Results

Burada açıklanan protokol kemirgen beyin damarlarında geleneksel lateks bazlı görselleştirme teknik kısıtlamaların üstesinden gelmektedir. Şekil 1A renkli lateks bu aşağıdaki perfüzyon göstermektedir, ventral yüzeyi üzerinde sadece büyük damarlarda tüm dorsal yüzeyini renksiz bırakarak boyanmıştır. Sonuç da oldukça değişkendir. Beyin (veriler gösterilmemiştir) dorsal yüzeyinde görünür ACA ve MCA kısmi boyama altı gösterileri dışında sadece bir hayvan. Tersine, CB1 + eşit bir şekilde (Şekil 1B) küçük ve büyük damarların yeterli dolum CB2 perfüzyon sonuçları. Boyama kalitesinde herhangi bir değişiklik yapmadan 7 gün kadar stabildir. ImageJ programı kullanarak, vahşi tip C57Bl6 / J farelerde (Şekil 1C) olarak orta hattan ACA ve MCA arasındaki anastomoz noktalarının mesafe sayısal var. Biz olsun veya olmasın genetik MODIFIKASY gözlemlemek ApoE KO fareleri bu değerleri karşılaştırıldığındailgili bölgesel vasküler anatomi (Şekil 1D) üzerinde herhangi bir etkisi vardı. ApoE arasında nakavt C57Bl6 / J farelerde beyin damarlarının anatomik yapısını etkileyen vermedi, ancak anlamlı bir fark C57BL/6J ve SV129 suşları (Şekil 1E, F) arasındaki fark edildi. Böylece, farelerin genetik ya da gerginlik farkları nedeniyle beyin damarlarında anatomik farklılıkları belirlemek için bu boyama protokolü uygulanabilirliğini göstermek mümkündür.

Deneysel kemirgen inme modelinde, TTC boyama yaygın olarak enfarktüs hacmi gözlemlemek için kullanılır. Serebral damarlar ve enfarktüs hacmi Simultane görselleştirme bize iskemi-reperfüzyon sonrası morfolojik değişiklikler analiz için fırsat verin. Bu nedenle, + CB2-aracılı vasküler boyanma iskemik-reperfüzyon yaralanmaları (Şekil 2A-H) çeşitli derecelerde TTC boyama ile istikrarlı CB1 olmadığını doğruladıktan. Biz daha anastomoz analiz ettik ACA ve MCA arasındaki puan iskemi 45 dakika veya 90 dakika 1 gün veya 5 gün reperfüzyon döneminde (Şekil I, J) biriyle eşleşen sonra. Beklendiği gibi, orta hat ve anastomoz noktaları arasındaki ortalama mesafe gruplar arasında anlamlı bir fark (Şekil 2I, J) gösterdi ve iskemik olmayan hayvanlar (Şekil 1F) ile aynı aralıkta idi. Ancak, orta hattan infarktüsü sınırına uzaklığı iskemi-reperfüzyon hasarının daha yüksek (Şekil 2K, L) ile artan enfarktüs hacmini yansıtan anlamlı fark vardı. Bu veriler CB1 + CB2 boyama TTC boyama ile kombine edildiğinde iskemi-reperfüzyon hasarı ve boyanma istikrar değişik derecelerde maruz hayvanlarda ortaya çıktığını göstermektedir.

374/4374fig1.jpg "/>
Şekil 1. Dorsal yüzeyi boyanmadan kalırken genetik ve strain farklılıklar farelerde serebral vasküler anatominin Gözlem. Şekil 1A, renkli lateks sadece lekeler ventral yüzeyi üzerinde büyük gemiler bu intravasküler perfüzyon gösterir. Tersine, ventral üzerinde küçük ve büyük damarları ve beyin (Şekil 1B) dorsal yüzeyleri hem kalıcı boyama CB1 + CB2 perfüzyon sonuçları. Anterior serebral arter (ACA) ve yabani tip C57Bl6 / J farelerde (Şekil 1C) olarak orta hattan orta serebral arter (MCA) arasındaki anastomoz noktalarının mesafe Kantifikasyonu kendi genetik mutant ApoE KO meslektaşları (Şekil hiçbir farklılık göstermemektedir 1D). Ancak, önemli bir fark C57Bl6 / J ve SV129 suşları (Şekil 1E, F) arasında fark edilir. Ölçek bar = 2mm. P 4mm az C57BL6 / J yabani tip ve ApoE KO fareler hem * Önemli ölçüde farklı p <0.01 de **.

Şekil 2. Beyin ventral ve dorsal yüzeyleri iskemik beyinlerinde vasküler anatominin incelenmesi. Şekil 2A-H gösterisi görüntüleri 1 gün veya 5 gün reperfüzyon zamanı ardından 45 dakika veya 90 dakika iskemi tabi. Sağ panelde iskemik-reperfüzyon yaralanmaları (Şekil 2A-H) çeşitli derecelerde vasküler boyanma istikrar gösteren, vasküler boyanma ve TTC boyama ikisinin birleşimini gösterir ise Sol panelde, CB1 + CB2 aracılı vasküler boyanma gösterir. Anterior serebral arter (ACA) ve ya 1 gün veya 5 gün reperfüzyon döneminde de ile eşleşen 45 dakika ya da 90 dakika iskemi sonra orta serebral arter (MCA) arasındaki anastomoz noktalarının Analizigruplar arasında anlamlı bir fark (Şekil 2I, J) Picts. Ancak, önemli bir fark iskemi-reperfüzyon hasarının daha yüksek (Şekil 2K, L) ile infarktüsü hacim artışı gösteren, orta hattan infarktüsü sınırına mesafe kaydedilmiştir. Ölçek bar = 2 mm. 1 gün reperfüzyon, p <0.05 ve ** 5 gün reperfüzyon, p <0.01 ile 45 dk iskemi * from Anlamlı farklı. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Discussion

Bu belli bir basınç ^2,3 ima için herhangi bir özel cihaz içermeyen manuel olarak enjeksiyon ile CB1 + CB2 perfüzyon yoğun bir eğitim olmadan ile başarılı bir şekilde gerçekleştirilebilir. Bizim protokol perfüzyon sonuçların heterojenliği azdır. 20 iskemik hayvanlar üzerinden sadece 1 16 iskemik olmayan hayvanların üzerinden hayvan ve 3 yetersiz perfüzyon göstermiştir. Bu durumlarda, damarların tıkanması neden tuzlu perfüzyon sırasında kabarcıklarının eklenmesi başarısız sonucun nedeni büyük olasılıkla.

Lateks perfüzyon başlangıçta aort ^2,3 yoluyla yürütülen olmasına rağmen, perfüzyon alternatif rotalar da sol ventrikül ^7,8 veya karotis arter ⁹ dahil olmak üzere rapor edilir. Biz aorta veya sol ventrikül (yayınlanmamış gözlemler) aracılığıyla ya sonuçların ardından perfüzyon anlamlı bir fark bulunamadı. Bunun gibi, ikinci olduonun daha kolay erişilebilirlik nedeniyle seçilmiştir.

Bu çalışmada belirtilen spesifik karbon siyah mürekkepler seçmeden önce, biz piyasada bulunan karbon siyah mürekkepler bir dizi ile intravasküler perfüzyonun sonuçları değerlendirilmiştir. CB1 ve CB2 boyanma kendi perfüzyon verimlilik ve istikrar için seçilir. Aslında bir kaligrafi mürekkep olarak üretilmektedir - - yüksek viskoziteli (10-50 mPa / s) ile siyah% 2,5 karbon içeren CB1 CB2 ise% 2,1 karbon siyahı içeren çok düşük viskoziteli (1.1 mPa / sn) vardır. Bu mürekkeplerin Bireysel başvuru boyama verimliliği ve istikrarı hem de ilgili yetersiz olduğu tespit edilmiştir. Sonuç olarak, mürekkep bir araya getirilmiş ve kombinasyon oranlarını titre olmayabilir. Büyük ve küçük damarlar hem kalıcı boyama bir 1:09 oranı sonuçlara CB2: CB1 ile Perfüzyon. Bu nedenle, arteriyel anastomoz noktaları kolayca iki vasküler toprakları, yani arasındaki bağlantı tanımlamak için izlenebilir. ACA ve MCA. Bu findings önceki raporlarda ^2,10,11 ile tutarlıdır.

ApoE KO fareler 5-8 kat daha yüksek plazma kolesterol düzeyi sunmak ve kolesterol bakımından zengin diyet ¹² koyduğunuzda ateroskleroz gelişen son derece duyarlıdırlar. Genetik modifikasyon da beyin damarlarının anatomisi etkiler olsun henüz bildirilmemiştir. Diğer taraftan, SV129 fareler zaten farklı damar anatomi ² dolayı C57Bl6 / J fareler ile karşılaştırıldığında, daha büyük bir enfarktüs hacmi mevcut olduğu bildirilmiştir. Biz vasküler anatomi farkı karşılaştırmak için hayvanların bu üç grup bizim protokolü doğrulandı.

Iskemik beyinlerinde boyama protokolü doğrulamak için, biz esas olarak MCA ^{2-4, 10,13} kalıcı oklüzyon odaklanan önceki çalışmalarda, aksine reperfüzyon etkilerini içerecek şekilde geçici fokal serebral iskemi dahil. Beklendiği gibi, biz l desen anlamlı bir fark bulamamışlardırC57BL6 / J farelerde farklı iskemik ve reperfüzyon dönemleri sonrası anastomoz ine. Iskemik ve non-iskemik hemisfer arasında damar çaplarında değişiklik yok gözlendi, muhtemelen, bu tür değişikliklerin daha uzun reperfüzyon zamanlarda gerçekleşen, yani 2-3 hafta ¹⁴ inme sonrası. Sonuç olarak, bize gösterdiği protokolü kolay beyin damarlarında görselleştirmek için konvansiyonel lateks bazlı perfüzyon göre çoğaltılabilir bir az karmaşık, maliyetli bir tekniktir. Bu farklı fizyolojik ve patolojik koşullarda serebral damarlar ve damar topraklarının gros anatomisinin analiz etmek için etkili bir araç olarak kabul edilebilir. TTC Bu teknik boyama ile birleştirerek beyinde vasküler tedarik bölgeleri bağlamında bir iskemik hakaret ölçüde tanımlamak için yeni bir fırsat sunuyor.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Scribtol Schwarz (CB2)	Pelican, Germany	221 135
Stempelfarbe (CB1)	Herlitz PBS AG, Germany	10417202
Gedeo Latex	Pebeo, France	13042B