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Neuroscience

의 해부, 문화, 및 분석 Published: December 23, 2012 doi: 10.3791/4377
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biology, College of William and Mary
* These authors contributed equally

Summary

Xenopus laevis는 세포의 운명 사양 및 기본 세포 배양의 개별 망막 세포의 생리 기능을 연구하기위한 이상적인 모델 시스템을 제공합니다. 여기 망막 조직을 해부하고 칼슘 활동 이미징 및 현장 하이브리드 화에 의해 분석 기본 셀 문화를 생성하는 기법을 제시한다.

Abstract

신경 판의 앞쪽 영역이 척추 망막에 상승을 제공하는 과정은 임상과 기초 모두 연구의 주요 초점이되고 있습니다. 망막 질환을 이해하고 치료에 대한 명백한 의료 관련뿐만 아니라, 척추 망막의 개발을 이해 neuronal 세포 유형 결정과 차별화 1-16에 대한 중요하고 우아한 모델 시스템으로 제공하고 있습니다. 신경 망막은 틀에 박힌 층에 배치 여섯 개별 세포 유형 (신경절, 수평, amacrine photoreceptors, 양극성 세포와 뮐러 glial 세포), 대체로 모든 vertebrates 12,14-18 사이에 보존되어있는 패턴으로 구성됩니다.

그대로 개발 배아에서 망막을 공부하는 것은 분명이 복잡한 기관은 계층 구조로 forebrain의 돌출부에서 어떻게 전개되는지 이해가 필요합니다 동안 이리저리 혜택을 많은 질문이 있습니다m 추정 망막 세포의 주요 세포 배양 7,19-23을 사용하여 방식을 채용. 예를 들어, 서로 다른 단계에서 제거 dissociated 조직의 세포를 분석하는 것은 하나는 다른 발달 단계에서 개별 셀의 사양의 상태를 분별 할 수있다 즉, 주변 조직 8,19-22와의 상호 작용의 부재에있는 세포의 운명 ,24-33. 기본 세포 배양은 또한 탐정 특정 시약과 문화를 처리하고 단일 세포 수준 5,8,21,24,27-30,33-39에 결과를 분석 할 수 있습니다. Xenopus laevis의 연구 고전 모델 시스템은 초기 신경 발달 19,27,29,31-32,40-42은 망막 기본 세포 배양 10,38,43-45에 특히 적합한 시스템으로 제공하고 있습니다.

추정 망막 조직은 즉시 신경 유도 25,38,43 따라 개발 초기 단계에서 액세스 할 수 있습니다. 또한, 일을 부여태아의 각 셀 노른자의 공급을 포함에서 망막 세포가 버퍼 소금 솔루션으로 구성된 매우 간단한 정의 미디어에서 배양 할 수 있습니다, 따라서 부화 또는 기타 커 기반 제품 10,24,44-45의 혼란 효과를 제거 .

그러나, 주변 조직 및 후속 처리에서 망막 조직의 격리 도전하고 있습니다. 여기, 우리는 결과적으로, 단일 세포의 해상도 칼슘 활동 및 유전자 표현 분석됩니다 기본 셀 문화를 준비하는 데 사용됩니다 Xenopus laevis의 망막 세포의 분해 및 분리하기위한 방법을 제시한다. 본 논문에서 제시 한 주제 자발적인 칼슘 과도의 분석이지만, 기술은 연구 질문 및 접근 방법 (그림 1)의 다양한 배열 광범위하게 적용됩니다.

Protocol

모든 실험은 윌리엄과 메리의 대학 기관 동물 케어 및 사용위원회의 승인을 프로토콜에 따라 수행됩니다. 이 프로토콜에서 참조 발달 단계 Nieuwkoop와 페이버 46에 따라 수 있습니다.

1. 해부

  1. 세포 배양 매체와 실내 온도로 평형하는 칼슘 마그네슘 무료 매체 (CMF)를 허용합니다. 당신은 또한 0.1X 마크의 수정 된 벨소리의 (MMR) 산도를 7.4-7.6이 필요합니다.
  2. 세포 배양 층류 후드에서 30 분 동안 UV 빛을 적용하여 다음 항목을 살균. (후드에 배치하기 전에 70 %의 에탄올과 각 항목을 스프레이.)
    • 35mm 플라스틱 배양 접시.
    • 60mm 플라스틱 배양 접시.
    • 35mm Nunclon 표면 요리.
    • 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브.
    • P1000 micropipette (1,000 μl의 micropipette).
    • 에어로졸 방지 P1000 팁 (1,000 μl micropipette의 에어로졸 방지 도움말 참조).
    • 알코올방지 펜.
    • 포셉을 해부하고 좋아요.
    • * 15 ML 원뿔 튜브 (단 이미징 칼슘 활동).
    • * 만 칼슘 활동의 이미징을위한.
  3. 후드는 UV 소독 및 솔루션은 실내 온도에 equilibrated이되면, 동네에서 70 %의 에탄올과 장소 미디어 병 장갑과 미디어 병 다운 스프레이, 후드에 판상 공기 흐름을 설정합니다.
  4. 후드 내부 적절한 라벨을 보장 셀의 각 플레이트에 대해 P1000 micropipette으로 다음을 준비합니다.
    • 분해 플레이트 - 한 60mm 플라스틱 페트리 접시는 10 ML 셀 문화 매체를 포함.
    • 문화 판 - 한 35mm Nunclon 표면 요리는 2 ML 셀 문화 매체를 포함. (Nunclon 플라스틱 요리가 추가 된 접착제로 치료되지 않습니다.)
    • 하나의 빈 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브 Explant 분리 관.
    • * 한 15 ML 원뿔 매튜브 15 ML 셀 문화 매체를 포함. 초과 Fluo4-AM 이미징 칼슘 활동 때를 세척하십시오.
  5. 후드 내부, 각 분해 세션 P1000 micropipette (하나 이상의 망막이 한 세션에서 해부 할 수 있습니다)와 다음을 준비합니다.
    • 2 ML CMF를 포함하는 하나의 35mm 플라스틱 페트리 접시 - Explant이 판을 씻어.
    • Explant 분리 판 - 2 ML CMF를 포함하는 하나의 35mm 플라스틱 페트리 접시.
  6. 후드 이외의 다음을 준비 :
    • 10 ML 0.1X MMR을 포함하는 셀의 접시 당 하나의 60mm 플라스틱 페트리 접시 - 플레이트를 개최.
    • 10 ML 0.1X의 MMR을 포함하는 셀의 접시 당 하나의 60mm 플라스틱 페트리 접시 - 형제 자매 플레이트.
    • Anesthetization 판 - 10 ML 0.1X MMR + 0.5 MG / ML MS-222 (tricaine)를 포함하는 분해 세션 당 하나의 60mm 플라스틱 페트리 접시.
    7. Explant 해리 플레이트 (0.1 % 트립신 솔루션의 결과로)을 혼합 할 소용돌이에 CMF 40 μl 5 % 트립신을 추가하고 옆으로 설정합니다.
  7. 단계 30 세입니다 배아를 해부하면, 분해 플레이트 (1 MG / ML Collagenase B 솔루션의 결과로), 용해와 옆 설정 소용돌이에 10 밀리그램 Collagenase B를 추가합니다.
  8. 원하는 단계의 배아를 선택 비 멸균 전송 피펫으로 개최 플레이트에 전송, 고급 집게를 사용하여 vitelline 막을 (배아가 아직 부화하지 않은 경우)를 제거하십시오.
  9. 전송 여러가 동일하게 비 멸균 전송 피펫으로 형제 자매 판으로 배아를 개최.
  10. 배아 무대 25 이전 인 경우 비 무균 전송 피펫으로 Anesthetization 플레이트에 배아를 전송하고 움직임과 자극에 반응 중단 될 때까지 배아가 앉아 할 수 있도록, 그렇지 않으면 절개와 직접 진행합니다. 이 걸릴 수 있습니다최대 분합니다.
  11. 박리 범위 (4X 목적, 10X 접안 렌즈)에서 절개 (그림 2)로 진행합니다.

배아 단계 25 세 이하 :

  1. 비 살균 전송 피펫으로 분해 플레이트에 배아를 전송합니다.
  2. 고급 집게 두 쌍을 사용하여 뒤쪽 끝에 시작하고 배의 앞 부분에 시멘트 선을 통해 지속적으로, 배의 복부 측면에 midsagittal 몫을합니다.
  3. 컷 중 하나 가장자리를 물체를 움켜 왼쪽과 오른쪽 확산에 의해 배아를주의 깊게을 엽니 다. 분해 플레이트에 직면하고있는 등쪽면과 배아에서, 그리고 복부 외배엽있는이 결과는 내 endoderm과 중배엽을 나타 내기 위해 열려 확산.
  4. endoderm 및 중배엽 (그림 2A와 2B)을 제거 시작합니다. 이 조직의 첫 번째이자 최대 규모의 층은 다음과 같은 모양이 매우 "보송 보송"입니다대형 세포와 거의 분명 조직입니다.
  5. 이 항목을 제거한 후 somites 및 notochord이 표시 될 것입니다. 더 나은 대비를 들어, 10 ML 셀 문화 매체 및 분해 플레이트로 다시 전송하기 전에 2-3 분에 대한 나일 블루 황산의 1 % 솔루션 100 μl를 (물)를 포함하는 별도의 60mm 플라스틱 페트리 접시에 배아를 이동합니다. 이 쉽게 식별 및 방향 설정을 위하여 외배엽, somites 및 notochord을 얼룩 것입니다.
  6. 배의 앞 부분에 초점을 조심스럽게 notochord과 뇌와 광 소포 (그림 2C)를 노출 남은 중배엽를 제거합니다.
  7. 뇌 및 광 소포가 완전히 노출되면 뇌에 단 뒤 신경 튜브 및 기본 외배엽을 잘라야 포셉을 사용합니다.
  8. 외배엽이 위쪽에 있도록 통해이 부분을 (뇌와 광 소포) 설정합니다.
  9. 조심스럽게 기본 광 소포을 손상하지 않도록 조심을 다시 촬영(그림 2D) 외배엽 이동합니다.
  10. 마지막으로, 집게를 사용하여, 뇌 (그림 2D 및 2E)에서 광 소포를 구분합니다.

: 단계 25보다 배아는 세 이상

  1. 배아는 Anesthetization 플레이트에 있지만, 집게로 태아의 복부 부분을 제거합니다.
  2. 더 나은 대비를 들어, 10 ML 0.1X MMR과 분해 플레이트로 전송하기 전에 2-3 분 1 % 나일 블루 황산 100 μl를 포함하는 60mm 플라스틱 페트리 접시에 배아를 이동합니다. 이 외배엽의 파란색 얼룩 것입니다.
  3. 일단 분해 플레이트에서, 망막 (또는 배아 단계 26-30를위한 광 소포) (그림 2 층과 2G)를 놓인 외배엽을 뒤로 빼는거야. 나일 블루 황산이 사용 된 경우, 외배엽은 파란색 얼룩이 있지만 기본 망막 조직 안됩니다.
  4. 구경을 조심스럽게 망막 또는 광 소포를 제거rceps (그림 2H, 2I, 그리고 2J). 그것은 포셉 한 쌍의와 장소에 배아를 개최하고 망막 또는 다른과 광 소포를 제거하는 도움이 될 것입니다.

2. 조직 및 셀 도금의 분리

중요 참고 - 조직을 전송하면, 망막이나 시신경 소포는 공기 - 액체 경계를 터치하는 것을 허용하지 않습니다, 이러한 경우가 발생하면 세포가 lyse합니다.

  1. 광 소포 또는 망막이 해부되면, 조심스럽게 에어로졸 방지 방법을 사용하여 p100 micropipette으로 판을 씻어 30 초에 앉아서 할 수 Explant로 전송할 수 있습니다.
  2. Explant 분리 튜브에 Explant 해리 판에서 CMF의 0.1 % 트립신의 80 μl를 전송합니다.
  3. p100 micropipette 및 에어로졸 방지 팁을 사용하여 Explant에서 망막 또는 광 소포를 전송하면 Explant Dissociati에 플레이트를 씻어튜브에 explants의 전송을 피하는 것은 솔루션을 씻어.
  4. 조직은 실온에서 1 시간 동안 Explant 분리 튜브에 해리 할 수 있습니다. 한 망막이 판 당 사용되었다, 그러나 우리는 그렇게 판 당 세포의 수를 늘리기 위해 원하는 경우 하나 이상의 당 플레이트를 사용하는 것이 가능하다는 것을 유의하십시오.
  5. 판 세포를하려면 먼저 천천히 Explant 분리 관에서 솔루션 40 μl를 제거하고 p100의 micropipette 및 에어로졸 방지 방법을 사용하여 폐기하십시오. p100 세트 40 μl 및 에어로졸 방지 팁을 사용하여 문화 플레이트에 세포를 (현재 조직이 dissociated 가지고) 전송할 수 있습니다. 접시에 세포를 aspirating 때, 천천히 피펫과 접시의 중앙에있는 작은 영역에 세포를 유지.

참고 : 셀의 여러 이미지가 실험을하는 동안 촬영 할 경우, 문화 판의 아래쪽에 그리드 (Cellattice)를 첨부

  1. 세포가 Nunclon 판을 준수하는 데 적어도 1 시간에 방해받지 앉아 할 수 있습니다. 이 시간 이후, 그들은 매우 부드럽게 처리해야합니다거나 분리 될 수 있습니다.
  2. 세포와 같은 온도에서 키운하는 형제 배아를 관찰하여 원하는 단계에 문화 셀. 라이브 세포가 더 조작을 위해 사용하지 않는 경우이 시간에 MEMFA 솔루션에 고정 할 수 있습니다.

중요 참고 : 실험을의 대부분은 세포를 도금 6 시간 내에 해결됩니다. 문화의 세포의 수명은 조직을 해부 한의 단계와 세포에 남아있는 난황의 양에 따라 달라집니다, 세포에서 얻은 반면 젊은 (neurula 단계)에서 해부하는 세포는 5~6일에 문화 건강 유지 이전 배아 (올챙이 수영) 단계 2-3 일 동안은 문화에 가능한 상태로 유지됩니다.

3. 칼슘 이미징 47-49

이 프로토콜은 칼슘에 맞는 개별 셀에 칼슘 과도을 수량화 할 수 Fluo4-AM 및 공 촛점 현미경을 활용합니다. Fluo4-AM을 사용하는 모든 단계 Fluo4-AM 민감한 빛으로 빛으로부터 멀리 수행해야합니다. 모든 세차는 추가 또는 P1000 micropipette 및 에어로졸 방지 방법을 사용하여 제거해야합니다. Pipetting는 천천히 세포 방해가되지 않도록하기 판의 가장자리를 향해 수행해야합니다. 문화는 일반적으로 해부하고 6 시간 내에 고정되어 있기 때문에 미디어는 변경되지 않습니다. 장기적인 문화를 들어, 미디어는 매일 변경해야합니다.

  1. Fluo4-AM는 -20 ° C에 저장되어있다, 우리는 5 μl aliquots에 저장하는 것이 좋습니다. 사용하기 전에, 거리에 빛의 Fluo4는-AM의 5 μl 나누어지는을 해동하여 직접 나누어지는에 Pluronic F-127의 2 μl를 추가합니다.
  2. 시간의 원하는 금액을 배양 후 세포 (적어도1 시간), 문화 판에서 세포 배양 매체 1 ML를 제거합니다. 부드러운 pipetting으로 혼합, Fluo4-AM과 Pluronic이를 추가합니다.
  3. 천천히 이미징 될 수있는 세포의 문화 판의 가장자리에 다시이 솔루션의 모든 전송 및 Fluo4-AM을 흡수하는 1 시간에 방해받지이 솔루션에서 셀을 둡니다.
  4. 씻어 세포 배양 매체에서 Fluo4-AM 초과, 다음 세탁 시리즈를 완료 :
    • 접시에서 미디어 1 ML을 제거합니다.
    • 판에 새로운 세포 배양 매체 3 ML을 (15 ML 원뿔 튜브에서) 추가합니다.
    • 두 개의 세차 때마다 천천히 접시에서 솔루션의 3 ML을 제거하고 신선한 세포 배양 매체의 3 ML을 추가를 수행합니다.
  5. 전지는 현재 세포 배양 매체 4 ML에 있어야하고 Fluo4-AM을 포함해야합니다. Fluo4-AM은 효소 세포의 diffusing 아웃이나 막 바인딩 된 구획에 방지, 세포 내부에 한 번 흘리고있다. 문화를 오염 아이콘 입자를 방지하기에 커버를 유지하면서 이미지의 공 촛점 현미경의 무대에 접시를로드하기 전에 음식에 영구 마커와 수직 빨간색 선을 그립니다. 수직 라인은 페트리 접시 (페트리 접시가 아니라 뚜껑의베이스)의 측면을 그려집니다. 의 목적은 개별 셀의 정확한 방향과 정렬이 나중에 지점에서 다시 설정 될 수 있도록 시야와 관련하여 문화 판의 방향을 나타냅니다.
  6. 판은 이제 이미지에 대한 공 촛점 현미경의 무대에로드 할 준비가되었습니다. 공 촛점 현미경 (목적 20X)를 스캔 레이저에 밝은 필드 설​​정을 사용하여 셀을 표시합니다. 나중에 쉽게보기의 동일한 필드를 찾는 할 수있는 Cellatice의 coverslip에있는 큰 격자 번호가 포함 된보기의 필드로 바람직하게는, clumps을 포함하지 않습니다 조밀 한 셀의 영역을 발견하면시에서 후 영상 문화를부엉의 하이브리드. 영상에 앞서, 문화를 통해 다운 집중하고 세포 배양의 위치와 방향을 기록 할 수있는 세포 아래의 격자의 시야 이미지를. 이 이후의 분석을위한 세포의 재배치 할 수 있습니다.
  7. 초점 평면을 높이고, 시작 칼슘 이미징 (그림 3A) 이전 셀의 시야 이미지를 캡처합니다.
  8. 세포의 중심 비행기 초점이되면 판은 칼슘의 활동 영상을위한 준비가되었습니다. 설정 현미경과 응용 프로그램에 따라 달라집니다. 우리는 이미지가 다음 매개 변수 1, 2, 또는 12 시간을위한 아르곤 488 nm의 레이저를 사용하여 세포를 :
    • 1 시간 이미지 :
      • 아르곤 488 나노 미터 레이저는 최대 30 MW 전력의 4 %를 검색합니다.
      • 매 4 초 (시간 당 900 검사)는 한 번 스캔합니다.
    • 2 시간 이미지 :
      • 아르곤 488 나노 미터 레이저는 최대 30 MW 전력의 4 %를 검색합니다.
      • 매번 스캔8 초 (시간 당 450 스캔).
    • 12 시간 이미지 :
      • 아르곤 488 나노 미터 레이저는 최대 30 MW 전력의 2 %에 검색합니다.
      • 모든 48 초 (시간 당 75 스캔)은 한 번 검색합니다.

이 매개 변수는 각 시간 프레임에 대한 900 여전히 프레임 이미지의 집합을 야기 할 것이다. 칼슘 활동은 그런 다음 ImageJ 50 이미지 처리 응용 프로그램의 사용과 시간 코스 이미지 (그림 3B)를 통해 형광 수준을 분석하여 기록 할 수 있습니다.

4. 셀을 고정

  1. 이미징 후, 세포는 접시에서 솔루션의 3 ML를 제거하고 문화 미디어의 남은 1 ML에 1 ML 배 MEMFA을 추가하여 30 분에 고정 할 수 있습니다.
  2. 고정 후, MEMFA을 제거하고 5 분 세차 각 1 ML의 볼륨 일련의 세포를 탈수 :
    • 1X 인산염 버퍼 생리 (PBS)에 25 % 에탄올.
    • 1X PBS의 50 % 에탄올.
      • <sdd H 2 O (무균 deionized 증류수)의 리> 75 % 에탄올.
    • -20 ° C. 1 ML 100 % 에탄올과 매장 판으로 마지막 빨래를 교체

참고 : 메탄올도 이러한 세차와 스토리지 사용하실 수 있습니다.

5. 현장 하이브리드 화에 형광등 (물고기)

앤더슨 연구소 52에서 설명한 것처럼 세포 배양에 대한 수정 51 설명 문화는 Xenopus의 표준 물고기 프로토콜을 사용하여 assayed 할 수 있습니다. 앤더슨 연구소 프로토콜에 대한 수정은 아래에 나열되어 있습니다. 별도로 명시하지 않는 한 모든 세차는 약 1 ML의 권 35 밀리미터 Nunclon 판에 실시하고 있습니다. 솔루션 (으)로 Sive 외에 정의되어 있습니다. 53 달리 명시되지 않는 한.

중요 참고 : 용 이미징 셀에 원위치 하이브리드 화에 수행 할 때 fluorescein-라벨 RNA 프로브를 사용하지 마십시오칼슘 활동. 안티 fluorescein 항체는 잔류 셀에 Fluo4-AM과 문화의 모든 셀에 긍정적 인 신호를 발생할 수 있습니다에 바인딩됩니다.

1 일 : Permeabilization 및 하이브리드

  1. Rehydration 세차는 저장에 사용되는 탈수 용매로 등급해야합니다. 우리의 실험 세차는 1X PBS에서 에탄올로 등급이되었습니다.
  2. rehydration 후, 실온에서 5 분마다 1X PBS에 세포 세 추가 번 씻는다.
  3. 팔콘 튜브에 아세트산 무수물의 62.5 μl와 0.1 M triethanolamine (산도 8.0)의 25 ML을 섞어서 철저 앤더슨 연구소 52 프로토콜에 같은 논의 분산 될 때까지 빠르게 섞는다. 실온에서 10 분에이 혼합물 문화를 품다. 아세트산 무수물 치료 후, 실온에서 5 분을 위해 1X 생리 나트륨 구연산 (SSC)에서 세포를 씻어.
  4. 마지막 SSC 세척을 제거하고 세포를 permeabilize하기 위해 10 분에 0.2 M HCL (sdd H 2 O)을로 교체. </ 리>
  5. 5 분에 1X PBS에 두 세차와 HCL을 씻으십시오.
  6. 60 ° 6 시간의 최소 흔들어 물 욕조에서 C에서 다우 버퍼에 Prehybridize하지만이 심각하게 신호를 해짐에 따라 하루 아침에 prehybridize하지 않습니다.
  7. 희석 프로브의 750 μl (정화 프로브로부터 1:250 희석)에 8-14 시간에 대한 ° C 60 박 잡종을 만들다. 1.0-1.5에서 프로브 농도 범위를 정화 μg / μl.

일 2 : 언 바운드 프로브 및 항체 배양의 제거

  1. 프로브를 제거하고 60 0.2X SSC에 5 분을 위해 문화를 세정 ° C. 60 ° C.에 1 시간에 신선한 0.2X SSC에 씻어
  2. 물 목욕에서 문화를 제거하고 5 분 동안 실온에 적응 할 수 있습니다.
  3. 5 분 동안 실온에서 0.2X SSC에 씻어.
  4. 0.1 % 트리톤 - X-100 (PBT)와 1X PBS에서 15 분 동안 씻는다.
  5. 내생 peroxidases을 비활성화하려면, PBT의 2 % H 2 O 2 용액에서 1 시간에 씻는다.
  6. 상온에서 1 시간을위한 Maleic 산 버퍼 (적인 mAb)의 2% 차단 시약에 차단합니다. 우리는이 차단 방법은 PBT 20 % 양 혈청에서 차단의 이전 방법에 비해 감도를 증가하는 것으로 확인되었습니다.
  7. 4 ° C.에서 하룻밤 POD-복합 항체의 1:1,000 희석을 포함적인 mAb의 2퍼센트 차단 시약의 1 ML에 문화를 품다

3 일 : 언 바운드 항체의 제거 및 형광 개발

  1. 항체 솔루션을 제거하고 실온에서 5 분에 TBST 3 번 씻어.
  2. 지속적으로 속도가 느린 속도로 흔들면서 실온에서 15 분에 TBST에 4 번 씻으십시오.
  3. 10 분 동안 실온에서 PBT에 두 번 씻으십시오.
  4. PBT에 희석 1:200 fluorescein-tyramide 또는 1시 25분 Cy3 tyramide의 750 μl을 적용합니다. 상온에서 5 분 동안 배양 및 2.5 μl 0.3 % H 2를 추가 2. 신호가 개발 할 수 있도록 40 분에 즐겨요.
  5. 락과 상온에서 TBST에서 15 분마다 최소 4 번 씻으십시오.
  6. 신호가 완전히 개발되면, 1X PBT에서 5 분 동안 씻어.
  7. 4 ° C.에서 1 상온에서 시간과 1X PBS의 저장소에 1X MEMFA에 수정

6. 이미지 생선 결과 및과 공동 등록 칼슘 이미징 데이터

  1. 생선이 완료되면, 세포 배양 플레이트는 어떤 세포가 특정 프로브에 대한 긍정적 인 형광 신호를 표시 결정하는 이미징 있습니다. 칼슘 이미징 동안 공부 뷰의 정확한 필드를 찾아 칼슘 이미지 프레임의 방향에 판을 정렬 Cellattice의 coverslip을 사용합니다.
  2. 세포의 중심 비행기에 집중하고 최대 1 MW 전력 (그림 3C)의 15 %에 헬륨 - 네온 HeNe 543 nm의 레이저를 사용하여 하나의 고해상도 이미지를보세요.
  3. 칼슘 이미징 프로토콜에서 가져온 이미지를 설정 원본 900 프레임에서,이미지 처리 프로그램 (예 : ImageJ 50)의 사용을 통해 관심 지역으로 개별 셀 (ROIs)를 식별합니다. 시간 형광 쌍의 값 (그림 4)를 나타내는 데이터 요소의 집합으로 투자 수익 (ROI) 형광 데이터를 추출합니다.
  4. 칼슘 이미지 (그림 3D)에서 확인 ROIs과 물고기 결과 이미지를 입혀 라.
  5. 프로브에 대한 부정적 프로브에 대한 긍정적, 또는 알 수없는 각 투자 수익 (ROI)을 등록 - 투자 수익 (ROI)에 해당하는 셀이 더 이상 물고기 이미지의 시야에서 찾을 수 수있는 경우 인치
  6. 다른 해부하는 단계 (그림 5A 및 5C) 또는 다른 생선 프로브 (그림 5B와 5D)에 대한 긍정적 인 세포들 사이에서 칼슘의 활동 수준을 비교하는 통계 분석 스크립트를합니다 (MATLAB 또는 다른 프로그래밍 언어로 설계)를 사용하여 프로세스 ROI 형광 데이터입니다. 우리가 실험실에서 사용 된 모든 스크립트는 요청시 자유롭게 사용할 수 있습니다.

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Representative Results

성공적으로 해부하는 광 소포 (단계 25)와 retinae (무대 35)의 예는 2E와 2J 그림에 표시됩니다. 이 프로토콜이 개발의 여러 단계에서 사용할 수 있지만, 더 실험에 대한 정확성을 보장하기 위해 만 망막 조직을 얻는 것이 중요합니다. 조심스럽게 모든 단계에서 표피를 제거하고 포셉의 망막 조직을 주사하지 않도록. 단계 35 세 이상에서, 렌즈는 망막 위에 맑은 층으로 간주 할 수 있으며, 포셉을 사용하여주의 해주세요하여 제거 할 수 있습니다.

성공적으로 도금 기본 세포 배양은도 3a에 표시됩니다. 조직을 dissociating 때, 세정 솔루션에 dissociating에서 조직을 방지하기 위해 권장되는 30 초 배양 시간보다 더 오래 씻어 솔루션에 망막 explant을 떠나지 않는 것이 중요합니다. 또한, 조직 전체 시간 동안 트립신 용액에 해리 할 수​​ 있는지 확인문화 판에서 세포의도 배포 할 수 있도록 (이전 배아와 애벌레의 단계는 더 이상해야 할 수 있습니다.) 세포 도금이되면 접시를 이동하고 접시에서 세포를 세척 방지하기 위해 솔루션을 변경할 때,주의.

그림 3B 및 3C는 각각, 칼슘 활동 검사 및 현장 하이브리드 실험 (물고기)의 형광의 이미지를 보여줍니다. 칼슘 이미지에 밝은 녹색으로 표시 셀은 내부 칼슘 상점의 출시의 결과로 세포 내 칼슘 수준에서 과도 스파이크를 겪고 아르 셀 수 있습니다. 세포는 물고기를 사용하여 유전자 발현에 대한 assayed 할 수 있으며, 유전자 발현 패턴은 이미지 (그림 3D)를 오버레이하여 칼슘 솟고 활동의 패턴에 상관 할 수 있습니다. 파이썬과 MATLAB 스크립트 (요청시 무료로 이용 가능)의 조합을 사용하여, 데이터가 각 individu의 형광 활동을 분석하여 얻을 수 있습니다영상의 과정을 통해 관심 야외 지역 (ROI). 영상의 1 시간 이상의 개별 셀 (ROI)에 대한 칼슘 활동의 예는 그림 4에 표시되어, 스파이크는 이미지의 약 57 분에 볼 수 있습니다. 표 1에서, 다양한 프로브에 대한 긍정적 인 세포의 비율에 대한 대표적인 데이터가 표시됩니다, 문학에보고 된이 실험 (현재 실험의 요점이 비율을 결정하는 것입니다)에 특정 데이터가없는 반면, 우리의 연구 결과는 일치 척추 17,55,56에서 칼슘의 활동에 관한 실험을 유사한 유형의 데이터입니다.

분석을 위해 활용 매개 변수 수, 주파수, 그리고 스파이크의 진폭이 포함되어 있습니다. 그림 5는 xVglut1, Ptf1a 및 xGAD67에 프로브를 사용하여 배아 망막 세포에 칼슘 이미징와 생선 실험의 대표적인 결과를 제공합니다. MATLAB 스크립트, EAC에 대한 스파이크의 개수를 사용하여H 투자 수익 (ROI)이 결정되어 스파이크의 수는 실험의 모든 ROIs에 대한 평균입니다. 각 실험에서 스파이크의 평균 개수 후 실험 그룹에 대한 평균의 결과로, 다른 실험을 컴파일 할 수 있습니다. 누적 분포 줄거리는 그룹 내의 모든 실험에 대한 스파이크의 평균 개수의 분포를 표시 할 수 만들 수 있습니다. MATLAB 스크립트는 다음 데이터의 통계 분석을 위해 사용됩니다.

그림 5는 MATLAB 분석에 따라 대표 데이터를 보여줍니다. 간단히, 우리의 결과는 난리 단계 35 피킹과 칼슘 활동이 발달 규제 것을 보여 (P <0.002) (그림 5A 및 5C). 더 통계적으로 의미있는 차이가 없었 반면, 특정 프로브에 대한 긍정적 인 세포로 칼슘의 활동을 상호 연관의 측면에서, 그러나 highe을 표시 할 xGAD67 (차별화 된 GABAergic 세포의 마커)에 대한 긍정적 인 세포의 추세 (P = 0.08)가 발생했습니다 glutamatergic 마커 또는 Ptf1a, GABAeric 표현형을 촉진과 상관 전사 인자의 유전자를 인코딩 유전자에 양성 반응 세포보다 칼슘이 솟고 활동의 연구 수준. 예비 있지만, 이러한 데이터는 Ptf1a 수준에서 행동하지 않습니다 Ptf1a의 독립적 인 방식 또는 활동에 의존 신경 전달 물질 사양에 개발 GABAergic 세포가있을 수 있습니다하는 것이 좋습니다.

그림 1
1 그림. 절차 개략도. 일단 망막 조직은 해부되어 dissociated, 기본 세포 배양이 응용 프로그램의 다양한 사용할 수 있습니다.

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그림 2. 분해 사진. 태아도 증가 대비 나일 블루 황산에 얼룩 져 있었다. AE : 스테이지 24. FJ : 스테이지 35. 약어 :. 오븐, 광 소포, FB, forebrain, SC, 척추, 나, 중배엽, 그래서 somites, 르, 렌즈, CG, 시멘트 선, 재, 망막, EP, 상피는 큰 그림을 보시려면 여기를 클릭하세요 .

그림 3
그림 3. ROIs과 세포 배양의 이미지. A.에게 원 시야. ROIs과 Fluo-4 (AM) 치료에 따라 B. 이미지 원. C. 물고기 이미지 (화살표가 전압 개폐 칼슘 채널 CaV2.1의 알파 subunit에 대한 긍정적 인 세포의 예를 나타냅니다). D. 밝은 필드의 중첩, Fluo-4, 및 생선 이미지.

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4 그림. 하나의 셀 (ROI)에 대한 칼슘의 활동의 예. Fluo4 칼슘 형광 이미지에서 형광 (상대 형광 단위로 rfu) 대 시간 (분)의 플롯.

그림 5
그림 5. 결과는 무대와 프로브에 의해 칼슘 난리가 표시됩니다. A. 단계 30에서 칼슘 스파이크의 평균 개수 (N = 4), 35 (n은 = 8), 38 (N = 13). 단계 35 xVglut1 (n은 = 3)에 원위치 하이브리드 화에 사용 다른 프로브 간의 문화 당 칼슘 스파이크의 B. 평균 번호, xGAD67 (N = 3) 및 Ptf1a (N = 4). 단계 30, 35, 38 문화 당 스파이크의 평균 개수의 C. 누적 분포 줄거리. D. 누적 distributi. 긍정적 인 단계 35 원위치 하이브리드 화 프로브에 대한 신호를 갖는 것으로 확인 된 세포에 대한 문화 당 스파이크의 평균 개수의 플롯에, xVglut1, xGAD67 및 Ptf1a을 더 큰 그림을 보시려면 여기를 클릭하세요 .

탐침 무대 N (접시) N (세포) 긍정적 비율
xGAD67 35 4 1042 2퍼센트
38 4 690 2퍼센트
Ptf1a 30 3 352 1퍼센트
35 6 1856 1퍼센트
xVglut1 30 1 47 57%
35 3 692 2퍼센트
38 3 364 4퍼센트

표 1. 비율 긍정적 인 세포.

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Discussion

모든 vertebrates에서 보존 아르는 잘 특징 세포 유형으로, 망막은 셀 타입 사양과 차별화에 관한 분자 - 세포 프로세스를 공부에 유용한 모델을 제공합니다. 기본 세포 배양은 유전자 발현, 단백질 역학, 그리고 칼슘 및 단일 셀 해상도 수준의 전기 활동을 포함한 과정의 광범위한 조사를위한 강력한 방법을 갖게. 여기에 우리가 추정 망막 개발하고 기본 세포 배양의 매우 초기 단계에서 쉽게 액세스 할 수 있는지 Xenopus laevis, 주어진 이러한 연구 특히 의무가 유기체의 해부 추정 망막 조직의 기본 세포 배양을위한 간단한 기술을 제시가에 발생할 수 있습니다 간단한 생리 식염수로 구성된 정의 미디어.

대부분의 실험실 설정에 쉽게 적응하지만, 특히 세심한주의가 필요합니다 몇 가지 단계가 있습니다. Dissecti기능은 신선한 날카롭게 포셉을 수행해야합니다. 세포 배양 매체와 혼합 Collagenase B 치료의 젊은 단계 (<ST. 30) 혜택을 누리 실 수 있습니다. 다른 조직 또는 미디어에서 세포의 이전을 포함하는 모든 단계는 공기 솔루션 인터페이스의 가까이에 오는 조직이나 세포를 방지하기 위해 특별한주의하여 수행해야합니다. 조직을 포함 피펫은 완벽하게 유체의 충분한 물 속에 잠긴과 세포 또는 조직은 매우 느리게 퇴학해야합니다. 셀이 도금 된 후, Fluo4-AM 추가하고, 세포 배양 매체, 또는 고정 세차를 포함한 모든 유체 전송이 조심스럽게 세포가 쉽게 dislodged 될 수 있다는 주어진 수행해야합니다. 모든 세포 배양과 마찬가지로, 불임이 우려되므로주의가 모든 자료를 검사 해주의해야한다. 마지막으로, dissociated 망막 explants의 분리 매체에서 지정된 기간에 앉아 주셔서 성공적인 셀 첨부 파일에 중요하고 거리며 걷게 방지 할 수 있습니다.

시이 프로토콜에 설명 된 절개와 문화 상태는, 괴사와 apoptosis 모두 (이하 전지의 5-10% 이상) 매우 한계가 있습니다. 접시에 세포의 손실은 (apoptosis) 거의 전후 공 촛점 이미징 세션 동안 발견되지 않습니다. 주의 깊게 셀 문화를 처리하면 세포 생존에 중요한 역할을합니다. 솔루션 변경 사항은 세포 괴사와 apoptosis를 배제하는 것은 매우 천천히, 그리고 꾸준히 수행해야합니다. 망막 세포 유형의 정확한 비율을 윤곽을 그리다 수있는 실험이 현재 진행하는 동안, 우리는 망막 세포 유형의 다양한이 문화와 그 기계 glial 세포 (뚜렷한 형태가있는)에 표시 할 표시하는 메모가 문화에 지배적하지 않은 .

현장 하이브리드 실험의 후 접시를 분석 잠재적 인 관심사는 세포의 일부가 이동 한 수 있지만이 방법은 셀 추적 프로그램의 사용으로 해결 될 수 있습니다. 또한, 기본 세포 배양의 기술에 내재, 주요 제한은 일입니다손상 조직의 존재 공간 패턴의 전자 명백한 손실. 개별 셀의 주소가 조직에 위치하여 분자 assays를 사용하는 것보다 설정해야합니다. 그러나,이 기능은 세포 매우 정확하게하고 계속 세포 세포 상호 작용의 부재에서의 사양의 상태를 분석 할 수있는 기회를 제공합니다. 또한 탐정이 선택적으로 성장 요인 또는 다른 화합물과 세포 치료를 할 수 있으며 정확하게 이웃 세포의 신호의 영향없이 효과를 분석 할 수 있습니다. 우리가이 망막 절개 및 특정 신경 전달 물질의 표현형 마커와 칼슘 이미징을 상호 연관에 대한 일차적 세포 배양 기술을 고용하고 있지만,이 기술은 RT-PCR을 사용하여 electrophysiological 레코딩 및 단일 세포 유전자 발현의 assays 포함하여 다른 다운 스트림 응용 프로그램의 다양한에 적용 또는 "옆에 있습니다 - 일반 "transcriptome 분석 (그림 1).

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Disclosures

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

Acknowledgments

우리는 기꺼이 스크립트에 박사 존 헤이즈 감사, Drs. 에릭 브레 디하고 공 촛점 현미경과 지원 크리스토퍼 델 흑인, 드류 휴즈, 프로젝트를 개발하고 예비 데이터를 제공에서 그의 작품을위한 로라 Odorizzi, 알렉스 Garafalo, 레베카 Lowden, 그리고 리즈 MacMurray, 통계 분석에 대한 유용한 제안 박사 그렉 스미스. 이 작품은 MSS에 대한 NIH 보조금 (NINDS IR15N5067566-01)와 윌리엄과 메리의 대학에 하워드 휴즈 의학 연구소 과학 교육 교부금에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
For Dissections and Culturing
BD Falcon Easy Grip Tissue Culture Dishes, 35 mm Fisher 08-772A
Disposable Polystyrene Petri Dishes, 60 x 15 mm Fisher 0875713A
35 mm Nunclon Surface Petri Dishes (with Airvent) Fisher 12-565-91
Dumont Fine Forceps (Dumostar #55) Fisher NC9341917
Cellattice Micro-ruled plastic coverslip, 25 mm Fisher 50-313-17
Ethyl-m-Aminobenzoate Methanesulfonate Salt (MS-222) MP Biomedicals, LLC 103106
Gentamicin Sulfate Enzo Life Sciences 380-003-G025
Gibco Trypsin (1:250) Powder Life Technologies 27250-018
Collagenase B from Clostridium histolyticum Roche 11088831001
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
Nile Blue Sulfate (optional) Pfaltz Bauer N05550
500 ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 μm Pore 33.2 cm2 CN Membrane Corning 430758
For Calcium Imaging
Fluo-4 AM 1 mM Solution in DMSO, Cell Permanent Life Technologies F-14217
Pluronic F-127 10% Solution in Water Life Technologies P-6866
LSM 510 Confocal Microscope System Zeiss Model Discontinued
Blocking Reagent Roche 11096176001
For Fluorescent in situ hybridization (FISH)
Anti-Digoxigenin-POD, Fab Fragments Roche 11207733910
Anti-DNP-HRP Antibody Perkin-Elmer NEL747A
Cy3 NHS ester GE Healthcare PA13101
NHS-Fluorescein Thermo Scientific 46409
Formamide, Deionized Amresco 0606-950ML
Torula RNA, Type IX Sigma-Aldrich R3629
Heparin Sodium Salt, from Porcine Intestinal Mucosa Sigma-Aldrich H3393-250KU
CHAPS Sigma-Aldrich C3023

Table 2. Specific reagents and equipment.
Solution Reference Contents
Cell Culture Medium Chang and Spitzer , 200954 116 mM NaCl
0.67 mM KCl
2 mM CaCl2
1.31 mM MgSO4
4.6 mM Tris
1 % (v:v) Penicillin/Streptomycin
Adjust pH to 7.8 with HCl.
Filter sterilize by passing through a 0.22 μm CN filter.
Store at 4 °C.
Calcium-Magnesium Free Medium (CMF) Gu et al., 199442; Gu and Spitzer, 199555 116 mM NaCl
0.67 mM KCl
4.6 mM Tris
0.4 mM EDTA
1 % (v:v) Penicillin/Streptomycin
Adjust pH to 7.8 with HCl.
Filter sterilize by passing through a 0.22 μm CN filter.
Store at 4 °C.
Maleic Acid Buffer (MAB) Sive et al., 200053 100 mM maleic acid
150 mM NaCl (pH 7.5).
Marc's Modified Ringers (MMR), 10X Sive et al., 200053 100 mM NaCl
mM KCl
1 mM MgSO4
2 mM CaCl2
5 mM HEPES
pH adjusted to 7.4 with NaOH
0.1X MMR also contains 50 mg/ml gentamicin sulfate and pH is adjusted to 7.4 with NaOH.
MEMFA Solution, 10X Sive et al., 200053 0.1 M MOPS (Ph 7.4)
2 mM EGTA
1 mM MgSO4
3.7% formaldehyde
A 10X solution, without formaldehyde, can be stored at 4 °C. Formaldehyde is added fresh (1/10 volume of a standard 37% stock).
In situ Hybridization Buffer Sive et al., 200053 50% Formamide
5X SSC
1 mg/ml Torula RNA
100 mg/ml Heparin
1X Denhart's Solution
0.1% Tween 20
0.1% CHAPS
10 mM EDTA.

Solutions. *Gentamicin, an antibiotic, is used in our MMR solutions while penicillin and streptomycin are used in our culture media.

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References

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McDonough, M. J., Allen, C. E., Ng-Sui-Hing, N. K. L. A., Rabe, B. A., Lewis, B. B., Saha, M. S. Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue. J. Vis. Exp. (70), e4377, doi:10.3791/4377 (2012).

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