Summary
השתלת הכבד orthotopic בחולדות היא מודל ניסיון הכרחי למחקר ביו. כאן אנו מציגים הניתוחים שלנו להשתלת כבד חולדת orthotopic עם שחזור עורק כבד באמצעות 50% שתל חלקי.
Abstract
השתלת כבד orthotopic (OLT) בחולדות באמצעות שתל שלם או חלקי היא מודל הכרחי למחקר ניסויי השתלה, כגון מחקרים על שימור שתל ו1,2 פציעה איסכמיה reperfusion, תגובות חיסוניות 3,4, 5,6 פרמטרים המודינמיים, ו תסמונת קטנה לגודל 7. OLT החולדה הוא בין המודלים של בעלי החיים הקשים ביותר בניתוח הניסיון ודורש מיומנויות מתקדמות המייקר שלוקחים זמן ללמוד. כתוצאה מכך, השימוש במודל זה היה מוגבל. מאז האמינות והשחזור של תוצאות הן רכיבי מפתח של הניסויים במודלים של בעלי חיים אשר מורכבים כאלה משמשים, חיוני למנתחים העוסקים בעכברוש OLT להיות מאומנים בסטנדרטיים הליכים היטב ומתוחכמים עבור דגם זה.
בעוד טכניקות ושינויים של OLT בחולדות שונות כבר דיווחו 8 מאז המודל הראשון היה describאד על ידי Lee et al. 9 בשנת 1973, לחיסולה של בדית השחזור עורק 10 וכניסתה של טכניקת השקת השרוול ידי קמהדע et al. 11 היו התקדמות גדולה במודל זה, כי הם פשטו את הליכי השיקום במידה רבה . במודל על ידי קמהדע et al., Rearterialization הבדיה גם בוטל. מאז חולדות יכולות לשרוד ללא זרימת עורקי כבד לאחר השתלה כבדה, לא הייתה מחלוקת על השווי של arterialization כבד. עם זאת, העליונות הפיזיולוגית של מודל arterialized כבר הודה יותר ויותר, במיוחד במונחים של שמירה על מערכת מרת צינור 8,12 ויושרת הכבד 8,13,14.
במאמר זה, אנו מציגים ניתוחים מפורטים למודל של חולדת OLT עם שחזור עורק כבד באמצעות 50% שתל חלקי לאחר vivo לשעבר כבד resection. הליכי השיקום לכל כלי וצינור המרה מבוצעים על ידי השיטות הבאות: 7-0 תפרי פוליפרופילן רציפים ללעיל וinfrahepatic וריד הנבוב; טכניקת שרוול לוריד השער; וטכניקת תומכן לעורק הכבד ו צינור המרה.
Protocol
1. טכניקות בסיסיות והליכים משותפים
- כל ההליכים מתבצעים בתנאים נקיים אבל nonsterile.
- ברגע שהבטן של החולדה נפתחה, כל ההליכים מתבצעים תחת מיקרוסקופ הניתוחי בהגדלה של 16x. חריגים הם כריתת כבד vivo לשעבר, המבוצע ב10x, וההליכים הבאים, שמבוצעים ב25x: החדרת סטנט לתוך צינור המרה והעורק הכבד, והבנייה מחדש של העורק הכבד, הווריד הנבוב infrahepatic (IHVC), וצינור המרה.
- ספוגיות כותנה המשמשות למניפולציה עדינה של איברים, נתיחה בוטה של רקמות, וhemostasis דחיסה. מטליות גזה (5 5 סנטימטרים) ספוגות בתמיסת רינגר לקטט משמשות לחזור בו כבד או במעיים, וכדי לשמור על איברים לחים. מהדק Satinsky יכול לשמש לנסיגה של מעי גזה מכוסית כלפי שמאל או הזנב של החולדה להרחיב את שדה הניתוח סביב IHVC.
- כל ligations מבוצעים בחוט משי 6-0 פרט לpedicles של אונה של כבד במהלך כריתת vivo לשעבר כבד, שם חוטי משי 4-0 משמשים. הקשירה יכולה להיות משך במלחציים DeBakey בולדוג או מכשירים אחרים כדי לספק מתח מספיק לנקודת גבעול כך שניתן לבצע קשירה השנייה במרחק של הראשונה, והחלוקה בין שתי נקודתי הגבעול ניתן לעשות זאת כראוי.
- כל הזריקות תוך ורידים מבוצעות דרך וריד הפין.
- במהלך הליכי השיקום לsuprahepatic וריד הנבוב (SHVC), וריד השער, עורק הכבד, וצינור המרה, גוש קטן של חימר מבוסס נפט משמש להחזיק אצבע טבעת של כלי דם היקפי או מהדקו מלקחי יתושים כדי לשמור אותם קבועים בעמדה.
2. הכנת Presurgical
- לואיס חולדות זכרים במשקל שבין 230 ו 250 גרם משמשות כתורם והמקבל להשתלת כבד. החולדות הן כלחב גישה חופשיה למים ומזון עד לאינדוקציה של הרדמה.
- קאף לוריד השער (איור 1): הכן את השרוול לוריד הפורטל על ידי חיתוך צנתר 14-מד עם להב אזמל מס '11 מתחת למיקרוסקופ. השרוול מורכב מגוף והארכה, כל אחת באורך של 2 מ"מ. הפוך חריצים היקפיים בשרוול ידי clamping הקיר של הצעד אחר צעד השרוול circumferentially עם מלקחי יתושים, כך שנושא יכול להיות מהודק בחוזקה בשרוול בלי להחליק ולנפול.
- סטנטים לצינור המרה והעורק כבד (איור 1): Cut צנתרים 24 מד עם אזמל תחת מיקרוסקופ כדי לייצר bevels בשני הקצוות של הצנתרים עם אורך של 4 מ"מ לעורק הכבד ו5 מ"מ לצינור המרה .
3. מבצע תורם
הסכימה של הסרת הכבד מעכברוש התורם מוצגת באיור 2. הליך זה מחייב כimately 30-35 דקות.
- הרדם עכברוש עם שאיפה של 4% isoflurane בחמצן 100% בקצב זרימה של 4 ליטר / דקה לאינדוקציה של ההרדמה, ו% 1.5 בכרך 2 ליטר / דקה לתחזוקת כרך. הזרק עצירות (0.1 מ"ג / ק"ג) מתחת לעור כמשכך כאבים. הנח את העכבר על משטח חימום, ולתקן את החלק העליון של הזרועות באמצעות מערכת ההכחשה, הקיבוע המגנטית (איור 3 א). לגלח את הפרווה מאזור הבטן כולו של העכברוש, ולחטא את העור המקביל עם פתרון povidone-יוד.
- פתח את הבטן על ידי חתך קו אמצע עם סיומות בין שתי מדינות. הנח מזרק 5-מ"ל תחת האחורי של העכברוש, כך שSHVC הוא גבוה ventrally. באמצעותו מלקחי יתושים, לצבוט ולמשוך את תהליך xiphoid לכיוון הראש, ולהחיל את מפשק subcostal כדי לפתוח את שדה הניתוח (איור 3 א).
- לבתר את רצועת falciform ורצועה משולשת שמאל. בשלב הבא, לקשור ולחלק את הווריד סרעפתי השמאל.
- Retrלפעול אונות הצדדיות החציון ושמאליות כלפי מעלה עם ספוגית גזה רטובה. שימוש במלקחיים דו קוטביים, להקריש ולחלק את כלי para-הוושט בין אונת caudate רוחב והשמאלית הקדמית.
- הזז את המעיים מחוץ לבטן על הצד השמאלי של העכבר, ולכסות אותם עם ספוגית גזה רטובה. לחזור בו לרוחב האונה הימנית כלפי מעלה עם ספוגית גזה רטובה. מבודד IHVC מרקמת retroperitoneal, ולקשור את וריד הכליה הימני, שיחולק מאוחר ממש לפני הסרת השתל.
- כדי להכניס סטנט לצינור המרה (איור 3 ב):
- לקשור את צינור המרה ברמה של ההסתעפות של עורק gastroduodenal. הרקמות הרכות המקיפות את צינור המרה צריכות להישמר עד כמה שניתן, וההפרדה של צינור המרה מהעורק הכבד יש להימנע כדי להבטיח אספקת דם העורקי מספיקה לצינור המרה.
- עם מספרי מייקר ישרים, לעשות חתך קטן בanteriאו קיר של צינור המרה הפרוקסימלי לנקודת הגבעול. בעוד מחזיק את הקיר הקדמי של החתך עם מלקחי מייקר ישרים ביד השמאל, הכניס סטנט לצינור באמצעות מייקרו מלקחיים מעוקלים ביד ימין, ולאבטח אותו עם חוט משי 6-0. אחד לחתוך קצוות של החוט על צינור המרה נשמרים באורך של 4 מ"מ, כך שניתן להחזיק את החוט בעת ההשקה מאוחר יותר.
- לשחרר את וריד השער מורידי השוער וטחול ידי ligating ומפריד ביניהם.
- לקשור ולחלק את עורק gastroduodenal, אז לבודד את עורק הכבד הנפוץ (צ) מראש הלבלב לשורש שלה. סובב את הכבד בצד ימין עם מטליות כותנה, ולנתח את הרצועה סביב החלק האחורי של הכבד והוושט.
- בסיום ההכנות לכריתת כבד, להסיר את המפשק, את מלקחי היתושים לתהליך xiphoid ומזרק 5-המ"ל תחת האחורי של העכברוש. להחזיר את המעיים לabdominaחלל הליטר.
- להזריק 500 IU של הפארין-נטריום ב2 מ"ל של תמיסת מלח רגילה דרך וריד הפין. כ 3 דקות מאוחר יותר, לאפס את המזרק 5-המ"ל, מלקחי היתושים, והמפשק. לקשור את CHA הפרוקסימלי לשורש שלה. שמור על אחד של החתך מסתיים חוט גבעול לCHA ארוך.
- לאחר הידוק הקרוב IHVC לוריד הכליה הימני עם מלקחי יתושים, מהדק את וריד השער עם מהדק כלי מייקרו פנוי מתחת לגדם וריד הטחול. חתוך הקיר הקדמי של וריד השער, ולהכניס צנתר 18-מד לתוך וריד הפורטל.
- תנקב את הכבד באתרו עם 60 מ"ל של תמיסה קרה היסטידין-טריפטופן-ketoglutarate (HTK) בלחץ ההידרוסטטי של 20 סנטימטרים H 2 O. מייד לאחר מכן, חותך את הסרעפת ותחצה את הווריד הנבוב intrathoracic, וחותך את הקיר הקדמי של IHVC הפתוח כדי לאפשר הפתרון לזלוף להישטף אל מחוץ לכבד (איור 3 ג).
- הצמד IHVC עם דיכלי מייקר sposable לצבוט ממש מתחת לכבד. בלו כבד על ידי ביתור IHVC מעט מתחת לנקודת האמצע בין הכבד והכליה הימני הווריד, וריד השער מתחת לגדם וריד הטחול, סרעפת, הרצועות שנותרו בצדו האחורי של הכבד, בוריד הכליה הימני, והצ'ה בשורש שלה. מניח את הכבד נכרת בפתרון HTK קר בכוס מתכת הרכובה בקופסה מלאה בקרח כתוש פלסטיק.
4. הכנה שתל vivo לשעבר
כל הנהלים להשתלת הכבד מבוצעים בכוס המתכת מלאה פתרון HTK קר כקרח. הכנת שתל vivo לשעבר דורשת כ 30 דקות.
- לחיבור של שרוול לוריד השער (איור 4):
מהדק את תא מטען ורידי הפורטל עם מהדק בולדוג DeBakey. הנח את המהדק בעמדת גישור על הגביע (איור 4 א, ב). שים וריד השער דרך השרוול, ולצבוטוריד השער שוב יחד עם הסיומת של השרוול בעמדת 0:00 (איור 4 ג'). אוורט הקיר של וריד הפורטל על השרוול כדי למקם את הגדם של וריד הטחול מחוץ לשרוול בעמדה 7:00 (האיור 4D), ולאבטח את וריד השער עם חוט משי 6-0 (האיור 4e) . - כדי להכניס תומכן לעורק הכבד (איור 5):
תקן את הכבד על ידי clamping שני הקצוות של הסרעפת על ידי מלקחיים, ולמשוך את CHA ישר על ידי מחזיק את החוט עם גבעול DeBakey בולדוג המהדק (הציור 5a). עם מספרי מייקר ישרים, לעשות חתך קטן בקיר הקדמי של הצ'ה. ביד השמאל, להחזיק את הקיר הקדמי של החתך עם מלקחי מייקרו ישרים, ועם יד ימין, הכנס סטנט לתוך CHA באמצעות מייקרו מלקחיים מעוקלים. סטנט הוא שטף בעבר עם פתרון הפארין-נטריום (100 IU / מ"ל) (איור 5 ב-D). Secure התומכן עם חוט משי 6-0, ולשמור על אחד מקיצוץ הקצוות של החוט באורך של 4 מ"מ. יש לשטוף את הכבד דרך צנתר העורקים עם 5 מ"ל של פתרון HTK קר. - עבור 50% כריתת כבד (איור 6):
- מהדק את אונת caudate האחורית עם מלקחי יתושים כדי לתקן אותה במקום. לכרות אונה לאחר קשירתו pedicle עם חוט משי 4-0 (7 א איור). באותו אופן, להסיר את אונת caudate הקדמית.
- סובב את קופסא הפלסטיק 90 מעלות. מהדק את הקצה הימני של הסרעפת והחלק השמאלי של האונה החציוני. לעשות חתך קטן בקצה העליון של הגבול של המנות הבילטרליים של אונת החציון, ולאחר מכן להסיר את החלק השמאלי לאחר קשירה (7b איור). הסר את האונה השמאלית רוחב לאחר קשירת pedicle עם חוט משי 4-0. לצרוב את פני השטח הכבד resected זהירות עם מלקחיים דו קוטביים. כתוצאה מכך, המסה הכבדה היא מופחתת על ידיpproximately 50% 15 (איור 7 ג, ד).
- לplasty של SHVC (איור 8):
לתקן את המיקום של הכבד על ידי clamping שני הקצוות של הסרעפת עם יתוש מלקחיים (איור 8 א). חתוך את הקיר הקדמי של SHVC ידי הסרת הסרעפת המקבילה. צרף 2 7-0 תפרי פוליפרופילן מבחוץ לבפנים בשתי הפינות כלהישאר תפרים להשקה בהמשך (איור 8 ב). ואז לחתוך את הקיר האחורי של SHVC. - אחסן את שתל הכבד ב 4 ° C בפתרון HTK באמבטיה במים קרים.
5. מבצע נמען
הסכימה של השתלת השתל בחולדת הנמען שמוצג באיור 9. הפעולה דורשת 60-70 דקות הנמען, הכוללת 10-11 דקות של זמן anhepatic וכ 23-24 דקות של זמן clamping IHVC.
- בצע אותו הנוהל כמו בעשהולא פעולה (3.1-3.4), פרט לפתיחה של הבטן על ידי חתך קו אמצע, ללא רחבות הבילטרליים (איור 10a).
- הנח ספוגית גזה רטובה על הצד הימני של התריסריון וכל המעיים להשיג שדה ניתוח סביב IHVC. שים את האונות לרוחב וחציון השמאל לתוך חלל subphrenic שמאל, ולחזור בו לרוחב האונה הימנית כלפי מעלה עם ספוגית גזה רטובה. מבודד IHVC מרקמת retroperitoneal. לקשור ולחלק את וריד הכליה השמאלי (איור 10b). עם מטליות גזה רטובות וכותנה, לסובב את הכבד לשמאל, ולנתח את הרצועה סביב החלק האחורי של הכבד.
- החזר את האונה הימנית לרוחב לתפקיד אנטומי. הנח ספוגית גזה רטובה לכיסוי וחוזר בי את האונות הצדדיות חציון ושמאליות כלפי מעלה. תחצה את צינור המרה, ממש מתחת לסניף מאונת caudate. הרקמות הרכות המקיפות את צינור המרה צריכות להישמר עד כמה שניתן. שמור על אחד של חתך קצוות של הלקרוא את הגבעול לצינור המרה ב4-מ"מ ארוך.
- לקשור ולחלק את עורק gastroduodenal ועורק הכבד ההולם במרחק 3-מ"מ להסתעפות מCHA. ואז, להפוך את ה-Y מבנה של העורק בסוף צ. שמור על אחד של החתך מסתיים חוט גבעול לעורק הכבד הנאות ב4-מ"מ ארוך. סובב את הכבד בצד ימין עם מטליות כותנה, ולנתח את הרצועה סביב החלק האחורי של הכבד מהצד השמאלי.
- לאחר ההזרקה תוך ורידית של 2 מ"ל של תמיסת רינגר לקטט, להדק IHVC עם מהדק כלי מייקר מתכת מעל וריד הכליה הימני. מהדק את וריד השער ברמה של הסתעפותה בכבד על ידי hilum מלקחי יתושים מהצד השמאלי של העכבר. הצמד SHVC יחד עם הסרעפת מהצד הימני במלחציים בכלי דם היקפי, ולתקן את טבעת האצבע במהדק בגוש חימר על בסיס שמן.
- להפחית את ההרדמה עם isoflurane ל% 0.4 כרך במהלך זמן anhepatic (המשךשל הצלב clamping של וריד השער). בלו נמען כבד יליד על ידי ביתור SHVC, וריד השער, וIHVC ברמות הבאות: SHVC, בגבול שבין SHVC והכבד; ווריד השער, ממש מעל ללסת של מלקחי היתושים; ו IHVC, מעט מתחת לנקודת האמצע בין הכבד והכליה הימני הווריד (איור 10c). הנח את שתל כבד orthotopically.
- להשקה של SHVC ידי תפר רציף (איור 11):
- השתמש במייקרו מלקחיים מעוקלים ביד השמאל במהלך הליך התפירה לאחיזת קיר הכלי או מחזיק את מחט התפירה. ראשית, למקם את התפר שהיה על SHVC הנמען מהחוץ אל הפנים באמצעות 7-0 פוליפרופילן המצורף בפינה הימנית של השתל ואחריו קשירת קשר (או שאתה יכול לקשור אותו אחרי כל נהלי התפירה הם מלאים). בשלב בא, למקם את התפר שהיה השני באותה הדרך בתירס השמאלאה, שיהיה ההתחלה של תפר תפר פועל. כדי להרחיב את ההשקה, לתפוס ולשמור על התפרים באמצעות מהדק DeBakey בולדוג בשתי הפינות עם מתיחה עדינה superiolaterally (איור 11a, ב).
- פירס התפר בפינה השמאלית דרך הקיר בצד השתל מבחוץ לבפנים באופן הדוק למחוץ הקשר, ולתפור את השורה האחורית של SHVC intraluminally עם 7-8 תפרים לפינה הימנית (האיור 11c). הפוך את כמה תפרים 1 בזהירות, כך שבתוך לומן מתמודד אחד את השני. בפינה הימנית, לנקב 7-0 פוליפרופילן באמצעות הכלי בצד השתל לבחוץ.
- בשלב בא, לתפור את השורה הקדמית מבחוץ, מימין לשמאל, עם כ 10 תפרים (איור 11d). לפני השלמת השורה הקדמית, שטוף את הפנים עם פתרון רינגר לקטט כדי להסיר בועות אוויר. הפוך התפר האחרון בשורה הקדמית קרוב ככלניתן תפר שהיה בפינה השמאלית, ואז לקשור אותם יחד.
- לבנייה מחדש של וריד הפורטל על ידי טכניקת שרוול (איור 12):
- חוזר בי את האונות הצדדיות חציון ושמאליות כלפי מעלה עם ספוגית גזה רטובה. מהדק את וריד שער הנמען במפגש שלו עם שוער הווריד באמצעות מהדק כלי מייקרו פנוי מהימין. תקן את מלקחי יתושים הצובט את וריד הפורטל בחימר, ולמשוך את קצה המלקחיים כלפי hilum הכבד (איור 12 א, ב).
- חתוך קיר הקדמי של וריד השער מתחת ללסת של מלקחי יתושים. שטוף את החלק הפנימי של וריד שער הנמען והשרוול עם פתרון רינגר לקטט. החזק את הקיר הקדמי של החתך עם מלקחיים ישרים מייקרו ביד השמאל וסיומת של השרוול עם מלקחי מייקרו מעוקלים ביד ימין. הכנס את השרוול לתוך וריד פורטל הנמען העמוק, ולאבטח אותו עםחוט היקפי 6-0 משי (איור 12C-f).
- שחרר את התפסים של הווריד וSHVC הפורטל, ואז reperfuse הכבד. הוצא את מזרק 5-המ"ל מהחלק האחורי של העכברוש, ולהגדיל את הריכוז של% 0.8 isoflurane לכרך.
- לבנייה מחדש של העורק הכבד בטכניקת סטנט 16 (איור 13):
- ראשית, החזק את החוט של עורק הכבד התקין נמענו מלקחיים ידי יתושים מהצד השמאלי, ולמשוך אותו לכיוון hilum הכבד, ולאחר מכן מהדק את CHA הנמען מהצד הקרוב זכות הלבלב (איור 13 א).
- עם מלקחי מייקר ישרים, לעשות חתך קטן בהסתעפות של ה-Y מבנה בסוף הנמען CHA לעשות פתיחת משפך. החזק סטנט הונח בCHA השוחד עם מלקחי מייקרו מעוקלים. לאחר שטיפה כל לום עם פתרון הפארין-נטריום (100 IU / מ"ל), חלק את סטנט לתוך מחדשצ cipient ומאבטח אותו עם חוט משי 6-0. לקשור קצה אחד של נושא זה בנמען CHA והחוט 4-המ"מ על CHA השוחד יחד, כך ששני Chas להתקרב זה לזה במתח מופחת של אתר anastomotic (האיור 13b). אחרי זה, שחרר את המהדק.
- להשקה של IHVC ידי תפר רציף (איור 14):
Anastomose באותו אופן כמו לSHVC, אבל משתמש יותר תפרים עם עקיצה עדינה (איור 14a-D). הקשירה של התפרים בתפר האחרון ניתן למנוע, או יכולה להיות מושלמת עם קשירת גורם גדילה כדי להימנע מהצר anastomotic נגרם על ידי קשירה חזקה מדי. לאחר declamping, להגביר את ריכוז ההרדמה ל% בנפח 1.0. אם ההשקה נראית stenotic, מרחיב את אתר anastomotic ידי משייכת תפרי שהייתם הבילטרליים או הרחבת השורה הקדמית בעדינות כדי להרחיב את ההשקה. - לנהל 0.5 מ"ל של נתרן 8.4% ביקרבונט solution עם 1.0 מ"ל של תמיסת רינגר לקטט באינפוזיה.
- החל ברים קטנים של Tachosil לאטום את המשטח הכבד resected כדי למנוע דימום ודליפת מרה.
- לבנייה מחדש של צינור המרה על ידי טכניקת סטנט:
- החזק את החוט של צינור מרת הנמען באמצעותו מלקחי יתושים מהצד השמאלי. תקן את מלקחי יתושים בחימר, ולמשוך את קצה המלקחיים כלפי hilum הכבד.
- לעשות חתך קטן בצינור המרה ברמה המתאימה, כך שצינור המרה המשוחזר לא יהיה ארוך מדי. הכנס את הסטנט ממוקם בצינור מרת השתל לתוך צינור הנמען עם תשומת לב קפדנית, כדי למנוע עיוות, ולאבטח אותו עם חוט משי 6-0. לקשור נושא זה בצינור הנמען ואת חוט 4-המ"מ בצינור השתל יחד, כך ששתי הצינוריות להתקרב זה לזה במתח מופחת של אתר anastomotic.
- בהשלמת הליכי השיקום, להזריק מ '1l פתרון של 5% גלוקוז דרך וריד (איור 15).
- אשר hemostasis הנאותה, ולאחר מכן לסגור את החתך בבטן על ידי תפרי Vicryl 4-0 רצופים בשתי שכבות.
6. טיפול לאחר ניתוח ומעקב
מייד לאחר הניתוח, טיפול בעכברים עם נמען הזרקה תת עורית של נתרן cefuroxime (16 מ"ג / ק"ג) ועצירות (0.1 מ"ג / ק"ג) בסך של 1.5 מ"ל של תמיסת מלח רגילה. אפשר החולדה להתאושש במשך 60 דקות בכלוב מיוחד לטיפול נמרץ ביחידה עם אוויר מתחמם (30-35 מעלות צלזיוס) ואספקת חמצן. הזרק עצירות (0.1 מ"ג / ק"ג) מתחת לעור כמשכך כאבים כל 12 שעות למשך 3 ימים. לאחר מכן להעביר את העכבר לכלוב רגיל, ולספק גישה כרצונך למים ומזון.
Representative Results
כל חולדות הנמען (n = 20) שרדו ללא סיבוכים נראים לעין עד המתת חסד מתוכננת לדגימת דם ב1, 3, 24, ו 168 שעות (7 ימים) לאחר reperfusion פורטל (n = 5 בכל נקודת זמן). דגימות הדם נאספו מIHVC ידי לנקב ישיר עם מחט 27-מד. בעקבות צנטריפוגה XG ב 5340 למשך 10 דקות, את דגימות הסרום התקבלו ונותחו לרמות אלנין aminotransferase (ALT), המשקפות את מידת ניזק hepatocellular לאחר השתלה. הזמן כמובן שינויים ברמות ALT בסרום מוצג באיור 16. רמות ALT הגיעו לשיא ב 24 שעות (ממוצע ± סטיית תקן: 212.6 ± 67.9 IU / L) ולאחר מכן ירד לגבולות נורמלים ב168 שעות (33.6 ± 6.8 IU / L).
איור 1. שרוול לוריד הפורטל (PV) מ1קטטר 4-מד, וסטנטים לעורק הכבד (HA) ומרת הצינור (BD) מצנתרים 24 מד.
איור 2. סכימה של הסרת הכבד מעכברוש התורם BD, מרת צינור;. HA, עורק כבד; IHVC, infrahepatic וריד נבוב; PV, וריד שער; SHVC, suprahepatic וריד נבוב.
איור 3. פעולה תורמת. . החולדה מונחת על כרית חימום עם מערכת הכחשה, קיבוע מגנטית. הבטן נפתחה על ידי חתך קו אמצע עם סיומות בין שתי מדינות. ב. החדרת סטנט לתוך צינור המרה. ג. זלוף של הכבד דרך וריד השער. קיצורים הם להסביראד באיור 2.
איור 4. קובץ מצורף של שרוול לוריד השער. , ב. מהדק DeBakey בולדוג שתופס את תא מטען ורידי הפורטל ממוקם מעל כוס המתכת. הגביע הוא רכוב בקופסא הפלסטיק מלא בקרח כתוש. ג. וריד השער הוא לשים דרך השרוול. ד. הקיר של וריד הפורטל כלפי חוץ על השרוול בגדם וריד הטחול מחוץ לשרוול ב7 שעת מיקום וסיומת של השרוול בכיוון השעה 12. דואר. וריד השער מאובטח באמצעות חוט משי היקפי 6-0 בשרוול. החיצים השחורים מצביעים על הגדם של וריד הטחול.
איור 5. גופיים החדרת סטנט לעורק הכבד. . הכבד קבוע על ידי כיווץ שני הקצוות של הסרעפת, והעורק הכבד נמשך ישר ידי החזקת חוט גבעול לעורק. ב. הקיר הקדמי של החתך הקטן בעורק הכבד נערך עימו מלקחי מייקר ישרים . ג, ד. הסטנט מוחדר לעורק הכבד ומאובטח עם חוט משי 6-0.
איור 6. הסכימה של vivo לשעבר 50% כריתת כבד. אונות בצבע אפור יוסרו. ACL, קדמית caudate אונה; PCL, אונת caudate אחורית; LLL, אונה שמאלית רוחב; LML, חלק שמאלי של האונה החציוני; חלק RML, זכות של האונה החציוני; SRL, אונה ימנית רוחב מעולה; אונת IRL, נחותה זכות לרוחב.
= Fo "jove_content": לשמור-together.within עמודים = "תמיד"> 
איור 7. גופיים 50% כריתת כבד. . קשירת pedicle של אונת caudate האחורית. ב. קשירת pedicle של החלק השמאלי של האונה החציוני. ג. כבד לפני הכריתה 50%. ד. הכבד לאחר כריתת 50%.
איור 8. גופיים plasty של suprahepatic הווריד הנבוב. . הכבד קבוע על ידי כיווץ שני הקצוות של הסרעפת עם מלקחי יתושים. ב. תפרים להישאר עם 7-0 פוליפרופילן מצורפים בשתי הפינות.
איור 9. סכימה של השתלת השתל בחולדת הנמען. הליכי השיקום מבוצעת ללעיל וinfrahepatic וריד נבוב (SHVC וIHVC) עם תפר 7-0 רציפים, וריד הפורטל (PV) על ידי טכניקת שרוול, וכבד עורק (HA) ומרת צינור (BD) על ידי טכניקת תומכן.
איור 10. פעולת נמען עד לסילוקו של כבד הילידים. . הבטן נפתחה על ידי חתך קו אמצע. ב. וריד הכליה הימנית הגבעול. ג. כבד היליד הוא נכרת. קיצורים מוסברים באיור 2.
איור 11. השקה של suprahepatic וריד נבוב. , ב. מהדק כלי הדם ההיקפי לsuprahepatic וריד הנבוב קבוע בגוש חימר על בסיס שמן. התפרים להישאר בשתי הפינות נשמרים עם מתיחה עדינה superiolaterally להרחיב את ההשקה. ג. תפר intraluminal רציף של השורה האחורית בהתקדמות. ד. תפר רציף של השורה הקדמית בהתקדמות.
איור 12. שיקום של וריד השער. , ב. מלקחי יתושי clamping וריד השער קבוע בחימר מבוסס נפט ומשך לעבר hilum הכבד. CF. החדרת השרוול לתוך וריד הפורטל.
איור 13. בנייה מחדש של העורק הכבד. , ב. ז> החדרת סטנט לעורק הכבד הנפוץ הנמען (CHA) בהסתעפות של עורק הכבד התקין (PHA) ועורק gastroduodenal (GDA).
איור 14. השקה של infrahepatic הווריד הנבוב. . התפרים להישאר בשתי הפינות. ב. תפר רציף של השורה האחורית. ג. תפר רציף של השורה הקדמית. ד. Reperfusion של infrahepatic הווריד הנבוב. קיצורים מוסברים באיור 2.
איור 15. כל הליכי השיקום שיסיימו. קיצורים מוסברים באיור 2.
"איור 16" src = "/ files/ftp_upload/4376/4376fig16.jpg" />
איור 16 זמן כמובן לאחר ניתוח של שינויים ברמות סרום aminotransferase אלאנין (ALT) (n = 20, n = 5 בכל נקודת זמן).. נתונים באים לידי ביטוי כאמצעי עם ברי שגיאה המצביעים על סטיות תקן. רמות ALT הגיעו לשיא ב 24 שעות (212.6 ± 67.9 IU / L) ולאחר מכן ירד לגבולות נורמלים ב168 שעות (33.6 ± 6.8 IU / L).
Discussion
הדגם הראשון של OLT החולדה נמסר על ידי Lee et al. ב -1973 9, שבו כל הכולים כולל העורק הכבד שוחזרו על ידי שיטה נתפרה ביד ומחלף portosystemic extracorporeal היה בשימוש. מודל זה היה טכני מסובך וקשה לביצוע. המודל הבא היה אחד בלי שחזור עורק כבד ומחלף extracorporeal, שפותח על ידי אותם סופרים 10 בשנת 1975. בשינה 1979, קמהדע et al. הציג טכניקת השקת השרוול למודל ללא rearterialization כבד 11. עם השינויים הללו, OLT בחולדות היה פשוט יותר עם זמן anhepatic קצר בפעולות נמען וכבר בשימוש נרחב כמודל ניסיוני מקובל.
עם זאת, יש כבר מחלוקת מאז על המשמעות של arterialization בדיה בחולדת OLT 8 בגלל arterialization היה משימה תובענית אבל דילא משפיע על ד הישרדות לאחר השתלה. מחקרים רבים על arterialization כבד באמצעות טכניקת שחזור שונה כבר דיווחו 8, כגון השקת אאורטלי קטע לאב עורקי 3,9,17, טכניקת שרוול השקה 18,19,20, טכניקה טלסקופית 5, טכניקת סטנט 13, 16, וטכניקת השקת שרוול 12,21-23. בעוד הטכניקה לOLT העכברוש היא עדיין לא טופלה היום, מודל arterialized כבר העדיף יותר ויותר במונחים של עליונותה הפיזיולוגית 8,12,13,14. בין הטכניקות שהוזכרו לעיל, טכניקת סטנט שהיה פשוט ומהיר לביצוע נמסרה על ידי להמן ואח'. 16 בשנת 2005. המחקר הראה תוצאות מצוינות: שיעור לא נצפה חסימה בעורק הכבד המשוחזר ב8 שעות, 24 שעות, ו 6 חודשים לאחר reperfusion. לכן אמצתי את הטכניקה הזאת לarterialization כבד.
אנו ביצועיםהשקת ma נתפר ביד לשיקום SHVC וIHVC. שיטה זו מספקת אתר anastomotic עם מצב פיסיולוגי אופטימלי, מה שמוביל לשכיחות המופחתת של פקק 8, והוא הסימולציה ואימון למנתחי מייקרו הטובה ביותר. בנוסף, ההשקה יכולה להיות אפשרית גם עם כלי גדמים קצרים. בנוגע להשקה של IHVC, שיטה זו אינה דורשת זמן רב IHVC בצד השתל לעומת טכניקת השקת השרוול. לכן, כאשר וריד כלית התורם גזור לעשות IHVC השתל ארוך, שיטה זו ישימה להשתלה של שתל קטן שמצריכה זמן רב IHVC, כגון שתל 30% שמורכב מאונות ימין לרוחב וcaudate עם intrahepatic קצר וריד נבוב ללא SHVC 2.
לגבי הטכניקות של כריתת כבד בחולדות, עד היום מספר שיטות דווחו; שתי הטכניקות העיקריות הן טכניקת קשירת המסה הקלסיתוטכניקת כלי המכוון 24. אנו מבצעים את טכניקת הקשירה הקלסית לכריתת כבד 50% 15, אבל תחת מיקרוסקופ ניתוחי על מנת להפוך את ההליך העדין יותר, וכדי להימנע מניזק לאונות והמבנים הנותרים.
אנחנו תארנו את התוצאות המייצגות מן חולדות הנמען במודל שלנו, החולדות שרדו במהלך תקופת התצפית 7-היום ללא סיבוכים לכאורה. המודל יכול להיות שונה למטרות שונות של ניסויים על ידי בחירה בהגדרות השונות, כגון אחסון ממושך קור, איסכמיה החמה ממושכת הכוללת תרומה לאחר מוות לבבי, ושימוש בשתלים קטנים יותר כבדים או שתלים ממודלי ניסויים של פגיעה בכבד או מחלות.
מניסיוננו, יש שלושה גורמים מרכזיים ברחבי ההליכים שיכולים להשפיע על ההישרדות לאחר השתלה, הפרמטר האמין ביותר לתוצאות של OLT חולדה: כמות איבוד דם; זמן המבצע, דוארבמיוחד clamping זמן של הווריד וIHVC הפורטל; והלימות של השחזור של כל כלי, אשר יכולות לגרום להיצרות, פקק, או דימום. בתקופת הכשרה של מודל זה, רוב הכישלונות יכול כנראה להיות קשור לגורמים אלו. במאמר זה וידאו, אנו מציגים הוראות שלב אחר שלב לניתוחים למודל העכברים שלנו OLT החלקי עם שחזור עורק כבד. בעוד מודל עכברים של OLT הוא מסובך ודורש מיומנות מייקרו מתקדמת, מאמר זה מספק שפע של מידע מעשי, שאמור לשמש כמדריך טוב לאימון ולמידה של דגם זה. לימוד מודל זה ביעילות, חשוב במיוחד לקיצור תקופת הלימוד, צמצום מספר בעלי החיים והעלויות הדרושות לאימון, ומאוחר יותר משחזר תוצאות אמינות בניסויים. זה עולה בקנה האחד עם תפיסת 3Rs (החלפה, הפחתה, ועידון) של ניסויים בבעלי חיים, שהניחה על ידי ראסל ורץ' ב1959 25.
Disclosures
אין לנו אינטרסים מנוגדים לגילוי. החולדות הם שוכנו בתנאים ספציפיים לפתוגן חופשיים על פי ההנחיות של הפדרציה לעמותות בעלי חי מדע המעבדה (FELASA). כל הניסויים שנערכו בהתאם לחוק הפדרלי הגרמני בנוגע להגנה על בעלי חיים ו" מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה "(המכון הלאומי לבריאות פרסום המס '86-23, מתוקן 1985).
Acknowledgments
המחברים מודים פסקל Paschenda ומרייק ולץ לסיוע הטכני שלהם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical microscope | Leica | M651 | |
| Light source | Schott | KL1500LCD | |
| Cotton swabs | NOBA Verbandmittel | 974202 | |
| Gauze swabs (5x5 cm) | Fuhrmann | 10002 | |
| povidone-iodine solution | Mundipharma | 6108022.00.01 | |
| Oil-based clay | Debika corporation | 090148 | |
| TachoSil | Takeda Pharmaceuticals International GmbH | EU/1/04/277/001-004 | Applied to resected liver surface |
| Scalpel blade No. 11 | Pfm medical | 200130011 | Preparation of cuff and stents |
| 14-gauge catheter | B. Braun | 4268210S | Cuff for PV |
| 18-gauge catheter | B. Braun | 4268130S | Perfusion via PV |
| 24-gauge catheter | B. Braun | 4269071S | Stent for BD and HA |
| 4-0 silk suture | Resorba | H3F | Liver resection |
| 6-0 silk suture | Resorba | H1F | |
| 7-0 Prolene (polypropylene) suture | Ethicon | 8701H | SHVC and IHVC |
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | V304H | Abdominal closure |
| 5-ml syringe | Terumo | SS+T05ES1 | Back pillow |
| Heating pad | Thermo | 190 x 260 mm | |
| Magnetic fixator retraction system | Fine Science Tools Inc. | 18200-01 18200-02 18200-03 18200-12 |
|
| Cold water bath | Huber | 740.000X | Graft preservation |
| Bipolar forceps | Söring | MBC-200 | |
| Mosquito forceps | BONIMED | 451-476-03 | Two pairs used |
| Adson micro forceps | Dimeda | 10.176.12 | |
| Curved micro forceps | AESCULAP | FD281R | |
| Straight micro forceps | Bonimed | 451-476-03 | |
| Curved micro scissors | Medicon | 05.15.83 | |
| Straight micro scissors | AESCULAP | FD12 | Fine incision |
| Scissors | AESCULAP | BC211W | |
| Micro needle holder | AESCULAP | FD241R | Reconstruction |
| Mayor-Hegar Needle holder | Mizuho Ikakogyo | 06-798-00 | Abdominal closure |
| DeBakey Bulldog clamp (straight) | ULRICH | CV3054 | |
| DeBakey Bulldog clamp (curved) | CODMAN | 37-1062 | |
| Satinsky clamp | Mizuhoika | 09-230-24 | |
| Peripheral vascular clamp | Teleflex Medical | 353494 | Recipient SHVC |
| Micro vessel clamp (disposable) | AROSurgical Instruments Corporation | TKM-1-60 g | PV, graft IHVC, and recipient HA |
| Micro vessel clamp (metal) | Fine Science Tools Inc. | 18052-01 | Recipient IHVC |
| Lactated Ringer solution | Fresenius Kabi | 6150917.00.00 | |
| Normal saline solution | DeltaSelect | 1299.99.99 | |
| HTK solution | Dr. Franz Köhler Chemie GmbH | 31268.00.00 | Preservation solution |
| Heparin-Natrium | Ratiopharm | 5394.02.00 | 500 IU before graft perfusion |
| 8.4% sodium bicarbonate | Fresenius Kabi | 4399.97.99 | 0.5 ml after reperfusion |
| 5% Glucose solution | B. Braun | 6714567.06.00 | 1.0 ml after reperfusion |
| Cefuroxim sodium | Fresenius Kabi | 38985.01.00 | Antibiotic, 16 mg/kg |
| Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | Painkiller, 0.1 mg/kg |
| Intensive Care Unit Cage | Brinsea Products Ltd. | Vetario S10 | Postoperative care |
References
- Puhl, G., et al. Low viscosity histidine-tryptophan-ketoglutarate graft flush improves subsequent extended cold storage in University of Wisconsin solution in an extracorporeal rat liver perfusion and rat liver transplantation model. Liver Transpl. 12, 1841-1849 (2006).
- Yagi, S., et al. Improved Preservation and Microcirculation with POLYSOL After Partial Liver Transplantation in Rats. J Surg Res. 167, e375-e383 (2011).
- Engemann, R., Ulrichs, K., Thiede, A., Muller-Ruchholtz, W., Hamelmann, H. Value of a physiological liver transplant model in rats. Induction of specific graft tolerance in a fully allogeneic strain combination. Transplantation. 33, 566-568 (1982).
- Sumimoto, R., Shinomiya, T., Yamaguchi, A. Influence of hepatic arterial blood flow in rats with liver transplants. Examination of donor liver-derived serum class I MHC antigen in rats with liver transplants with or without hepatic arterial reconstruction. Transplantation. 51, 1138-1139 (1991).
- Chaland, P., et al. Orthotopic liver transplantation with hepatic artery anastomoses. Hemodynamics and response to hemorrhage in conscious rats. Transplantation. 49, 675-678 (1990).
- Imamura, H., Rocheleau, B., Cote, J., Huet, P. M. Long-term consequence of rat orthotopic liver transplantation with and without hepatic arterial reconstruction: a clinical, pathological, and hemodynamic study. Hepatology. 26, 198-205 (1997).
- Zhong, Z., Theruvath, T. P., Currin, R. T., Waldmeier, P. C., Lemasters, J. J. NIM811, a mitochondrial permeability transition inhibitor, prevents mitochondrial depolarization in small-for-size rat liver grafts. Am. J. Transplant. 7, 1103-1111 (2007).
- Spiegel, H. U., Palmes, D. Surgical techniques of orthotopic rat liver transplantation. J. Invest. Surg. 11, 83-96 (1998).
- Lee, S., Charters, A. C., Chandler, J. G., Orloff, M. J. A technique for orthotopic liver transplantation in the rat. Transplantation. 16, 664-669 (1973).
- Lee, S., Charters, A. C. 3rd, Orloff, M. J. Simplified technic for orthotopic liver transplantation in the rat. Am. J. Surg. 130, 38-40 (1975).
- Kamada, N., Calne, R. Y. Orthotopic liver transplantation in the rat. Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage. Transplantation. 28, 47-50 (1979).
- Howden, B., Jablonski, P., Grossman, H., Marshall, V. C. The importance of the hepatic artery in rat liver transplantation. Transplantation. 47, 428-431 (1989).
- Gao, W., Lemasters, J. J., Thurman, R. G. Development of a new method for hepatic rearterialization in rat orthotopic liver transplantation. Reduction of liver injury and improvement of surgical outcome by arterialization. Transplantation. 56, 19-24 (1993).
- Zhao, D., Zimmermann, A., Wheatley, A. M. Morphometry of the liver after liver transplantation in the rat: significance of an intact arterial supply. Hepatology. 17, 310-317 (1993).
- Omura, T., Ascher, N. L., Emond, J. C. Fifty-percent partial liver transplantation in the rat. Transplantation. 62, 292-293 (1996).
- Lehmann, T. G., Bunzendahl, H., Langrehr, J. M., Neuhaus, P. Arterial reconstruction in rat liver transplantation--development of a new tubing technique of the common hepatic artery. Transpl. Int. 18, 56-64 (2005).
- Reck, T., et al. Impact of arterialization on hepatic oxygen supply, tissue energy phosphates, and outcome after liver transplantation in the rat. Transplantation. 62, 582-587 (1996).
- Hasuike, Y., et al. A simple method for orthotopic liver transplantation with arterial reconstruction in rats. Transplantation. 45, 830-832 (1988).
- Steffen, R., Ferguson, D. M., Krom, R. A. A new method for orthotopic rat liver transplantation with arterial cuff anastomosis to the recipient common hepatic artery. Transplantation. 48, 166-168 (1989).
- Knoop, M., Bachmann, S., Keck, H., Steffen, R., Neuhaus, P. Experience with cuff rearterialization in 600 orthotopic liver grafts in the rat. Am. J. Surg. 167, 360-363 (1994).
- Hickman, R., Engelbrecht, G. H., Duminy, F. J. A technique for liver transplantation in the rat. Transplantation. 48, 1080 (1989).
- Liu, T., Freise, C. E., Ferrell, L., Ascher, N. L., Roberts, J. P. A modified vascular "sleeve" anastomosis for rearterialization in orthotopic liver transplantation in rats. Transplantation. 54, 179-180 (1992).
- Li, J., et al. Modified sleeve anastomosis for reconstruction of the hepatic artery in rat liver transplantation. Microsurgery. 22, 62-68 (2002).
- Martins, P. N., Theruvath, T. P., Neuhaus, P. Rodent models of partial hepatectomies. Liver Int. 28, 3-11 (2008).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen & Co. Ltd. London. reprinted by UFAW (1992).
