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Neuroscience

解剖，文化与分析 Published: December 23, 2012 doi: 10.3791/4377
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biology, College of William and Mary
* These authors contributed equally

Summary

非洲爪蟾提供了一个理想的模型系统，为研究细胞命运和生理功能的个人视网膜细胞的原代细胞培养。在这里，我们提出了一种技术，用于解剖视网膜组织并产生成像的原代细胞培养活性钙和原位杂交分析。

Abstract

前区的神经板产生的脊椎动物视网膜的过程仍然是一个重大的临床和基础研究的重点。除了 ​​明显的理解和治疗视网膜疾病的医疗相关的脊椎动物视网膜的发展作为一项重要而优雅的模型系统的理解决定和分化的神经元细胞类型1-16。的视网膜神经由6个独立单元（神经节细胞，无长突细胞，水平，感光细胞，双极细胞和Müller胶质细胞），其布置在定型层，一个模式，主要是保守的所有脊椎动物12,14-18。

在学习的完整胚胎发育的视网膜中明确要求的理解这个复杂的器官如何发展一个突出的前脑的层状结构，有很多问题，有利于从米采用采用推定视网膜细胞的原代细胞培养7,19-23。例如，分析细胞组织去除和分离在不同的阶段可以辨别的状态规格的单个细胞在不同的发展阶段，也就是细胞的命运的情况下与周围组织的相互作用8,19-22 ,24-33。原代细胞培养也允许调查员来处理与特定的试剂和文化上单个细胞水平5,8,21,24,27-30,33-39的，分析的结果。一个经典的模型系统，研究非洲爪蟾，早期神经发展19,27,29,31-32,40-42的 ，作为一个特别合适的视网膜原代细胞培养系统10,38,43-45。

推定视网膜组织从最初的发展阶段，紧随神经诱导25,38,43。此外，由于日胚胎在每个单元格中包含的供给蛋黄，视网膜细胞的培养可以在一个非常简单的定义的介质组成的一个缓冲的盐溶液中，从而消除了混杂影响的潜伏期或其他血清型产品10,24,44-45 。

然而，从周围组织和随后的处理的视网膜组织的隔离是具有挑战性的。在这里，我们提出了一种方法，在非洲爪蟾（Xenopus laevis）的视网膜细胞，将被用于制备原代细胞培养，反过来，在单一细胞的分辨率的的钙活性和基因表达进行分析的解剖和解离。虽然本文介绍的主题是自发性钙瞬变分析，该技术广泛适用于广泛的研究问题和方法（ 图1）。

Protocol

所有的实验都完成后的实验动物护理和使用委员会在威廉和玛丽学院批准的协议。在本协议中引用的发展阶段根据Nieuwkoop和Faber 46的 。

1。解剖

  1. 允许的细胞培养液中的钙，镁免费中等（CMF），以平衡至室温。您还需要0.1X马克的改良林格（MMR）的pH值7.4-7.6。
  2. 消毒通过施加在细胞培养层流罩30分钟的UV光对以下项目。 （喷每个资料前放置在通风橱中，用70％的乙醇）。
    • 35 mm塑料培养皿中。
    • 60 mm塑料培养皿中。
    • 35毫米Nunclon表面菜肴。
    • 1.5 ml微量离心管。
    • P1000微量移液器（1000微升微量移液器）。
    • 气溶胶抗P1000秘诀（1000微升微量移液器的气溶胶耐提示）。
    • 酒精耐笔。
    • 精细解剖钳。
    • * 15毫升锥形管（仅用于成像活性钙）。
    • *仅适用于活性钙​​成像。
  3. 一旦引擎盖已紫外线灭菌，解决方案具有平衡到室温，打开在通风橱中的空气层流，在通风橱中，用70％乙醇和地点媒体瓶喷洒下来手套和媒体瓶。
  4. 油烟机内准备好以下P1000微量移液器与每块板的细胞 ，以确保适当的标签。
    • 一个60毫米的塑料培养皿中含有10毫升的细胞培养基- ​​夹层板 。
    • 一台35毫米Nunclon面菜含有2毫升细胞培养基- ​​培养板 。 （Nunclon塑料盘子不进一步处理任何粘接剂）。
    • 一个空的1.5 ml离心管外植体解离管 。
    • *一个15毫升锥形猎鹰管内含有15 ml细胞培养液中。对于冲洗掉多余的Fluo4-AM成像时，活性钙。
  5. 油烟机内，需准备以下与P1000微量移液器每个解剖届 （一个以上的视网膜可以在一个会话中剥离）。
    • 一个35毫米塑料培养皿中含有2毫升CMF - 植冲洗板 。
    • 一个35毫米的塑料培养皿中含2毫升CMF - 外植体解离板 。
  6. 外罩准备以下内容：
    • 一个60毫米塑料培养皿中的细胞中含有10 ml的0.1倍MMR每板- 固定板 。
    • 一个60毫米塑料培养皿中的细胞中含有10毫升0.1X MMR每板- 兄弟姐妹板 。
    • 一个60毫米的塑料培养皿中含10毫升0.1X MMR + 0.5毫克/毫升MS-222（三卡因） - 麻醉板每清扫会话。
    7. 植体解离板 （0.1％的胰蛋白酶溶液），摇匀，并预留。
  7. 如果解剖是年龄小于30期的胚胎，添加10毫克胶原酶B到夹层板 （在1 mg / mL胶原酶溶液B），漩涡溶解，并预留。
  8. 选择所需阶段的胚胎，用非无菌移液管转移到控股板 ，并删除（如果尚未孵化胚胎卵黄膜）用细钳子。
  9. 传输数个相同的上演胚胎到同级板与非无菌移液管。
  10. 如果胚胎是25或更早的阶段，继续进行直接与夹层，否则的胚胎转移到的异丙酚板与非无菌移液管和允许胚胎坐下，直到停止运动，对刺激的反应。这可能需要长达一分钟。
  11. 在解剖范围（目标4X，10X目镜）进行解剖（ 图2）。

胚胎阶段，25岁或以下

  1. 与非无菌移液管转移胚胎解剖板 。
  2. 使用细钳子2双，作出正中矢状切腹侧的胚胎，在胚胎的前部的后端上开始，并继续通过水泥腺。
  3. 小心地抓住任何一个边缘的剪裁和传播左，右打开的胚胎。这将导致在胚胎面临的夹层板的背侧，腹侧外胚层揭示的内胚层，中胚层和内流传开。
  4. 开始除去内胚层，中胚层（ 图2A和2B）。这个组织最早，规模最大的层是在外观上与“蓬松”大细胞和小明显的组织。
  5. 除去这层后，体节，脊索将变得可见。对于更好的对比度，将一个单独的60毫米的塑料培养皿中含有10毫升细胞培养基和100μl耐尔蓝硫酸盐1％溶液（在水中）的回传的夹层板之前的2-3分钟的胚胎。这会弄脏外胚层，体节，脊索，以便于识别和定位。
  6. 着眼于前部的胚胎脊索，小心地取出任何剩余的中胚层，暴露的大脑和视神经囊泡（ 图2C）。
  7. 一旦大脑和视神经囊泡完全暴露出来，用钳子切断后方的大脑的神经管及相关外胚层。
  8. 打开这部分（大脑和视神经囊泡）使外胚层之上，。
  9. 小心不要损坏底层的光纤泡，仔细地重新移动的外胚层（ 图2D）。
  10. 最后，使用镊子，视神经囊泡分开从大脑（ 图2D和2E）。

台25岁以上的胚胎：

  1. 虽然胚胎是在麻醉板 ，用钳子取出的胚胎的腹侧部分。
  2. 为了更好地对比，将胚胎到60毫米的塑料培养皿中含有10毫升的0.1倍MMR和100微升1％的硫酸耐尔蓝2-3分钟，然后转移到夹层板 。这会污染外胚层蓝色。
  3. 一旦在夹层板 ，拉回来的外胚层覆盖的视网膜（或视泡在胚胎阶段26-30）（ 图2F和2G）。耐尔蓝硫酸盐，外胚层将被染成蓝色，但相关的视网膜组织不会。
  4. 小心取出视网膜或视泡，以forceps（ 图2H，2I，2J）。是有帮助的按住胚胎到位用1双镊子，和删除与其它视网膜或视神经囊泡。

2。解离组织和细胞的电镀

重要提示 -当转移组织，不使视网膜或视神经泡触及任何气-液边界，如果发生这种情况的细胞裂解。

  1. 视泡或视网膜解剖后，小心转移到外植体 ，， 冲洗板与P100微量移液器使用气雾剂抗提示，并允许坐，持续30秒。
  2. 将80微升0.1％胰蛋白酶CMF从外植体的解离板的外植体解离地铁 。
  3. P100微量移液器和气溶胶性提示使用，转让视网膜或视泡从外植体冲洗板外植体Dissociati转让的外植体管，避免冲洗的解决方案。
  4. 允许的组织的外植体的解离管中离解，在室温下的1小时。一个视网膜每块板使用，但是，我们注意到，如果需要的话，以增加在每块板的细胞数量，可以使用一个以上的每板。
  5. 板的细胞，先慢慢取出的外植体解离地铁 40微升的解决方案，并放弃使用P100微量移液器和气溶胶性提示。使用P100集40μl和气溶胶耐提示，将细胞组织分离培养板 。当吸取细胞到板，移液缓慢，并保持在板的中心，在一个小区域的细胞。

注意：如果整个实验过程中是将要采取的多个细胞的图像，附加一格（Cellattice）的培养板的底面

  1. 允许细胞以静置至少1小时，坚持Nunclon板。在此之后，他们必须非常轻柔的对待，他们可能会成为分离。
  2. 培养细胞，通过观察同级胚胎，饲养细胞在相同温度下作为所需阶段。如果活细胞不被用于进一步的操作，就可以在这个时候固定在MEMFA溶液。

重要注意事项：我们的实验是固定的6小时内电镀的细胞。在培养的细胞是长寿取决于在哪个阶段的组织解剖和蛋黄仍然存在于细胞的量;从年轻（神经胚阶段）细胞解剖保持5-6天，而细胞获得健康的文化老胚胎（游泳的蝌蚪阶段）保持有效的培养2-3天。

3。钙成像47-49

该协议利用钙敏感Fluo4-AM和共聚焦显微镜定量分析单个细胞的钙瞬变。应执行的所有步骤使用Fluo4-AM避光，作为Fluo4-AM是光敏感。所有洗涤应添加或删除一个P1000微量移液器及防提示。移液应做得缓慢和朝向边缘的板，以避免干扰细胞的。媒体的文化没有改变，因为一般是固定的6小时内被解剖。长期的文化，媒体应每天更换。

  1. fluo4-AM被储存在-20℃下，我们建议存储于5μl等分试样。在使用之前，解冻5微升等分Fluo4-AM避光，并加入2μl的Pluronic F-127直接到这等份。
  2. 培养后的细胞为所需量的时间（至少了1小时）中，取出1毫升的细胞从培养板的培养基中。这Fluo4-AM和Pluronic，混合温柔移液。
  3. 慢慢所有该溶液转移到要成像的细胞培养板的边缘，并留下的细胞，在该溶液中，静置1小时至吸收的Fluo4-AM。
  4. 要洗出多余的Fluo4-AM细胞培养液中，完成下列洗系列：
    • 删除板1毫升的媒体。
    • 加入3毫升新鲜的细胞培养介质中（从15毫升锥形管）的板。
    • 执行两个额外的洗涤液，每次慢慢从板中除去3毫升溶液，并加入3毫升新鲜的细胞培养介质。
  5. 将细胞现在应该在4毫升的细胞培养基和包含Fluo4-AM。 fluo4-AM酶解一旦进入细胞，以防止它从扩散出来的细胞或成任何膜结合舱室。 共焦显微镜的成像搬上舞台，在加载板，画一条垂直的红色线盘上的永久性标记，同时盖，以防止标记颗粒污染的文化。的垂直线向下绘制的陪替氏培养皿（的基础上的陪替氏培养皿，而不是盖）的一侧。其目的是为了指示的方向相对于视场的培养板的各个细胞的精确定位和对准，以便可以重新建立在稍后的点。
  6. 现在已经准备好装走上舞台的共聚焦显微镜成像板。可视化的细胞，用明视场设置在激光扫描共聚焦显微镜（物镜20X）。成像时，发现一处茂密的细胞不包含团块，最好有一个字段的视图，其中包含的大电网的数字上的Cellatice的盖玻片的观点更容易找到相同的领域后，在SI的文化TU杂交。在成像之前，通过培养和重心下移采取明亮视场图像的记录格下面的细胞的细胞培养物的位置和取向。这允许调整，用于随后的分析的细胞。
  7. 提高焦平面捕捉亮场图像的细胞开始的钙成像（ 图3A）。
  8. 一旦细胞的中心平面是在焦点，该板是准备钙活性的成像。设置会有所不同，这取决于显微镜和应用程序。我们的形象的使用氩488 nm激光的细胞为1，2，或12小时的使用下面的参数：
    • 1小时的图像 ：
      • 氩气488 nm激光扫描，其最大的30 mW的功率在4％左右。
      • 扫描一次，每4秒（900扫描每小时）。
    • 2小时图像：
      • 氩气488 nm激光扫描，其最大的30 mW的功率在4％左右。
      • 扫描一次，8秒（450扫描每小时）。
    • 12小时的图像：
      • 氩气488 nm激光扫描，其最大的30 mW的功率为2％。
      • 扫描一次，每48秒（75扫描每小时）。

这些参数将导致在每个时间帧的一组900的静止帧图像。钙活性然后，可以记录使用的图像处理应用程序，如ImageJ的50以上的时间过程的图像（ 图3B）与通过分析荧光水平。

4。修复细胞

  1. 成像，细胞可固定30分钟，通过从板中除去3毫升溶液和余下的1毫升培养基中加入1毫升的2X MEMFA到。
  2. 固定后，取出MEMFA和脱水5分钟清洗，每一个体积为1毫升的一系列细胞：
    • 1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的25％的乙醇。
    • 在1X PBS的50％乙醇。
      • <李SDD H 2 O（无菌去离子蒸馏水）> 75％的乙醇。
    • 在最后一次洗涤用1毫升100％乙醇中，于-20℃下的存储板更换

注：甲醇也可以用于这些清洗和用于存储。

5。 荧光原位杂交（FISH）

文化可以测定的爪蟾使用标准FISH协议的细胞培养的修改安德森实验室52 51。安德森实验室协议的修改在下面列出。所有洗涤液都在约1毫升体积的35毫米Nunclon板进行的，除非另有说明。解西伯等的定义53，除非另有说明。

重要注意事项：不要用荧光素标记的RNA探针进行原位杂交技术在细胞成像为活性钙。抗荧光素抗体结合残留的Fluo4-AM的细胞，并可能导致积极的信号，在所有细胞中的文化。

第1天：通透和杂交

  1. 补液洗涤，则应分级脱水溶剂用于存储。对于我们的实验中，洗涤液分级乙醇在1X PBS。
  2. 补液，用1X PBS洗涤细胞3次，每次5分钟，在室温下。
  3. 混合25毫升Falcon管中的乙酸酐与62.5微升的0.1M三乙醇胺（pH8.0）中，并迅速混合直到完全分散安德森实验室52协议中讨论。在该混合物中，在室温下的10分钟的孵育培养。乙酸酐处理后，洗涤细胞1X盐水柠檬酸钠（SSC）中，在室温下5分钟。
  4. 移除最后的SSC洗涤，用0.2M HCl（sdd的H 2 O）中替换为10分钟至透性细胞。/ P>
  5. 洗出盐酸有两个用1X PBS洗涤5分钟。
  6. Prehybridize在ISH缓冲区中最低6小时在振荡水浴中，在60℃下，但不prehybridize过夜，因为这会严重削弱信号。
  7. 为8-14小时，在750微升稀释的探针（1:250稀释从纯化的探头）在60℃下杂交过夜。将纯化的探针浓度范围从1.0-1.5微克/微升。

第2天：去除未结合的探针和抗体反应

  1. 取出探头和冲洗培养5分钟在0.2X SSC在60℃下在新鲜的0.2X SSC洗在60℃下1小时
  2. 删除的培养从水浴中，并允许他们调整至室温5分钟。
  3. 冲洗在0.2X SSC在室温下5分钟。
  4. 在1X PBS洗15分钟，用0.​​1％的Triton-X-100（PBT）。
  5. 要灭活内源性过氧化物酶，洗1小时，在2％的H 2 O 2的溶液中PBT。
  6. 座在马来酸缓冲器（MAB）在2％封闭试剂，在室温下的1小时。我们已经发现，这种阻塞的方法增加灵敏度在以前的方法相比，在20％羊血清在PBT的阻挡。
  7. 在4℃下孵育培养在1毫升2％封闭试剂含有1:1,000稀释的POD抗体，过夜，在人与生物圈

第3天：去除未结合的抗体和荧光发展

  1. 移除抗体溶液，并在TBST冲洗3次，在室温下5分钟。
  2. 在TBST中洗涤4次，在室温下的15分钟，同时连续地摆动以缓慢的速度。
  3. 在PBT中洗两次，在室温下10分钟。
  4. 应用1:200荧光素Cy3的酪胺或1:25的酪胺稀释在PBT的750微升。在室温下孵育5分钟，并添加2.5微升0.3％的H 2 2。岩石为40分钟，使信号发展。
  5. 至少4次洗净，每次15分钟在TBST中在室温下与摆动。
  6. 一旦信号已全面开发，在1X PBT洗为5分钟。
  7. 在4℃下1小时，在室温下，并存储在1X PBS修复在1X MEMFA为

6。图片FISH结果和有限公司注册与钙成像数据

  1. 的FISH完成后，细胞培养板进行成像，以确定哪些细胞显示出积极的荧光信号，对于一个给定的探针。使用Cellattice盖玻片准确地找到所需的视场在钙成像研究，并对齐的板的取向的钙的图像帧。
  2. 关注的中心面的细胞，并采取单一的高清晰度图像，使用氦氖氦氖543 nm激光的15％，其最大的1 mW的功率（ 图3C）。
  3. 在最初的900帧拍摄的图像钙成像协议，识别单个细胞的感兴趣区域（ROI的），通过使用图像处理程序（例如如ImageJ的50）。提取的ROI的荧光数据作为一组，表示对时间的荧光值（ 图4）的数据点。
  4. 叠加的FISH结果图像，从钙的图像（ 图3D）与所识别的感兴趣区。
  5. 注册每个ROI为阳性的探针，探针阴性，或未知的 - 在对应的单元格的ROI的情况下，可以不再被发现FISH图像的视图内的字段。
  6. 过程的投资回报率荧光数据，利用统计分析脚本（通过MATLAB或其他编程语言的设计），比较在不同的解剖阶段（ 图5A，5C）或不同的FISH探针（ 图5B和5D）阳性细胞的活性钙水平。在我们的实验室中使用的所有脚本是自由可应要求提供。

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Representative Results

成功解剖视神经的囊泡（阶段25）和视网膜（阶段35）的实施例示于图2E和2J。虽然这种协议可以用于在不同的开发阶段，这是至关重要的，从而只获得视网膜组织确保准确性的进一步的实验。小心地去除表皮的各个阶段，并确保您的镊子不要刺穿视网膜组织。 35岁或以上在第二阶段中，透镜可以看到作为一个透明层的顶部的视网膜和可以由谨慎刮削使用镊子除去。

成功地镀敷的原代细胞培养是在图3A中所示。解离组织时，重要的是不推荐的培养30秒的时间，以防止组织在漂洗溶液从游离于长于离开视网膜的外植体在漂洗溶液。此外，请确保组织中的胰蛋白酶溶液中分离了整整一个小时（年龄较大的胚​​胎和幼虫阶段，可能需要更长的时间），以使细胞培养板均匀分布的。一旦细胞是镀金的，移动时务请审慎行事板和变化的解决方案，以避免洗涤细胞板。

图3B和3C表明自钙活性扫描和荧光原位杂交实验（FISH）的图像，分别。细胞中的钙图像出现明亮的绿色正在经历一个瞬间秒杀细胞内钙离子水平的细胞内钙库释放的结果。细胞可以被用于基因表达用FISH测定，和基因表达模式可以是相关图案钙尖峰活性的叠加图像（ 图3D）。结合使用Python和MATLAB脚本（可应要求提供免费），数据是通过分析每个个体的荧光活性的人的感兴趣区域（ROI）的通过过程中的成像。钙活性的单个单元格（ROI），在1小时内的成像的一个示例的图4中所示;尖峰是在约57分钟的成像可见。在表1中，显示各种探针阳性细胞的百分比的有代表性的数据，而有特定的文献报道（我们目前的实验中的点是，以确定这些百分比）本实验没有数据，我们的研究结果是一致类似的实验，在脊髓17,55,56活性钙的数据。

用于分析包括参数的数量，频率和振幅的尖峰。 图5提供在胚胎视网膜细胞为xVglut1，Ptf1a，并xGAD67使用探针钙成像和FISH实验的代表性结果。使用MATLAB脚本，选管会的尖峰ĤROI的确定，在实验中可用于所有的ROI和尖峰的数目的平均值。然后从每个实验的平均数量的尖峰可以与其他的实验中被编译，从而在一组实验的平均值。累积分布图可以被创建以显示的分布的平均数目可用于所有的实验组内的尖峰。然后使用MATLAB脚本的数据进行统计分析。

图5示出了有代表性的数据，以下MATLAB分析。简单地说，我们的研究结果表明，活性钙发育调控的，与扣球峰值35期（P <0.002）（ 图5A，5C）。在相关积极的特异性探针与细胞的活性钙，而有差异无统计学意义，但有一个趋势（P = 0.08），阳性细胞xGAD67有区别的GABA能细胞（标记）显示•黑格 ŕ水平比阳性细胞为谷氨酸Ptf1a，一个基因编码转录因子的基因与促进GABAeric表型标记物或钙尖峰活性的。虽然是初步的，这些数据表明，有可能是GABA能细胞，从而发展一个独立的Ptf1a或活动相关的神经递质规格不采取行动的水平Ptf1a。

图1
图1。程序示意图。一旦视网膜组织被解剖和分离，原代细胞培养，可用于各种各样的应用。

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图2。解剖照片。胚胎硫酸耐尔蓝染色，增加对比度。 AE：第一阶段24。 FJ：第一阶段35。 ：OV，视泡，FB，前脑，SC，脊髓;我，中胚层，因此，体节，乐，镜头，CG，水泥腺重，视网膜; EP，上皮较大的数字 。 点击这里 。

图3
图3。细胞培养与投资回报率的图像盘旋。A.明视场。 B.图片FLUO-4与投资回报率（AM）治疗后盘旋。 C. FISH图像（箭头指示的电压门控钙通道CaV2.1的α亚基的阳性细胞的例子）。 D.叠加明场，荧光-4，和FISH图像。

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图4。实施例的一个单细胞的活性（ROI）的钙。剧情的荧光（以相对荧光单位，RFU）与 ​​时间（分钟）从Fluo4钙荧光图像。

图5
图5。结果显示钙扣球的阶段和探头。A.平均人数钙峰值阶段30组（n = 4），35组（n = 8）和38组（n = 13）。 B.钙穗数文化之间的平均数量不同的探针原位杂交级35 xVglut1（N = 3），xGAD67组（n = 3），并Ptf1a组（n = 4）。 C.累积的阶段，30，35，38的平均数的穗数文化在分布图。 D.累积划分情节穗数文化的平均数确定为具有积极的信号， 在原位杂交探针35期; xVglut1，xGAD67，和Ptf1a的细胞。 点击这里为更大的数字 。

探测器 阶段 N（板） N（细胞） ％积极
xGAD67 35 4 1042 2％
38 4 690 2％
Ptf1a 30 3 352 1％
35 6 1856 1％
xVglut1 30 1 47 57％
35 3 692 2％
38 3 364 4％

表1中。阳性细胞百分比。

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Discussion

凭借其良好的特点是保守的细胞类型，在所有脊椎动物中，视网膜提供了一个有用的模型研究细胞的分子过程规范和分化细胞类型。原代细胞培养提供了一个功能强大的方法，调查范围广泛的过程，包括基因表达，蛋白质动力学，钙和电活动在单细胞分辨率水平。在这里，我们提出了一个简单的原代细胞培养技术，从解剖假定视网膜组织在非洲爪蟾 ，特别适合生物体进行此类研究的假定，视网膜是很容易从最早期的发展阶段，原代细胞培养中可能会发生定义的介质组成的一个简单的盐溶液。

虽然很容易适应大多数实验室的设置，有几个步骤，尤其需要密切关注。 Dissecti用新磨的镊子，应进行附加。年轻的阶段（30日）从治疗与细胞培养液中混合胶原酶乙的利益。必须执行所有的步骤，涉及从一个介质的组织或细胞的转移到另一个有特殊护理，以防止进入接近空气 - 溶液界面的组织或细胞。包含组织的吸移管应完全浸没在大量的液体，并与细胞或组织被驱逐非常缓慢。已镀覆后的细胞，包括，Fluo4-AM此外，细胞培养基，或固定洗涤所有的流体转移，必须仔细地进行给定的细胞可以容易脱落。所有细胞培养，无菌关注，所以应注意消毒所有材料。最后，让游离的视网膜植坐的分离介质在指定的时间内为细胞附着成功是至关重要的，以避免结块。

中此协议中描述的解剖和培养条件，坏死和凋亡是非常有限的（小于5％至10％的细胞）。盘上的细胞凋亡（apoptosis）的损耗很少注意到的前和后的共焦成像会话期间。仔细处理的细胞培养，细胞活力的关键。解决方案必须非常缓慢而稳定地进行，以排除细胞坏死和凋亡。虽然划定的精确比例的视网膜细胞类型的实验，目前正在进行中，我们也注意到，出现多种视网膜细胞类型来表示，穆勒的文化和神经胶质细胞（其中有一个独特的形态）中不占主导地位的文化。

板原位杂交实验后进行分析时，一个潜在的问题是，一些细胞可能已经搬走了，但细胞的跟踪程序的使用可能会解决这个问题。此外，原代细胞培养的技术中所固有的，一个主要的限制是日Ê明显下降的空间图案，是目前完整的组织。使用分子检测必须建立在组织中的位置，而不是由单个细胞的身份。但是，该功能还提供机会分析细胞非常准确，在没有持续的细胞 - 细胞相互作用规范的状态。它还允许研究者以选择性地治疗与生长因子或其他化合物的细胞，在来自相邻小区的信号的影响的效果，而无需精确地分析。虽然我们已采用此相关的钙成像与特定的神经递质表型标记视网膜解剖和原代细胞培养技术，这种技术是适应等下游应用领域广泛，包括电生理记录和单细胞基因表达分析，用RT-PCR或“下根“转录组分析（ 图1）。

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Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

我们亲切地感谢约翰·海斯博士脚本，博士。埃里克·布拉德利和克里斯托弗·德尔 - 内格罗共聚焦显微镜的帮助;德鲁·休斯，劳拉ODORIZZI，亚历Garafalo，丽贝卡Lowden，和Liz麦克默里对他们的工作在发展该项目，并提供初步的数据统计分析有用的建议;格雷戈·史密斯博士。这项工作是由美国国立卫生研究院授予（NINDS IR15N5067566 01）MSS和霍华德休斯医学研究所的科学教育补助金的威廉和玛丽学院支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
For Dissections and Culturing
BD Falcon Easy Grip Tissue Culture Dishes, 35 mm Fisher 08-772A
Disposable Polystyrene Petri Dishes, 60 x 15 mm Fisher 0875713A
35 mm Nunclon Surface Petri Dishes (with Airvent) Fisher 12-565-91
Dumont Fine Forceps (Dumostar #55) Fisher NC9341917
Cellattice Micro-ruled plastic coverslip, 25 mm Fisher 50-313-17
Ethyl-m-Aminobenzoate Methanesulfonate Salt (MS-222) MP Biomedicals, LLC 103106
Gentamicin Sulfate Enzo Life Sciences 380-003-G025
Gibco Trypsin (1:250) Powder Life Technologies 27250-018
Collagenase B from Clostridium histolyticum Roche 11088831001
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
Nile Blue Sulfate (optional) Pfaltz Bauer N05550
500 ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 μm Pore 33.2 cm2 CN Membrane Corning 430758
For Calcium Imaging
Fluo-4 AM 1 mM Solution in DMSO, Cell Permanent Life Technologies F-14217
Pluronic F-127 10% Solution in Water Life Technologies P-6866
LSM 510 Confocal Microscope System Zeiss Model Discontinued
Blocking Reagent Roche 11096176001
For Fluorescent in situ hybridization (FISH)
Anti-Digoxigenin-POD, Fab Fragments Roche 11207733910
Anti-DNP-HRP Antibody Perkin-Elmer NEL747A
Cy3 NHS ester GE Healthcare PA13101
NHS-Fluorescein Thermo Scientific 46409
Formamide, Deionized Amresco 0606-950ML
Torula RNA, Type IX Sigma-Aldrich R3629
Heparin Sodium Salt, from Porcine Intestinal Mucosa Sigma-Aldrich H3393-250KU
CHAPS Sigma-Aldrich C3023

Table 2. Specific reagents and equipment.
Solution Reference Contents
Cell Culture Medium Chang and Spitzer , 200954 116 mM NaCl
0.67 mM KCl
2 mM CaCl2
1.31 mM MgSO4
4.6 mM Tris
1 % (v:v) Penicillin/Streptomycin
Adjust pH to 7.8 with HCl.
Filter sterilize by passing through a 0.22 μm CN filter.
Store at 4 °C.
Calcium-Magnesium Free Medium (CMF) Gu et al., 199442; Gu and Spitzer, 199555 116 mM NaCl
0.67 mM KCl
4.6 mM Tris
0.4 mM EDTA
1 % (v:v) Penicillin/Streptomycin
Adjust pH to 7.8 with HCl.
Filter sterilize by passing through a 0.22 μm CN filter.
Store at 4 °C.
Maleic Acid Buffer (MAB) Sive et al., 200053 100 mM maleic acid
150 mM NaCl (pH 7.5).
Marc's Modified Ringers (MMR), 10X Sive et al., 200053 100 mM NaCl
mM KCl
1 mM MgSO4
2 mM CaCl2
5 mM HEPES
pH adjusted to 7.4 with NaOH
0.1X MMR also contains 50 mg/ml gentamicin sulfate and pH is adjusted to 7.4 with NaOH.
MEMFA Solution, 10X Sive et al., 200053 0.1 M MOPS (Ph 7.4)
2 mM EGTA
1 mM MgSO4
3.7% formaldehyde
A 10X solution, without formaldehyde, can be stored at 4 °C. Formaldehyde is added fresh (1/10 volume of a standard 37% stock).
In situ Hybridization Buffer Sive et al., 200053 50% Formamide
5X SSC
1 mg/ml Torula RNA
100 mg/ml Heparin
1X Denhart's Solution
0.1% Tween 20
0.1% CHAPS
10 mM EDTA.

Solutions. *Gentamicin, an antibiotic, is used in our MMR solutions while penicillin and streptomycin are used in our culture media.

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发育生物学，第70期，神经科学，细胞生物学，外科，解剖学，生理学，眼科，视网膜，原代细胞培养，解剖，激光共聚焦显微镜钙成像，荧光
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McDonough, M. J., Allen, C. E., Ng-Sui-Hing, N. K. L. A., Rabe, B. A., Lewis, B. B., Saha, M. S. Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue. J. Vis. Exp. (70), e4377, doi:10.3791/4377 (2012).

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