カーボンブラックインクの血管内灌流は脳血管の信頼性の高い可視化を可能に

Summary

げっ歯類の脳の解剖学的構造の分析は、実験的な脳卒中の研究に重要な役割を果たしている。この文脈において、着色ラテックスと血管内血流は数年のための標準ツールとして考えられてきた。しかし、この技術は、その再現性を弱体化させる明確な技術的な限界を意味しています。ここでは、再現可能な方法で脳の血管を可視化するための簡単​​な方法を説明します。高コントラストの可視化と脳血管の適切な充填における左心室の心筋の結果を介して2つの市販のカーボンブラックインクの混合物の注入。我々は、正常に異なる遺伝的背景をもつマウスの脳血管地域間吻合のポイントを識別するためにこの手法を適用している。マウスでの梗塞体積を観察し、分析するための広く使用されているツール - 我々は最終的に血管染色にこの小説と単純な方法は、塩化トリフェニルテトラゾリウム（TTC）染色と組み合わせることができるという証拠を与える。

Abstract

脳血管の解剖学的構造は、脳の血行動態を決定する主要因だけでなく、虚血性侮辱後に損傷の重症度である。脳血管系は、動的にさまざまな病態生理学的な状態に応答し、それが系統間および遺伝子操作の条件下でかなりの相違を示す。本質的には、頭蓋内血管染色のための信頼性の高い技術は、虚血性脳卒中の病因を研究するために不可欠です。最近まで、さまざまなテクニックの集合は低粘度の樹脂の射出を含む脳血管系を可視化するために用いられてきた、アラルダイト、F、ゼラチン²または黒³個の炭素ことなく、様々な染料^1（ すなわちカーミン赤、墨）やラテックスと混合。上行大動脈を通して白いラテックス化合物の灌流は、まずコイルとJokelainen ³によって報告されている。前田ら ²炭を追加することにより、プロトコルを変更した脳の生理食塩水を灌流後の血管の改善されたコントラストの可視化のためのラテックス化合物からn黒インク。しかしながら、非効率的な血流と血管の不十分な充填が頻繁にラテックス化合物⁴の高粘度のために経験している。そこで我々は、再現可能な方法で⁵脳血管系を可視化するために2つの市販のカーボンブラックインク（CB1およびCB2）の混合物を用いて、シンプルで費用対効果の高い手法を説明してきました。我々は、ラテックス灌流⁵と比較して高い密度で有意に小さい脳血管を染色したマウスの結果におけるCB1 + CB2でその血を示している。ここでは、前方（ACA）および異なる遺伝的背景を有するマウスの血管の変化を研究するために、中大脳動脈（MCA）の間に吻合ポイントを識別するために、我々のプロトコルについて説明します。最後に、我々は、CB1を組み合わせることにより、マウスにおける一過性局所脳虚血モデルにおいて、本手法の実現可能性を実証+虚血性損傷の様々な程度のTTC染色によるCB2媒介血管染色。

Protocol

1。動物

1. 実験は、実験動物の管理と使用のためのNIHのガイドラインに従って実施され、地元当局によって承認された。すべての実験は、C57BL6 / J野生型マウスでは、ApolipoproteinE ^{- / - （}アポKO）とSV129マウス（12-16週齢、26〜30グラムの体重、実験群当たり5から6匹）を使用した。

2。着色ラテックスと脳血管の染色

1. EP管で1:20の割合でラテックス化合物の0.5ミリリットル（Pebeo、フランス）と25μlのカーボンブラックインク（Herlitz、ドイツ）の混合物を準備し、水浴中で37℃で混合物を温める。動物をanaesthetizing前に28-30Gの針で2 ml注射器内の混合物を収集します。
2. 滅菌生理食塩水1mlにpapavarine塩酸塩の粉末50mgを溶解します。インスリン注射器で液を収集する。別の無菌のインスリン注射器から針を折ります。 20 cの終わりにこの針を置きメートル長いPE10チューブ。今すぐ血管拡張と血管の適切な充填を確実にするために大腿静脈を介して注入するpapavarine塩酸溶液を含むインスリン注射器の針でこのPE10チューブを取り付けます。
3. 別の2つのインスリン注射器に生理食塩水をそれぞれ含む1ミリリットルを用意します。インスリン注射器は、正確な位置での注入された流体のスムーズな配信を可能にします。しかし、ラテックスの高粘度のために、取り外し可能な広い針で代替1ミリリットル注射器を使用する必要があります。
4. オペレーティングステージに近く、すべての注射器や滅菌解剖器具を取る。運転段階の周りに手術ドレイパーシートを広げた。運転段階が十分に照らされるべきであり、必要に応じて手術用顕微鏡を用いてもよい。
5. 今すぐC57BL6 / Jマウスの体重を測定し、次いで、5％、70％、N ₂ O、30％O ₂中イソフルラン気化麻酔を誘導する。気化イソフルランの1％で麻酔を続行します。適切positionin後に手足のその背中と固定上でマウスのグラム、麻酔の深さを評価する。次に、左大腿静脈上の皮膚を切り取って、静脈の位置を確認します。 PE10チューブ上に配置され、針の尖った先端を挿入し、ゆっくり分当たり100μl（50 mg / kg体重）の速度でpapavarine塩酸塩溶液を注入します。
6. 注射後、腹腔とピアスダイアフラムを切った。それを傷つけたり、あざができずに心臓を露出するためにリブをカットします。動脈鉗子で胸部下行大動脈をクリップ。静脈血を流出可能にするために、右心房オーバー鋭いカットを行います。 18から20秒以上、わずかな圧力を使用して手動で着色ラテックスを注入し、続いて左心室に生理食塩水2mlを注入します。プレフィルドシリンジ別の後にいずれかを使用します。任意の気泡を注入することは避けてください。
7. ラテックスの注入後、5分間動物を残す。動物の首を、慎重に脳全体を削除します。容器のアーキテクチャとコルテを傷つけない良い世話をするX頭蓋骨、髄膜を除去しながら。写真を撮るために4％PFAの6-8 mlを含む60mmの細胞培養皿の中で脳を置きます。透明な皿の下に測定定規を置きます。手術用顕微鏡に取り付けられたカメラで背と脳の腹側表面の25倍の倍率で写真を撮る。写真は元の距離を定量化するために、ペトリ皿と顕微鏡対物間に90°​​の角度で取られるべきである。
8. 別の4月5日、動物における手順を繰り返します。

3。カーボンブラックインクの混合物を用いて脳血管の染色

1. 我々のプロトコルを持つラテックスベースの脳血管染色の結果を比較するために、1.5ミリリットルEP管でペリカンScribtolシュワルツインク（CB2）900μlでHerlitz Stempelfarbeインク（CB1）100μlの混合物を調製する。 1:9の比率でCB1とCB2 2mlの混合物の総容積を作るために2、EPチューブを準備します。 2つの別々のインスリン注射器（1の混合物を集めるミリリットルずつ）。 37℃まで温め注射器にフタをし、水浴中に置いてください別の2つのインスリン注射器に生理食塩水2mlを収集し、同様に水浴中に置いてください。
2. 動物を麻酔し、papavarine塩酸塩注射用以外は上記と同じ手順を繰り返します。左心室に2ミリリットルsalaineの注入後、カーボンブラックインクの代わりに着色ラテックス2mlの混合物を注入します。 mlあたり18から20秒以上、わずかな圧力で手で注射を行う。注射の前に胸部下行大動脈をクリップ。
3. 動物を犠牲にすることは、脳を取り外して、写真を撮る。
4. フローティング脳は全くsubmergesまで、脳の長期保存の場合は、（5％〜15％が続いた後、30％）、徐々に増加する濃度のショ糖とのインキュベーションによってPFAは一晩続いた4％に脳を入れた。着色ラテックスで灌流動物の脳も同じように保存することができる。
5. 実行する別の4月5日、動物における手順。異なる遺伝的背景や歪みに起因する脳血管解剖の違いを比較するには、それぞれアポKOおよびSV129マウスの同数にプロトコルを繰り返す。
6. 深麻酔（手術の詳細な説明は、この記事の範囲を超えています下にMCAの腔内閉塞の標準プロトコルによると、45分間または90分間一過性局所脳虚血を誘発し、虚血条件下で血管解剖を勉強すること。読者はDoeppnerら、2010）と呼ばれています。梗塞体積を識別するために、再灌流期間（1日〜5日）は計画の終了時に、CB1 + CB2のインクのみで血管染色を行い、5〜10分間37℃で2％TTC溶液を用いて脳全体を染色。 TTCはミトコンドリアの酵素（特にコハク酸デヒドロゲナーゼ）によって赤色のホルマザンに還元される。 TTC染色した後、深い赤色の代謝活性組織の汚れ梗塞組織がunstaiままネッドとによる機能不全や変性したミトコンドリアの酵素に白で表示されます。上記と同様の方法で画像を収集しています。

4。脳血管領の研究

1. どちら脳血管、脳の背側表面の画像着色ラテックスで染色するか、又はCB1の肉眼解剖学を分析するために、+ CB2インクはImageJのソフトウェア（画像処理と解析に使用されるJavaベースのパブリック·ドメイン·ソフトウェア）を用いて分析することができます。 CB1 + CB2灌流が腹側と背側の両面にすべての血管を染色する一方着色ラテックスで灌流脳は、背側表面に位置する血管染色の可変度が表示される場合があります。
2. ImageJのソフトウェアで画像ファイルを開きます。 ACAとMCAとの間のすべての吻合のポイントを識別します。吻合ポイントは血管径はそれぞれ^2、狭いまたはACAとMCAの枝の最寄りの分岐点間の距離の半分であるサイトとして定義されています。
3. mm単位でスケールを設定します。吻合線と直線描画ツールと "測定"ツールを使用して脳の前頭極に尾4ミリメートルで正中線間の距離を測定します。尾前頭極から6 mmで、同じ操作を行います。動物あたり3から4の画像を解析し、平均値を計算します。脳血管の解剖学的構造の変化を識別するために動物の異なるグループ間の値を比較します。 C57BL6 / Jの動物では、ACAとMCAの間に吻合線は尾側前頭極から6 mmで4mm以下に近い正中線にまで遡ることができる。アポEノックアウトマウスでは、この点で有意差を提示しません。それどころか、SV129マウスで吻合線は、前頭極から尾側に両方4ミリメートルと6ミリメートルで正中線にさらにと平行に位置します。
4. 血管解剖を分析するためにInの虚血状態は、上記と同様の計算を実行します。それぞれ、代謝活性組織および壊死組織染色を表す赤と白の色のついたティッシュマージンとして梗塞の境界を識別します。 4ミリメートルで、脳の前頭極から尾6ミリメートルで正中線から梗塞の境界線の距離を測定します。動物あたり3から4の画像から平均値を収集します。別の虚血再灌流期間の間の結果を比較します。

Representative Results

ここで説明されたプロトコルは齧歯類脳血管系の従来のラテックスベースの視覚化の技術的な限界を克服しています。 図1Aは、着色ラテックスのそれ以下の灌流を示し、腹面にのみ大型船は全体背側表面は汚れのないままに、染色されている。結果はまた、非常に可変です。 6番組のうちの1頭のみACAおよび脳の背側表面（データは示していない）上に表示され、MCAの部分的な染色。逆に、CB1 +等しい方法（ 図1B）で中小企業や大血管の十分な充填でCB2灌流結果。染色は、品質の変化なしに7日間まで安定です。 ImageJのプログラムを使用して、我々は、野生型C57BL6 / Jマウス（ 図1C）で正中線からACAおよびMCAの間に吻合点の距離を定量化した。我々は、遺伝modificatiかどうかを観察するためにアポEノックアウトマウスでは、これらの値を比較しに地域の血管解剖（ 図1D）上の任意の効果を持っていた。アポEのノックアウトがC57BL6 / Jマウスにおける脳血管の解剖学的構造に影響を与えませんでしたが、有意差はC57BL/6JおよびSV129株（ 図1E、F）の間で注目された。従って、我々はマウスの遺伝やひずみの違いによる脳血管の解剖学的差異を評価するために、この染色プロトコルの実現可能性を表示することができます。

実験用げっ歯類のストロークモデルでは、TTC染色は広く梗塞容積を観察するために使用されます。脳血管および梗塞容積の同時可視化は、私たちに虚血再灌流後に形態学的変化を分析する機会を与えなければならない。したがって、我々は+ CB2媒介血管染色は虚血再灌流傷害（ 図2A-H）の様々な程度のTTC染色で安定していた、CB1かどうかを検証しました。我々は、さらに吻合を分析してきた 45分または1日または5日間再灌流期間（ 図I、J）のいずれかと一致した虚血の90分後、ACAとMCA間のポイント。予想されたように、正中線と吻合点間の平均距離は群間で有意差（ 図2I、J）を示さず、非虚血動物（ 図1F）と同じ範囲内であった。しかし、正中線から梗塞境界までの距離は、虚血再灌流障害度が高い（ 図2K、L）の増加梗塞体積を反映して、有意差がみられた。これらのデータは、TTC染色と組み合わせた場合、CB1 CB2 +染色は虚血再灌流障害、染色の安定性の様々な程度に付された動物で再現できることを示している。

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図1。背側表面は染色されていないまま、 遺伝とひずみの違いを有するマウスにおける脳血管の解剖学的構造の観察。図1Aは 、腹面に着色ラテックスだけ汚れ大型船のその血管内の血流を示しています。逆に、腹に、大小の血管や脳（ 図1B）の背両面の永久染色におけるCB1 + CB2灌流結果。前大脳動脈（ACA）および野生型C57BL6 / Jマウス（ 図1C）で正中線から中大脳動脈（MCA）の間に吻合点間の距離の定量化は、彼らの遺伝的変異アポKOの対応（ 図との違いを見せない1D）。しかし、有意差はC57BL6 / JとSV129株（図1E、F）の間で注目されている。スケールバー= 2ミリメートル。 * 4ミリメートルでC57BL6 / Jの野生型およびApoE KOマウスの両方と有意に異なる、 電話 mm、P <0.01で。**

図2。脳の腹側と背側の面の虚血脳における血管解剖の分析。図2A-Hのイメージを表示するには、1日または5日間再灌流時間続く​​45分または90分の虚血を行った。右パネルには、虚血再灌流傷害（ 図2A-H）の様々な程度の血管染色の安定性を示し、血管染色およびTTC染色の両方の組み合わせを示しているのに対し、左側のパネルには、CB1 + CB2媒介血管染色を示す。前大脳動脈（ACA）および1日または5日間再灌流期間ドのいずれかと一致した45分または90分虚血後大脳動脈（MCA）の間に吻合点の分析群間で有意差（ 図2I、J）はピクトん。しかし、有意差は虚血再灌流障害度が高い（ 図2K、L）の梗塞体積の増加を示す、正中線から梗塞境界までの距離に記入できます。スケールバーは= 2ミリメートル。 1日の灌流は、p <0.05、**は5日間再灌流、p <0.01を使って45分虚血から*大幅に異なる。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

Discussion

それは一定の圧力^2,3を暗示する具体的な装置を必要としないよう手動注入によるCB1 + CB2の灌流は集中的な訓練なしで正常に行うことができる。我々のプロトコルにおける灌流成果の異質性もごくわずかです。 20虚血動物のうち、1つだけ16非虚血動物のうち、動物と3は不完全な灌流を示しています。これらのケースでは、血管の閉塞につながる生理食塩水灌流時の気泡の混入はほとんどの場合失敗した結果の理由だった。

ラテックスの灌流は、もともと上行大動脈^2,3を介して行われてきたが、灌流の代替ルートも左心室^7,8または総頸動脈^9を含む報告されています。我々は上行大動脈や左心室（未発表の観察）のいずれかを介して灌流を以下のアウトカムに有意差を認めなかった。このように、後者はあったその簡単にアクセシビリティのために選ばれた。

本研究で述べた特定のカーボンブラックインクを選択する前に、我々は、市販のカーボンブラックインクの範囲で、血管内の血流の成果を評価した。 CB1とCB2は、染色の彼らの血の効率性と安定性のために選択されています。もともと書道インクとして製造 - - 高粘度（10-50 MPA / s）と黒2.5％の炭素を含有CB1はCB2をしながら2.1パーセントカーボンブラックを含む非常に低粘度（1.1 MPA /秒）があります。これらのインクの個々のアプリケーションは、染色の効率性と安定性の両方に関して不十分であることが判明している。その結果、私たちはインクを組み合わせて、組み合わせの比率を滴定した。大型と小​​型船の両方の永久染色で1:9の比率の結果でCB2：CB1で灌流。したがって、動脈吻合ポイントは簡単に2つの血管の地域、 すなわちとの間の接合部を定義するためにトレースすることができます。 ACAとMCA。これらのfindingsは、以前の報告^2,10,11と一致している。

アポKOマウスは5-8倍高く、血漿コレステロール濃度を提示し、コレステロールが豊富な食事¹²上に置くときにアテローム性動脈硬化症の開発に晒されています。遺伝子組み換えは、脳血管の解剖学に影響を与えるかどうかはまだ報告されていない。一方、SV129マウスは既に彼らの異なる血管解剖²によるC57BL6 / Jマウスに比較して大きい梗塞容積を示すことが報告されています。我々は、血管解剖の違いを比較するために動物のこれらの3つのグループに我々のプロトコルを検証した。

虚血脳における染色プロトコルを検証するために、我々は主に、MCA ^2-4、10,13の永久閉塞に焦点を当てた先行研究とは対照的に、再灌流の影響を含むように一過性局所脳虚血に関与。予想されたように、我々は、lのパターンに大きな違いは観察されなかったC57BL6 / Jマウスにおける異なった虚血再灌流期間後吻合の伊根。虚血性および非虚血半球の間の血管径に変化は認められなかったが、おそらく、このような変化はもはや再灌流時間に発生する、 すなわち 2〜3週間後¹⁴ストローク。結論として、私達によって実証プロトコルは容易に脳血管を可視化するために、従来のラテックスベースの灌流に比較して再現することができ、あまり複雑で、費用対効果の高い手法です。これは、さまざまな生理学的および病理学的条件における脳血管と血管の領土の肉眼解剖学を分析するための有効なツールとして考えられるかもしれません。 TTCは、このテクニックを染色と組み合わせることにより、脳内の血管供給ゾーンのコンテキストでの虚血の程度を識別するための新たな機会を提供しています。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Scribtol Schwarz (CB2)	Pelican, Germany	221 135
Stempelfarbe (CB1)	Herlitz PBS AG, Germany	10417202
Gedeo Latex	Pebeo, France	13042B