Summary
Orthotopic levertransplantasjon hos rotter er en uunnværlig eksperimentell modell for biomedisinsk forskning. Her presenterer vi våre kirurgiske prosedyrer for orthotopic rotte levertransplantasjon med nedsatt arteriell rekonstruksjon ved hjelp av en 50% delvis pode.
Abstract
Orthotopic levertransplantasjon (OLT) i rotter ved hjelp av et helt eller delvis pode er en uunnværlig eksperimentell modell for transplantasjon forskning, for eksempel studier av pode bevaring og iskemi-reperfusjonsskade 1,2, immunologiske responser 3,4, hemodynamikk 5,6, og liten-for-størrelse syndrom 7. Rotte OLT er blant de vanskeligste dyremodeller i eksperimentell kirurgi og krever avanserte mikrokirurgiske ferdigheter som tar lang tid å lære. Følgelig har bruken av denne modellen vært begrenset. Siden pålitelighet og reproduserbarhet av resultater er viktige komponenter i eksperimenter der slike komplekse dyremodeller brukes, er det viktig for kirurger som er involvert i rotte OLT å bli opplært i godt standardiserte og sofistikerte prosedyrer for denne modellen.
Mens ulike teknikker og modifikasjoner av OLT i rotter er rapportert 8 siden den første modellen ble described av Lee et al. 9 i 1973, eliminering av den hepatiske arterielle gjenoppbygging 10 og innføringen av mansjetten anastomose teknikken ved Kamada et al. 11 var et stort fremskritt i denne modellen, fordi de forenklede gjenoppbyggingen prosedyrer i stor grad . I vår modell ved Kamada et al. Ble nedsatt rearterialization også eliminert. Siden rotter kan overleve uten nedsatt arteriell strøm etter levertransplantasjon, var det betydelig uenighet om verdien av nedsatt arterialization. Imidlertid har den fysiologiske overlegenhet arterialized modellen stadig anerkjent, spesielt med tanke på å bevare galle kanalsystem 8,12 og leveren integritet 8,13,14.
I denne artikkelen presenterer vi detaljerte kirurgiske prosedyrer for en rotte modell av OLT med nedsatt arteriell rekonstruksjon ved hjelp av en 50% delvis pode etter ex vivo lever stasjonssjon. Gjenoppbyggingen prosedyrer for hvert enkelt fartøy og galle duct er utført av følgende metoder: en 7-0 polypropylen kontinuerlig suture for overnasjonale og infrahepatic vena cava, en mansjett teknikk for portvenen, og en stent teknikk for leverpulsåren og galle duct.
Protocol
1. Grunnleggende teknikker og felles prosedyrer
- Alle prosedyrer blir utført under rene, men nonsterile forhold.
- Når kroppshulen til rotte åpnes, blir alle prosedyrer utført under et kirurgisk mikroskop med en forstørrelse på 16x. Unntakene er ex vivo leverreseksjon, som er utført ved 10x, og følgende prosedyrer, som er utført på 25x: innsetting av en stent i galleveier og leverpulsåren, og gjenoppbyggingen av nedsatt arterien, den infrahepatic vena cava (IHVC), og gallegang.
- Bomullspinner brukes for skånsom manipulering av organer, sløv disseksjon av vev, og komprimering hemostase. Gasbind vattpinner (5 x 5 cm) fuktet med melkesur Ringers løsning brukes til å trekke lever-eller tarmen, og å holde organer fuktig. Den Satinsky klemmen kan brukes til tilbaketrekking av gasbind-dekket innvollene mot venstre eller halen av rotte å utvide kirurgiske felt rundt IHVC.
- Alle ligations utføres med en 6-0 silketråd unntak pedicles av lever lobes under ex vivo leverreseksjon, der 4-0 silke tråder er brukt. Ligaturen kan bli trukket av en DeBakey Bulldog klemme eller andre virkemidler for å gi tilstrekkelig spenning til ligert punktet slik at den andre ligatur kan gjøres på en avstand til den første, og skillet mellom de to ligert poeng kan gjøres ordentlig.
- Alle intravenøse injeksjoner utføres gjennom penis blodåre.
- Under gjenoppbyggingen prosedyrer for suprahepatic vena cava (SHVC), portvenen, leverpulsåren og gallegang, en liten klump av oljebasert leire brukes til å holde en finger ring av en perifer vaskulær monteringsring eller mygg tang å holde dem fast på plass.
2. Presurgical Forberedelse
- Hann Lewis rotter med vekt mellom 230 og 250 g benyttes som donor og mottaker for levertransplantasjon. Rottene er alleowed fri tilgang til vann og mat inntil induksjon av anestesi.
- Mansjett for portvenen (Figur 1): Forbered mansjetten for portvenen ved å kutte en 14-gauge kateter med en nr. 11 skalpell blad under mikroskopet. Mansjetten består av en kropp, og en utvidelse, hver med en lengde på 2 mm. Lag periferielle spor på mansjetten ved å klemme veggen av mansjetten trinnvis omkretsmessig med en mygg tang slik at en tråd kan festes tett på mansjetten uten slipping av.
- Stenter for gallegang og hepatiske arterien (figur 1): 24-gauge Cut katetre med en skalpell i mikroskop for å produsere skråkanter på begge ender av katetrene med en lengde på 4 mm for leverpulsåren og 5 mm for gallegang .
3. Donor Drift
Skjemaet i fjerning av leveren fra donor rotte er vist i figur 2. Denne fremgangsmåten krever caimately 30-35 min.
- Anesthetize rat med innånding av 4 vol% isofluran i 100% oksygen ved en strømningshastighet på 4 l / min for induksjon av anestesi, og 1,5 vol% ved 2 l / min for vedlikehold. Injiserer buprenorfin (0,1 mg / kg) subkutant som et analgetikum. Plasser rotte på en varmepute, og fikse overarmene ved hjelp av magnetiske Fixatorens tilbaketrekkingen system (Figur 3a). Barbere pels fra hele mageområdet av rotte, og sterilisere den tilsvarende huden med en povidon-jod-løsning.
- Åpne buken av en midtlinjesnitt med bilaterale utvidelser. Plasser en 5 ml sprøyte under baksiden av rotte slik at SHVC heves ventrally. Ved hjelp av en mygg tang, klemme og trekk xiphoid prosessen mot hodet, og bruke subcostal retractors å åpne kirurgiske feltet (Figur 3a).
- Dissekere falciform ligament og venstre trekantede ligament. Deretter ligere og dele den venstre phrenic vene.
- Henthandle median og venstre sidefliker oppover med en våt gasbind vattpinne. Ved hjelp av bipolar tang, koagulere og dele para-esophageal fartøy mellom venstre lateral og anterior caudatus lapp.
- Flytt tarmen utenfor magen på venstre side av rotte, og dekke dem med en våt gasbind vattpinne. Trekke høyre lateral lapp oppover med en våt gasbind vattpinne. Isoler IHVC fra retroperitoneal vev, og ligere rett adrenal venen, som deles senere like før graftet fjerning.
- Å sette inn en stent i gallegang (Figur 3b):
- Ligere galle kanalsystem på nivået av den forgrenede av gastroduodenale arterie. Det myke vevet som omgir gallegang bør bevares så mye som mulig, og adskillelsen av gallegang fra leverpulsåren bør unngås for å sikre tilstrekkelig arteriell blodforsyning til gallegang.
- Med rette mikro saks, gjør et lite snitt i anterieller veggen i gallegang proksimalt for ligert punktet. Mens du holder den fremre vegg av snittet med en rett mikro tang i venstre hånd, sette inn en stent inn i kanalen ved hjelp av en buet mikro tang i høyre hånd, og fest den med en 6-0 silketråd. En av den kongruent av tråden på gallekanalen holdes på en lengde på 4 mm, slik at tråden kan holdes under den senere anastomose.
- Frigjøre portvenen fra pylorusstenose og milt årer ved ligering og dele dem.
- Ligere og dele gastroduodenal arterien, så isolere den felles nedsatt arterie (CHA) fra bukspyttkjertelen hodet til roten. Roter leveren til høyre med bomullspinner, og dissekere ligament rundt på baksiden av leveren og spiserør.
- Ved ferdigstillelse av forberedelsene til leveren excision, fjerne haker, mygg tang for xiphoid prosessen, og 5-ml sprøyte under baksiden av rotte. Returner tarmen til abdominal hulrom.
- Injiser 500 IE av heparin-Natrium i 2 ml fysiologisk saltvann gjennom penile blodåre. Omtrent 3 minutter senere, tilbakestille 5-ml sprøyte, mygg tang, og retractors. Ligere de CHA proksimalt for røttene. Holde en av den kongruent av tråden ligert for CHA lang.
- Etter å klemme IHVC nær høyre nyre blodåre med en mygg tang, klemme portvenen med en disponibel mikro fartøy klemme under stubben av splenogen vein. Incise den fremre vegg av portvenen, og sette inn et 18-gauge kateter inn i portvenen.
- Perfuse leveren in situ med 60 ml kald histidin-tryptofan-ketoglutarat (HTK) oppløsning ved et hydrostatisk trykk på 20 cm H 2 O. Umiddelbart etterpå, klippe membranen og skjære over intratorakal vena cava, og kutte den fremre veggen av IHVC åpen for å la perfusjon løsningen som skal skylles ut av leveren (Figur 3c).
- Klemme IHVC med disposable mikro fartøy klemme rett under leveren. Avgiftsdirektoratet leveren ved dissekere IHVC litt under midtpunktet mellom leveren og høyre nyre vene, portvenen under stubben av splenogen venen, diafragma, vil de resterende leddbånd på baksiden av leveren, høyre adrenal vein, og CHA ved roten. Plasser det utskårende leveren i kaldt HTK løsning i en metall kopp montert i en plastboks full av knust is.
4. Ex vivo Graft Forberedelse
Alle prosedyrer for leveren pode utføres i metall kopp fylt med iskald HTK løsning. Ex vivo pode forberedelse krever omtrent 30 min.
- For festing av en mansjett til portvenen (figur 4):
Spenn fast portal venøs bagasjerommet med en DeBakey Bulldog klemme. Plasser klemmen i en brodannende stilling over koppen (Figur 4a, b). Sett portvenen gjennom mansjetten, og klemmeportvenen igjen sammen med utvidelsen av mansjetten på tolv (figur 4c). EVERT veggen av portvenen over mansjetten å plassere stumpen av den splenogen venen utenfor mansjetten ved 7:00 (figur 4d), og sikre portvenen med en 6-0 silketråd (figur 4e) . - Å sette inn en stent i leverpulsåren (figur 5):
Fest leveren ved å klemme begge kantene av mellomgulvet med tang, og trekk CHA rett ved å holde ligert tråden med DeBakey Bulldog klemme (figur 5a). Med rette mikro saks, gjør et lite snitt i fremre vegg av CHA. Med venstre hånd, hold den fremre vegg av snittet med en rett mikro pinsett, og med høyre hånd, sette inn en stent inn i CHA ved hjelp av en buet mikro tang. Stent er tidligere vasket med Heparin-Natrium-oppløsning (100 IE / ml) (figur 5b-d). Secure stenten med en 6-0 silketråd, og holde en av kuttet ender av tråden på en lengde på 4 mm. Skyll leveren gjennom arteriekateter med 5 ml kald HTK løsning. - For 50% leverreseksjon (figur 6):
- Klemme bakre caudate lapp med en mygg pinsett for å fikse det på plass. Resect lapp etter ligering av sin pedicle med en 4-0 silketråd (figur 7a). På samme måte, fjerne den fremre caudate lobe.
- Rotere plastikk boks 90 grader. Klemme den høyre kanten av membranen og venstre del av median lapp. Lag et lite snitt i den øvre kanten av rammen av de bilaterale partier av median lobe, og deretter fjerne den venstre del etter ligering (figur 7b). Ta av til venstre lateral lapp etter ligation av pedicle med en 4-0 silketråd. Cauterize den resected leveren overflaten forsiktig med bipolar tang. Som et resultat, er leveren massen redusert med enpproximately 50% 15 (figur 7c, d).
- For plasty av SHVC (figur 8):
Bestem posisjonen av leveren ved fastspenning begge kantene av membranen med en mygg forceps (figur 8a). Trimme den fremre vegg av SHVC ved å fjerne den tilsvarende membran. Feste to 7-0 polypropylen suturer fra utsiden til innsiden på begge hjørnene som bo suturer for senere anastomose (Figur 8b). Så trim den bakre veggen av SHVC. - Oppbevar leveren pode ved 4 ° C i oppløsning i et HTK kaldtvannsbad.
5. Mottaker Drift
Skjemaet i pode implantasjon i mottakerens rotte er vist i figur 9. Mottakeren operasjonen krever 60-70 minutter, som omfatter 10-11 min av anhepatic tid og ca 23-24 min av IHVC fastspenning tid.
- Utføre de samme prosedyrene som i donor drift (3,1 til 3,4) med unntak av åpningen av abdomen ved et midtlinjesnitt, uten bilaterale utvidelser (figur 10A).
- Plasser en våt gasbind vattpinne over høyre side av tolvfingertarmen og hele tarmen for å oppnå en kirurgisk felt rundt IHVC. Sett venstre lateral og median lobes inn i venstre subfreniske hulrom, og trekk rett lateral lapp oppover med en våt gasbind vattpinne. Isolere IHVC fra retroperitoneal vev. Ligere og dele den rette adrenal blodåre (figur 10b). Med en våt gasbind og bomull vattpinner, rotere leveren til venstre, og dissekere ligament rundt baksiden av leveren.
- Returner til høyre lateral lapp til den anatomiske posisjon. Plasser en våt gasbind vattpinne til å dekke og trekke median og venstre sidefliker oppover. Skjære over gallegang like under gren fra caudatus lobe. Det myke vevet som omgir gallegang bør bevares så mye som mulig. Hold en av kutt endene av thles ligert for gallegang ved 4-mm lang.
- Ligere og dele gastroduodenal arterie og riktig leverpulsåren på en 3-mm avstand til forgrening fra CHA. Deretter gjør en Y-struktur av arterien på slutten av CHA. Holde en av den kongruent av tråden ligert for riktig leverpulsåren til 4-mm lang. Roter leveren til høyre med bomullspinner, og dissekere ligament rundt baksiden av leveren fra venstre side.
- Etter intravenøs injeksjon av 2 ml Ringer-laktat-løsning, klemme IHVC med et metall mikro fartøy klemmen like over høyre nyre vene. Spenn portvenen på nivået av bifurkasjon sin i leveren hilum av en mygg tang fra den venstre side av rotte. Spenn SHVC sammen med membranen fra høyre side av en perifer vaskulær klemme, og fikse finger ring av klemmen i en klump av oljebasert leire.
- Reduser anestesi med isofluran til 0,4 vol% i løpet av anhepatic tid (varighetav kryss-klemming av portvenen). Avgiftsdirektoratet mottakeren innfødte lever ved å dissekere den SHVC, portvenen, og IHVC på følgende nivåer: SHVC, på grensen mellom SHVC og leveren, og portvenen, like over kjeven av mygg tang, og den IHVC, litt under midtpunktet mellom leveren og høyre nyre vene (figur 10c). Legg leveren pode orthotopically.
- For anastomosen av SHVC av en kontinuerlig sutur (figur 11):
- Bruk en buet mikro pinsett i venstre hånd under suturering prosedyren for griping åreveggen eller holde suturering nålen. Først plasserer oppholdet sutur på mottakerens SHVC fra innsiden til utsiden ved hjelp av den vedlagte 7-0 polypropylen på høyre hjørne av pode etterfulgt ved å knytte en knute (eller du kan knytte det tross alt suturing prosedyrer er fullført). Deretter plasserer det andre oppholdet sutur på samme måte på den venstre korneh, som vil bli den som starter søm av en løpende sutur. Å utvide anastomose, bør du holde og vedlikeholde sting ved hjelp DeBakey bulldog klemmer på begge hjørner med milde trekkraft superiolaterally (Figur 11a, b).
- Pierce sutur i venstre hjørne gjennom veggen på den podede side fra utsiden til innsiden tett til knuten utenfor, og suturere bakre raden i SHVC intraluminally med 7-8 masker til høyre hjørne (figur 11c). Gjør de første par sting nøye, slik at innsiden lumen står overfor hverandre. Til høyre hjørne, eller stikk 7-0 polypropylen gjennom fartøyet på pode side på utsiden.
- Deretter sy fremre rad fra utsiden, fra høyre til venstre, med ca 10 masker (figur 11d). Før fullførelsen av fremre raden, skyll innsiden med melkesur Ringers løsning for å fjerne luftbobler. Gjør det siste stinget i fremre rad så nær sommulig til oppholdet sutur i venstre hjørne, og deretter binde dem sammen.
- For gjenoppbyggingen av portvenen av en mansjett teknikk (Figur 12):
- Trekk inn median og venstre sidefliker oppover med en våt gasbind vattpinne. Klemme mottakeren portvenen på sitt samløpet med pyloriske blodåre ved hjelp av en engangs mikro fartøy klemme fra høyre. Fest mygg tang som klemmer portvenen i leire, og trekk spissen av tang mot leveren hilum (Figur 12a, b).
- Incise den fremre vegg av portvenen like under kjeven av mygg tang. Vaske innsiden av mottakerens portvenen og mansjetten med melkesur Ringers oppløsning. Hold den fremre vegg av snittet med en rett mikro tang i venstre hånd og en utvidelse av mansjetten med en buet mikro tang i høyre hånd. Sett mansjetten inn mottakerens portvenen dypt, og fest den med enomkretsretningen 6-0 silketråd (figur 12c-f).
- Slipp klemmer portvenen og SHVC, og deretter reperfuse leveren. Fjern 5 ml sprøyte fra baksiden av rotte, og øke konsentrasjonen av isofluran til 0,8 vol%.
- For rekonstruksjon av leverpulsåren ved en stent teknikk 16 (fig. 13):
- Først holde tråden til mottakeren riktig leverpulsåren av en mygg tang fra venstre side, og dra det mot leveren hilum, og deretter klemme mottaker CHA fra høyre side nær bukspyttkjertelen (figur 13a).
- Med en rett mikro tang, lage et lite snitt i bifurkasjon av Y-strukturen på slutten av mottakerens CHA å foreta en traktformet åpning. Hold stent plassert i transplantatet CHA med en buet mikro tang. Etter vasking hver lumen med heparin-Natrium-oppløsning (100 IE / ml), skyves stenten inn recipient CHA og fest den med en 6-0 silketråd. Tie ene enden av denne tråd på mottakeren CHA og den 4-mm tråd om graftet CHA sammen slik at begge Chas komme nærmere hverandre med redusert spenning i anastomotisk (figur 13b). Etter det, slipp klemmen.
- For anastomosen av IHVC av en kontinuerlig sutur (figur 14):
Anastomose på samme måte som for SHVC, men bruke flere masker med finere bite (figur 14a-d). Knytte av suturene på siste sting kan elimineres, eller binde kan oppnås med en vekstfaktor for å unngå anastomotisk striktur forårsaket ved å binde for stramt. Etter declamping, øker konsentrasjonen av anestesi til 1,0 vol%. Hvis anastomose ser stenotisk, strekke anastomotisk nettstedet ved å trekke de bilaterale opphold suturer eller utvide den fremre rad forsiktig for å utvide anastomose. - Administrer 0,5 ml 8,4% natrium-bikarbonat solution med 1,0 ml Ringer-laktat-løsning intravenøst.
- Påfør små fragmenter av TachoSil å forsegle resected leveren overflaten for å hindre blødning og galle lekkasje.
- For gjenoppbyggingen av galle duct av en stent teknikk:
- Hold tråden til mottakeren gallegang av en mygg tang fra venstre side. Fest mygg tang i leire, og trekk spissen av tang mot leveren hilum.
- Gjør et lite snitt i galle duct på riktig nivå, slik at den rekonstruerte galle duct ikke ville være for lang. Sett stent plassert i transplantatet galle duct inn mottakeren kanal med forsiktig oppmerksomhet for å unngå en vri, og fest den med en 6-0 silketråd. Knytte dette tråden på mottakerens kanal og den 4-mm tråd på pode kanalsystem sammen slik at begge kanaler komme nærmere hverandre med redusert spenningen i anastomotisk nettstedet.
- Ved ferdigstillelse av gjenoppbyggingen prosedyrer, injisere 1 ml av 5% glukoseoppløsning intravenøst (figur 15).
- Bekreft tilstrekkelig hemostase, og lukk deretter abdominal snitt av kontinuerlige 4-0 Vicryl sting i to lag.
6. Postoperativ behandling og oppfølging
Umiddelbart etter operasjonen, behandle mottakeren rotte med en subkutan injeksjon av cefuroksim natrium (16 mg / kg) og buprenorfin (0,1 mg / kg) i totalt 1,5 ml fysiologisk saltvann. La rotte å gjenopprette for 60 min i en spesiell intensivavdeling bur med oppvarmet luft (30-35 ° C) og en oksygentilførsel. Injisere buprenorfin (0,1 mg / kg) subkutant som et smertestillende hver 12. time i 3 dager. Etterpå flytte rotte til en normal bur, og gi ad libitum adgang til vann og mat.
Representative Results
Alle mottaker rotter (n = 20) overlevde uten åpenbare komplikasjoner inntil planlagt eutanasi for blodprøvetaking ved 1, 3, 24, og 168 timers (7 dager) etter portalen reperfusjon (n = 5 på hvert tidspunkt). Blodprøvene var samlet inn fra IHVC ved en direkte punktering med en 27-gauge nål. Etter sentrifugering ved 5340 xg i 10 min, ble serumprøver oppnådd og analysert for (ALAT) nivåer, som reflekterer graden av hepatocellulær skade etter transplantasjon. Tiden-løpet av endringer i serum ALAT nivåer er vist i Figur 16. ALAT nådde en topp på 24-timers (gjennomsnitt ± standardavvik: 212,6 ± 67,9 IU / L) og deretter falt til innenfor normale grenser ved 168 timers (33,6 ± 6,8 IU / L).
Figur 1. En mansjett for portvenen (PV) fra en en4-gauge kateter, og stenter for leverpulsåren (HA) og gallegang (BD) fra 24-gauge kateter.
Figur 2. Skjema ved flyttingen av leveren fra donor rotte BD, gallegang,. HA, nedsatt arterie, IHVC, infrahepatic vena cava, PV, portvenen, SHVC, suprahepatic vena cava.
Figur 3. Donor drift. et. Rotten plasseres på en varmepute med en magnetisk Fixatorens retraksjon system. Buken åpnes ved et midtlinjesnitt med bilaterale utvidelser. B.. Innsetting av stenten i gallen kanalsystem. C.. Perfusjon av leveren gjennom portvenen. Forkortelser er forklareed i Figur 2.
Figur 4. Festing av en mansjett til portvenen. a, b. Den DeBakey klypen som griper portalen venøs bagasjerommet plasseres over metall kopp. Koppen er montert i plastboks fylt med knust is. C.. Portvenen er satt gjennom mansjetten. D.. Veggen av portvenen er utkrenget over mansjetten med stubben av splenogen venen utenfor mansjetten ved 7 posisjon klokken og en forlengelse av mansjetten ved 12:00 posisjon. e. portvenen er sikret med en periferisk 6-0 silketråd på mansjetten. De svarte pilene viser stubben av splenogen vein.
Figur 5. Ex vivoinnsetting av en stent i leverpulsåren. en. Leveren festes ved fastspenning begge kantene av membranen og leverpulsåren trekkes rett ved å holde tråden ligert for arterien. b.. Den fremre vegg av lite snitt på leverpulsåren holdes med en rett mikro tang . c, d. Stenten settes inn leverpulsåren og sikret med en 6-0 silketråd.
Figur 6. Skjemaet for ex vivo 50% leverreseksjon. Lobes i grå farge er fjernet. ACL, fremre caudatus lobe, PCL, posterior caudatus lobe, LLL, venstre lateral lapp, LML, venstre del av median lapp, RML, høyre del av median lapp, SRL, overlegen høyre lateral lapp, IRL, dårligere høyre lateral lapp.
Figur 7. Ex vivo 50% leverreseksjon. en. ligering av pedicle av bakre caudate lobe. b.. ligering av pedicle av venstre parti av median lobe. c.. Leveren før 50% reseksjon. d.. Leveren etter 50% reseksjon.
Figur 8. Ex vivo plasty av suprahepatic vena cava. en. Leveren er fast ved å klemme begge kantene av mellomgulvet med mygg tang. b.. Hold sting med 7-0 polypropylen er festet i begge hjørnene.
Figur 9. Skjema av graftet implantering i mottakerens rotte. Gjenoppbygging prosedyrer blir utført for den supra-og infrahepatic vena cava (SHVC og IHVC) med en 7-0 kontinuerlig sutur, portvenen (PV) av en mansjett teknikk, og nedsatt arterie (HA) og gallegang (BD) av en stent teknikk.
Figur 10. Mottaker operasjon til fjerning av de innfødte leveren. en. Buken åpnes av et midtlinjesnitt. b.. Retten adrenal vene er ligert. c.. Native leveren er utskåret. Forkortelser er forklart i figur 2.
Figur 11. Anastomose av suprahepatic vena cava. a, b. Den perifere vaskulære klemme for suprahepatic vena cava er løst i en klump av oljebasert leire. Oppholdet sting på begge hjørnene blir vedlikeholdt med milde trekkraft superiolaterally å utvide anastomose. C.. Kontinuerlig intraluminal sutur av bakre rad pågår. D.. Kontinuerlig sutur av fremre rad pågår.
Figur 12. Rekonstruksjon av portvenen. a, b. Mygg tang clamping portvenen er festet i det oljebaserte leire og trukket mot leveren hilum. jfr. Innsetting av mansjetten i portvenen.
Figur 13. Rekonstruksjon av nedsatt arterien. a, b. g> Innsetting av en stent i mottakeren felles leverpulsåren (CHA) ved bifurkasjon av riktig leverpulsåren (PHA) og gastroduodenale arterie (GDA).
Figur 14. Anastomose av infrahepatic vena cava. en. Oppholdet suturer på begge hjørner. b.. Kontinuerlig sutur av bakre rad. c.. Kontinuerlig sutur av fremre rad. d.. Reperfusjon av infrahepatic vena cava. Forkortelser er forklart i figur 2.
Figur 15. Alle gjenoppbygging prosedyrer er ferdig. Forkortelser er forklart i figur 2.
"Figur 16" src = "/ files/ftp_upload/4376/4376fig16.jpg" />
Figur 16 Postoperativ tid løpet av endringer i serum (ALAT)-nivåer (n = 20, n = 5 på hvert tidspunkt).. Data er uttrykt som middel med feilfelt som indikerer standardavvik. ALAT nådde en topp på 24-timers (212,6 ± 67,9 IU / L) og deretter falt til innenfor normale grenser ved 168 timers (33,6 ± 6,8 IU / L).
Discussion
Den første modellen av rotte OLT ble rapportert av Lee et al. I 1973 9, der alle skip inkludert leverpulsåren ble rekonstruert av en hånd-sydd metode og den ekstrakorporale portosystemic shunten ble brukt. Denne modellen var teknisk komplisert og vanskelig å utføre. Den neste modellen var en uten nedsatt arteriell rekonstruksjon og ekstrakorporale shunt, utviklet av de samme forfatterne 10 i 1975. Senere i 1979, introduserte Kamada et al. Mansjetten anastomose teknikk for modellen uten nedsatt rearterialization 11. Med disse endringene, ble OLT hos rotter forenklet med en forkortet anhepatic tid i mottakerlandene operasjoner og har vært mye brukt som en akseptert eksperimentell modell.
Imidlertid har det vært betydelig uenighet siden da over betydningen av nedsatt arterialization i rotte OLT 8 fordi arterialization var en krevende oppgave, men did ikke påvirke overlevelse etter transplantasjon. Tallrike studier på hepatisk arterialization bruker ulike rekonstruksjon teknikker har blitt rapportert 8, for eksempel en aorta segment til aorta anastomose 3,9,17, en mansjett anastomose teknikk 18,19,20, en teleskoperende 5 teknikk, en stent 13 teknikk, 16, og en hylse anastomose teknikk 12,21-23. Mens teknikken for rotte OLT er fortsatt ikke standardisert i dag, har arterialized modellen i økende grad foretrekkes i form av dens fysiologiske overlegenhet 8,12,13,14. Blant de ovennevnte teknikker, ble en stent teknikk som var enkel og rask å utføre rapportert av Lehmann et al. 16 i 2005. Studien viste gode resultater: ingen okklusjon satsen ble observert i den rekonstruerte leverpulsåren på 8 timer, 24 timer og 6 måneder etter reperfusjon. Vi har derfor vedtatt denne teknikken for nedsatt arterialization.
Vi prestama håndsydde anastomose for gjenoppbyggingen av SHVC og IHVC. Denne metoden gir den anastomotisk området med en optimal fysiologisk tilstand, noe som fører til redusert forekomst av trombose 8, og er best mikrokirurgi simulering og trening for kirurger. I tillegg kan den anastomose være mulig selv med korte fartøyets stubber. Vedrørende anastomose av IHVC, denne metoden ikke krever lang IHVC på pode side sammenlignet med mansjetten anastomose teknikk. Derfor, når donor nyre vene er dissekert for å gjøre graftet IHVC lang, er denne metoden gjelder transplantasjon av en liten pode som nødvendiggjør en lang IHVC, for eksempel en 30% pode som består av høyre laterale og caudatus lobes med kort intrahepatisk vena cava uten SHVC 2.
Når det gjelder teknikker for leverreseksjon hos rotter, hittil flere metoder er rapportert, de to store teknikker er den klassiske masse ligatur teknikkog fartøyet-orientert teknikk 24. Vi utfører klassiske ligaturen teknikk for 50% leverreseksjon 15, men under et kirurgisk mikroskop å gjøre prosedyren finere, og for å unngå skade på de gjenværende fliker og strukturer.
Vi beskrevet representative resultater fra mottakeren rotter i vår modell, rottene overlevde under 7-dagers observasjonsperiode uten tilsynelatende komplikasjoner. Modellen kan endres for ulike formål eksperimenter ved å velge de ulike innstillinger, for eksempel langvarig kjølelagring, langvarig varme iskemi som inkluderer donasjon etter hjertedød, og bruken av mindre lever grafts eller grafts fra eksperimentelle modeller av leverskade eller sykdommer.
I vår erfaring, er det tre viktige faktorer gjennom de prosedyrer som kan påvirke overlevelse etter transplantasjon, den mest pålitelige parameter for utfallet av rotte OLT: mengden av blodtap, den driftstid, espesielt klemming tiden av portvenen og IHVC, og tilstrekkeligheten av gjenoppbygging av hvert skip, noe som kan resultere i stenose, blodpropp eller blødning. I en treningsperiode på denne modellen, kan de fleste av de feil trolig være knyttet til disse faktorene. I denne videoen artikkelen presenterer vi trinn-for-trinn-instruksjoner for den kirurgiske prosedyrer for vår rotte modell av delvis OLT med nedsatt arteriell rekonstruksjon. Mens en rotte modell av OLT er komplisert og krever avanserte mikrokirurgiske ferdigheter, gir denne artikkelen masse praktisk informasjon, som skal tjene som en god guide for opplæring og læring av denne modellen. Lære dette modellen effektivt er spesielt viktig for å forkorte opplæringstiden, redusere antall dyr og kostnader som kreves for praksis, og senere gjengivelse pålitelige resultater i eksperimenter. Dette er i tråd med 3R-konseptet (erstatning, reduksjon og raffinering) av dyreforsøk, som ble postulert av Russell og Burch i1959 25.
Disclosures
Vi har ingen motstridende interesser å utlevere. Rottene er plassert under spesifikke-patogen-frie forhold i henhold til retningslinjene i Federation for Laboratory Animal Science Associations (FELASA). Alle forsøk ble gjennomført i henhold til den tyske føderale loven om beskyttelse av dyr og "Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr" (National Institutes of Health publikasjon nr. 86-23, revidert 1985).
Acknowledgments
Forfatterne takker Pascal Paschenda og Mareike Schulz for deres teknisk assistanse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical microscope | Leica | M651 | |
| Light source | Schott | KL1500LCD | |
| Cotton swabs | NOBA Verbandmittel | 974202 | |
| Gauze swabs (5x5 cm) | Fuhrmann | 10002 | |
| povidone-iodine solution | Mundipharma | 6108022.00.01 | |
| Oil-based clay | Debika corporation | 090148 | |
| TachoSil | Takeda Pharmaceuticals International GmbH | EU/1/04/277/001-004 | Applied to resected liver surface |
| Scalpel blade No. 11 | Pfm medical | 200130011 | Preparation of cuff and stents |
| 14-gauge catheter | B. Braun | 4268210S | Cuff for PV |
| 18-gauge catheter | B. Braun | 4268130S | Perfusion via PV |
| 24-gauge catheter | B. Braun | 4269071S | Stent for BD and HA |
| 4-0 silk suture | Resorba | H3F | Liver resection |
| 6-0 silk suture | Resorba | H1F | |
| 7-0 Prolene (polypropylene) suture | Ethicon | 8701H | SHVC and IHVC |
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | V304H | Abdominal closure |
| 5-ml syringe | Terumo | SS+T05ES1 | Back pillow |
| Heating pad | Thermo | 190 x 260 mm | |
| Magnetic fixator retraction system | Fine Science Tools Inc. | 18200-01 18200-02 18200-03 18200-12 |
|
| Cold water bath | Huber | 740.000X | Graft preservation |
| Bipolar forceps | Söring | MBC-200 | |
| Mosquito forceps | BONIMED | 451-476-03 | Two pairs used |
| Adson micro forceps | Dimeda | 10.176.12 | |
| Curved micro forceps | AESCULAP | FD281R | |
| Straight micro forceps | Bonimed | 451-476-03 | |
| Curved micro scissors | Medicon | 05.15.83 | |
| Straight micro scissors | AESCULAP | FD12 | Fine incision |
| Scissors | AESCULAP | BC211W | |
| Micro needle holder | AESCULAP | FD241R | Reconstruction |
| Mayor-Hegar Needle holder | Mizuho Ikakogyo | 06-798-00 | Abdominal closure |
| DeBakey Bulldog clamp (straight) | ULRICH | CV3054 | |
| DeBakey Bulldog clamp (curved) | CODMAN | 37-1062 | |
| Satinsky clamp | Mizuhoika | 09-230-24 | |
| Peripheral vascular clamp | Teleflex Medical | 353494 | Recipient SHVC |
| Micro vessel clamp (disposable) | AROSurgical Instruments Corporation | TKM-1-60 g | PV, graft IHVC, and recipient HA |
| Micro vessel clamp (metal) | Fine Science Tools Inc. | 18052-01 | Recipient IHVC |
| Lactated Ringer solution | Fresenius Kabi | 6150917.00.00 | |
| Normal saline solution | DeltaSelect | 1299.99.99 | |
| HTK solution | Dr. Franz Köhler Chemie GmbH | 31268.00.00 | Preservation solution |
| Heparin-Natrium | Ratiopharm | 5394.02.00 | 500 IU before graft perfusion |
| 8.4% sodium bicarbonate | Fresenius Kabi | 4399.97.99 | 0.5 ml after reperfusion |
| 5% Glucose solution | B. Braun | 6714567.06.00 | 1.0 ml after reperfusion |
| Cefuroxim sodium | Fresenius Kabi | 38985.01.00 | Antibiotic, 16 mg/kg |
| Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | Painkiller, 0.1 mg/kg |
| Intensive Care Unit Cage | Brinsea Products Ltd. | Vetario S10 | Postoperative care |
References
- Puhl, G., et al. Low viscosity histidine-tryptophan-ketoglutarate graft flush improves subsequent extended cold storage in University of Wisconsin solution in an extracorporeal rat liver perfusion and rat liver transplantation model. Liver Transpl. 12, 1841-1849 (2006).
- Yagi, S., et al. Improved Preservation and Microcirculation with POLYSOL After Partial Liver Transplantation in Rats. J Surg Res. 167, e375-e383 (2011).
- Engemann, R., Ulrichs, K., Thiede, A., Muller-Ruchholtz, W., Hamelmann, H. Value of a physiological liver transplant model in rats. Induction of specific graft tolerance in a fully allogeneic strain combination. Transplantation. 33, 566-568 (1982).
- Sumimoto, R., Shinomiya, T., Yamaguchi, A. Influence of hepatic arterial blood flow in rats with liver transplants. Examination of donor liver-derived serum class I MHC antigen in rats with liver transplants with or without hepatic arterial reconstruction. Transplantation. 51, 1138-1139 (1991).
- Chaland, P., et al. Orthotopic liver transplantation with hepatic artery anastomoses. Hemodynamics and response to hemorrhage in conscious rats. Transplantation. 49, 675-678 (1990).
- Imamura, H., Rocheleau, B., Cote, J., Huet, P. M. Long-term consequence of rat orthotopic liver transplantation with and without hepatic arterial reconstruction: a clinical, pathological, and hemodynamic study. Hepatology. 26, 198-205 (1997).
- Zhong, Z., Theruvath, T. P., Currin, R. T., Waldmeier, P. C., Lemasters, J. J. NIM811, a mitochondrial permeability transition inhibitor, prevents mitochondrial depolarization in small-for-size rat liver grafts. Am. J. Transplant. 7, 1103-1111 (2007).
- Spiegel, H. U., Palmes, D. Surgical techniques of orthotopic rat liver transplantation. J. Invest. Surg. 11, 83-96 (1998).
- Lee, S., Charters, A. C., Chandler, J. G., Orloff, M. J. A technique for orthotopic liver transplantation in the rat. Transplantation. 16, 664-669 (1973).
- Lee, S., Charters, A. C. 3rd, Orloff, M. J. Simplified technic for orthotopic liver transplantation in the rat. Am. J. Surg. 130, 38-40 (1975).
- Kamada, N., Calne, R. Y. Orthotopic liver transplantation in the rat. Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage. Transplantation. 28, 47-50 (1979).
- Howden, B., Jablonski, P., Grossman, H., Marshall, V. C. The importance of the hepatic artery in rat liver transplantation. Transplantation. 47, 428-431 (1989).
- Gao, W., Lemasters, J. J., Thurman, R. G. Development of a new method for hepatic rearterialization in rat orthotopic liver transplantation. Reduction of liver injury and improvement of surgical outcome by arterialization. Transplantation. 56, 19-24 (1993).
- Zhao, D., Zimmermann, A., Wheatley, A. M. Morphometry of the liver after liver transplantation in the rat: significance of an intact arterial supply. Hepatology. 17, 310-317 (1993).
- Omura, T., Ascher, N. L., Emond, J. C. Fifty-percent partial liver transplantation in the rat. Transplantation. 62, 292-293 (1996).
- Lehmann, T. G., Bunzendahl, H., Langrehr, J. M., Neuhaus, P. Arterial reconstruction in rat liver transplantation--development of a new tubing technique of the common hepatic artery. Transpl. Int. 18, 56-64 (2005).
- Reck, T., et al. Impact of arterialization on hepatic oxygen supply, tissue energy phosphates, and outcome after liver transplantation in the rat. Transplantation. 62, 582-587 (1996).
- Hasuike, Y., et al. A simple method for orthotopic liver transplantation with arterial reconstruction in rats. Transplantation. 45, 830-832 (1988).
- Steffen, R., Ferguson, D. M., Krom, R. A. A new method for orthotopic rat liver transplantation with arterial cuff anastomosis to the recipient common hepatic artery. Transplantation. 48, 166-168 (1989).
- Knoop, M., Bachmann, S., Keck, H., Steffen, R., Neuhaus, P. Experience with cuff rearterialization in 600 orthotopic liver grafts in the rat. Am. J. Surg. 167, 360-363 (1994).
- Hickman, R., Engelbrecht, G. H., Duminy, F. J. A technique for liver transplantation in the rat. Transplantation. 48, 1080 (1989).
- Liu, T., Freise, C. E., Ferrell, L., Ascher, N. L., Roberts, J. P. A modified vascular "sleeve" anastomosis for rearterialization in orthotopic liver transplantation in rats. Transplantation. 54, 179-180 (1992).
- Li, J., et al. Modified sleeve anastomosis for reconstruction of the hepatic artery in rat liver transplantation. Microsurgery. 22, 62-68 (2002).
- Martins, P. N., Theruvath, T. P., Neuhaus, P. Rodent models of partial hepatectomies. Liver Int. 28, 3-11 (2008).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen & Co. Ltd. London. reprinted by UFAW (1992).
