の解離、文化、および分析 Published: December 23, 2012 doi: 10.3791/4377

DOI

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Molly J. McDonough*¹, Chelsea E. Allen*¹, Ng-Kwet-Leok A. Ng-Sui-Hing¹, Brian A. Rabe¹, Brittany B. Lewis¹, Margaret S. Saha¹

¹Department of Biology, College of William and Mary

* These authors contributed equally

Summary

アフリカツメガエルは、細胞運命の仕様および初代培養細胞内の個々の網膜細胞の生理機能を研究するための理想的なモデルシステムを提供します。ここでは、網膜組織を解剖し、カルシウム活性のために画像化し、in situハイブリダイゼーションにより分析される初代培養細胞を生成するための手法を提示する。

Abstract

神経板の前方領域は脊椎動物の網膜を生じさせることによって、プロセスは、臨床と基礎研究の両方の主要な焦点であり続けている。網膜疾患の理解と治療のための明白な医学的関連に加えて、脊椎動物の網膜の開発は、神経細胞の種類の判定や分化^1-16を理解する上で重要とエレガントなモデルシステムとして機能し続けています。神経網膜には、ステレオタイプのレイヤーに配置された6つの個別の細胞種（神経節、水平、アマクリン視細胞、双極細胞、ミュラーグリア細胞）が、大部分はすべての脊椎動物^12,14-18間で保存されているパターンで構成されています。

無傷の胚で網膜を勉強しながら、明らかにこの複雑な器官が層状構造に前脳の突起から発達する方法、あちこち恩恵多くの質問があります理解するために必要とされるmは推定網膜細胞の初代培養細胞^を用いた^7,19-23アプローチを採用する。たとえば、さまざまな段階で除去され、解離組織から細胞を分析すると、1つは、異なる発達段階で個々のセルの仕様の状態を認識することができ、すなわち、隣接組織^8,19-22との相互作用の非存在下における細胞の運命^,24-33。初代培養細胞はまた、治験責任医師は、特定の試薬 ​​と文化を扱い、単一細胞レベル^{5,8,21,24,27-30,33-39}に結果を分析することができます。 アフリカツメガエルの研究のための古典的なモデル系初期の神経発達^{19,27,29,31-32,40-42は} 、網膜の初代細胞培養^10,38,43-45に特に適したシステムとしての役割を果たします。

推定網膜組織はすぐに神経誘導^25,38,43に続いて、開発の初期段階からのアクセスが可能です。また、与えられた目卵黄の供給が含まれている胚の各セルに、網膜細胞は、このようにインキュベーションや他の血清ベースの製品^10,24,44-45の交絡影響を除去、緩衝塩溶液からなる非常にシンプルに定義された培地で培養することができる。

しかし、周囲の組織とその後の処理から網膜組織の分離は困難である。ここで、我々は、順番に、単一細胞の解像度でカルシウム活性と遺伝子発現について分析される初代培養細胞を調製するために使用されるアフリカツメガエルの網膜の細胞の解離と解離するための方法を提示する。本稿で紹介トピックが自発カルシウムトランジェントの分析ですが、技術が研究課題とアプローチ（ 図1）の広い配列に広く適用可能である。

Protocol

全ての実験は、ウィリアム·アンド·メアリー大学におけるインスティテューショナル·動物実験委員会によって承認されたプロトコルに従って実施されています。このプロトコルで参照発達段階はNieuwkoopとフェーバー⁴⁶によるとされています。

1。解剖

1. 細胞培養培地及び室温になじまカルシウムマグネシウム培地（CMF）を許可します。また、0.1X Marcの改変リンゲル（MMR）のpHは7.4から7.6が必要になります。
2. 細胞培養層流フード内で30分間、UV光を照射することにより、以下の項目を殺菌。 （フードに配置する前に、70％エタノールで各項目をスプレーしてください。）
   • 35ミリメートルプラスチックペトリ皿。
   • 60ミリメートルプラスチックペトリ皿。
   • 35ミリメートルNunclon表面の料理をお楽しみいただけます。
   • 1.5 mlのマイクロチューブ。
   • P1000マイクロピペット（1,000μlのマイクロピペット）。
   • エアゾール耐性P1000ヒント（1,000μlのマイクロピペット用エアゾール耐性チップ）。
   • アルコール耐性のペン。
   • ファイン切開鉗子。
   • * 15 mlコニカルチューブ（のみイメージングカルシウム活性のために）。
   • *カルシウムのみ活性のイメージングのため。
3. フードは紫外線滅菌やソリューションは室温に戻していた後は、ボンネット内の70％エタノールと場所のメディアボトルと手袋とメディアボトルダウンスプレー、フード内で層流をオンにします。
4. フードの内側に適切なラベリングを確保し、 細胞の各プレートにはP1000マイクロピペットで、次の準備をします。
   • 解剖プレート - 10 mlの細胞培養培地を含有するもの60ミリメートルプラスチックシャーレ。
   • 培養プレート -ワン35ミリメートルNunclon表面の皿は2 mlの細胞培養培地を含む。 （Nunclonプラスチック皿はさらに、任意の接着剤で処理されていません。）
   • ひとつ空の1.5 mlのマイクロチューブ外植解離チューブ 。
   • * 1つの15 mlコニカルハヤブサ15 mlの細胞培養培地を含む試験管。過剰Fluo4-AMイメージングカルシウム活性時を洗い流すために。
5. フードの内側には、それぞれの郭セッション用 P1000マイクロピペット（複数の網膜を1つのセッションで解剖することができます）で、次の準備をします。
   • 外植片リンスプレート - 2ミリリットルCMFを含むもの35ミリメートルプラスチックシャーレ。
   • 外植片解離プレート - 2ミリリットルCMFを含むもの35ミリメートルプラスチックシャーレ。
6. フードの外側には、次の準備をします。
   • 10ミリリットル0.1X MMRを含む細胞のプレート当たり一つ60ミリメートルプラスチックシャーレ- プレートを固定している 。
   • 10ミリリットル0.1X MMRを含む細胞のプレート当たり一つ60ミリメートルプラスチックシャーレ- 兄弟プレート 。
   • 麻酔プレート - 10ミリリットル0.1X MMR + 0.5 mg / mlのMS-222（tricaine）を含む解剖セッションごとに1つの60mmのプラスチックシャーレ。
外植解離プレート （0.1％トリプシン溶液を生じる）、混在させる渦にCMFに40μlの5％トリプシンを追加し、脇に置きます。
7. ステージ30歳未満である胚を解剖した場合、 解剖プレート （1 mg / mLのコラゲナーゼB溶液を生じる）、溶解して、脇に置き渦に10mgのコラゲナーゼBを追加。
8. 所望の段階の胚を選択して、非無菌トランスファーピペットで保持プレートに移し、細かい鉗子を用いて卵黄膜（胚はまだ孵化していない場合）を取り外します。
9. いくつかの転送は同じ非無菌トランスファーピペットで兄弟プレートに胚を上演した。
10. 胚はステージ25以前の場合は、非無菌トランスファーピペットで麻酔プレートに胚を転送し、動きや刺激への応答が停止するまで、胚が座ることができそうでなければ、解剖と直接進みます。これは、取ることができる最大1分です。
11. 解剖スコープ（4X目的、10X接眼レンズ）の下で解剖（ 図2）に進みます。

胚の段階では25歳以下：

13. 非無菌トランスファーピペットを用いて解剖皿に胚を移す。
14. 細かい鉗子の2ペアを使用して、後端に始まり、胚の前方部分にセメント腺を通じて継続し、胚の腹側の正中矢状カットを行う。
15. 慎重にカットのエッジのいずれかをつかんで左右拡散によって胚を開きます。 解剖皿に面した背側と胚であり、腹側外胚葉と、この結果は、内胚葉および中胚葉を明らかにするために、オープンに広がった。
16. 内胚葉と中胚葉（ 図2Aおよび2B）を除去し始める。この組織の最初で最大の層が持つ外見が非常に "ふわふわ"です。大型細胞と少し明らか組織。
17. この層を除去した後、体節と脊索が見えるようになります。良好なコントラストは、 解剖皿に戻って転送する前に、10mlの細胞培養培地と2〜3分間ナイルブルー硫酸（水中）の1％溶液の100μlを含む別々の60ミリメートルのプラスチックシャーレに胚を移動します。これは、外胚葉、体節、かつ容易に識別およびオリエンテーションのために脊索を染色する。
18. 胚の前方部分に焦点を当て、慎重に脊索と脳と視神経胞（ 図2C）を露出残っ中胚葉を除去します。
19. 脳と視神経小胞が完全に露出されると、脳へのちょうど後方神経管および基礎となる外胚葉を切断するためにピンセットを使用しています。
20. 外胚葉が上になるように上にこの部分を（脳と視神経胞）を回します。
21. 再び慎重に、基盤となる光ファイバ胞を傷つけないように注意しながら外胚葉（ 図2D）を移動。
22. 最後に、ピンセットを用いて、（ 図2D及び2E）脳から視神経胞を分離します。

ステージ25よりも古い胚の場合：

23. 胚が麻酔プレートになっている間は、鉗子で胚の腹の部分を削除します。
24. 良好なコントラストは、10ミリリットル0.1X MMRと解剖皿に移す前に2〜3分で1％ナイルブルー硫酸100μlを含む60ミリメートルのプラスチックシャーレに胚を移動します。これは、外胚葉を青く染色する。
25. 一度解剖プレートで、網膜（または胚ステージ26から30のために眼胞）（ 図2Fおよび2G）を覆う外胚葉を引き戻す。ナイルブルー硫酸を使用した場合は、外胚葉は青く染色されますが、根本的な網膜組織はしません。
26. FOで慎重網膜または眼胞を削除rceps（ 図2H、2I、および2J）。それは、鉗子の1ペアで固定胚を保持し、網膜や他の眼胞とを削除しておくと便利です。

2。組織や細胞のメッキの解離

重要な注意事項 -組織を転送する場合は、網膜や視神経胞は、任意の気液境界線を接触させないでください、これが発生した場合、細胞は溶解します。

1. 眼胞または網膜を解剖された後、慎重にエアゾール耐性チップを使用してP100のマイクロピペットを用いてプレートをすすぎ、30秒間座ってできるように外植片に転送されます。
2. 外植片解離プレートから外植解離チューブに CMFの0.1％トリプシンの80μlを。
3. P100マイクロピペット及びエアゾール耐性チップを使用し、 外植片から網膜または眼胞を転送すると、 外植片Dissociatiに皿をすすぐTubeで、外植片の転送を回避することは、リンス液。
4. 組織は室温で1時間外植解離チューブで解離することができます。一網膜はプレートごとに使用されました、しかし、我々はそれがプレートあたりのセルの数を増やすことが望まれているなら、複数の当たりプレートを使用することが可能であることに注意してください。
5. プレートの細胞をするには、まずゆっくり外植解離チューブから溶液40μlを削除して、P100マイクロピペット及びエアゾール耐性チップを使用して破棄します。 P100セット〜40μlおよびエアゾール耐性チップを使用して、 培養プレートに細胞を（現在は組織が ​​解離していることを）転送します。プレート上に細胞を吸引するときは、ゆっくりとピペットとプレートの中央に小さな領域で細胞を維持。

注：セルの複数の画像は、実験を通じて取り出される場合、 培養プレートの下面にグリッド（Cellattice）を添付

6. 細胞はNunclon板に付着するために少なくとも1時間静置座ってすることができます。この時間が経過すると、彼らは非常に優しく扱われなければならないか、またはそれらは切り離さになる可能性があります。
7. 細胞と同じ温度で飼育され同胞胚を観察することによって、目的のステージへの培養細胞、。生きた細胞は、さらなる操作のために使用されていない場合は、この時点でMEMFA溶液中に固定することができます。

重要な注意：我々の実験のほとんどは細胞のめっき6時間以内に固定されています。培養中の細胞の寿命は、組織が解剖した段階、細胞内に依然として存在卵黄の量に依存する。年下（神経胚段階）から解剖細胞は細胞から取得しながら、5から6日間培養における健康を維持年上の胚（スイミングオタマジャクシステージは）2-3日間培養中の生のままになります。

3。カルシウムイメージング^47から49

このプロトコルは、個々の細胞内カルシウムトランジェントを定量化するためのカルシウム感受性Fluo4-AMおよび共焦点顕微鏡を利用しています。 Fluo4-AMを使用してすべてのステップがFluo4-AMは光に敏感であるように、光から離れて行われるべきである。すべての洗浄を追加またはP1000マイクロピペット及びエアゾール耐性チップを使用して削除する必要があります。ピペッティングして細胞を乱すことを避けるためにゆっくりとプレートの縁に向かって行われるべきである。培養は、一般的に解剖された6時間内に固定されているため、メディアは変更されません。長期的な文化では、メディアは毎日変更する必要があります。

1. Fluo4-AMは-20℃で保存されており、我々は、5μlのアリコートに格納することをお勧めします。ご使用になる前に、光源から離れFluo4は-AM5μlのアリコートを解凍し、直接このアリコートにプルロニックF-127の2μlを添加する。
2. 所望の時間培養後の細胞（少なくとも1時間）、 培養プレートから細胞培養培地1mlを削除します。穏やかにピペッティングにより混合、Fluo4-AMおよびプルロニックにこれを追加します。
3. 徐々に結像される細胞の培養プレートの端に戻ってこのソリューションのすべてを転送し、Fluo4-AMを吸収するために1時間静置この溶液中の細胞を残す。
4. 洗い流すように、培養した細胞からFluo4-AM過剰、次の洗浄シリーズを完了して下さい：
   • プレートから培地を1mlを削除します。
   • 板に新鮮な細胞培養培地3mlを（15 mlコニカルチューブから）を追加します。
   • 2追加の洗浄を実行するたびに徐々にプレートから溶液3mlを除去し、新鮮な細胞培養培地3mlを加える。
5. 細胞は、今では細胞培養培地4mlになるとFluo4-AMを含むべきである。 Fluo4-AMは酵素的に細胞から拡散したり、膜に結合した区画に、それを防止する、セル内に一度切断される。 文化を汚染するのマーカー粒子を防ぐためにカバーを保ちながら、イメージングのための共焦点顕微鏡のステージ上にプレートをセットする前に、皿の上に永久的なマーカーで赤い縦線を引きます。縦線は、シャーレ（ペトリ皿で​​はなく、蓋の底）の側を下に描かれている。その目的は、個々の細胞の正確な向きや位置が後の時点で再確立することができるように、視野に関して培養プレートの方向を示すことである。
6. プレートは現在、イメージングのための共焦点顕微鏡のステージ上にロードするための準備ができています。共焦点顕微鏡（対物20X）を走査レーザーで明るいフィールドの設定を用いて細胞を可視化する。後でSi中の後に撮像する際の文化に簡単に同一視野を見つけるようにするCellaticeカバースリップ上で大規模なグリッド番号が含まれてい視野で、好ましくは、塊を含まない密な細胞の面積を求めよTUハイブリダイゼーション。イメージングに先立ち、文化を通じてダウン焦点を当て、細胞培養の位置と向きを情報として記録する細胞下のグリッドの明視野像を取る。これは、その後の分析のための細胞の再編成が可能になります。
7. 焦点面を上げて始めてカルシウムイメージング（ 図3A）に先立って細胞の明視野像をキャプチャします。
8. セルの中心面が合うと、プレートはカルシウム活性のイメージングのための準備ができています。設定は、顕微鏡やアプリケーションによって異なります。我々は、画像次のパラメータを使用して、1,2、または12時間アルゴン488nmレーザーを用いて細胞を：
   • 1時間の画像 ：
     • アルゴン488nmレーザーは最大30mWの電力の4％でスキャンします。
     • 毎4秒（時間あたり900スキャン）を1回スキャンします。
   • 2時間の画像：
     • アルゴン488nmレーザーは最大30mWの電力の4％でスキャンします。
     • 一度のスキャン8秒（時間当たり450スキャン）。
   • 12時間の画像：
     • アルゴン488nmレーザーは最大30mWの電力の2％でスキャンします。
     • 一回ごとに48秒（時間あたり75スキャン）をスキャンします。

これらのパラメータは、それぞれの時間枠は900静止フレーム画像のセットになります。カルシウム活性は、その後、ImageJの⁵⁰のような画像処理アプリケーションを用いて、経時画像（ 図3B）の上に蛍光レベルを分析することによって、記録することができます。

4。細胞を固定する

1. イメージング後、細胞をプレートから溶液3mlを除去し、培地の残りの1 mlに1ミリリットル2X MEMFAを追加することで、30分間固定することができます。
2. 固定後、MEMFAを削除し、各1ミリリットルの容積、5分間の一連の洗浄で細胞を脱水する：
   • 1Xリン酸緩衝食塩水（PBS）で25％エタノール。
   • 1X PBSで50％エタノール。
   <SDDは、H ₂ O（滅菌脱イオン蒸留水）中のLi> 75％エタノール。
   • -20℃で1ミリリットルの100％エタノールと店舗プレートと最後の洗浄を交換

注意：メタノールはまた、これらの洗浄用とストレージ用に使用することができます。

5。 蛍光 in situハイブリダイゼーション （FISH）

文化はアンダーソンラボ⁵²で概説されるように、細胞培養用の修正と^51に記載され^ているよう^に 、アフリカツメガエルのための標準FISHプロトコルを使用して測定することができる。アンダーソンラボプロトコルへの変更は以下のとおりです。特記のない限り、すべての洗浄は、約1mlのボリュームに35ミリNunclonプレート上で実施しています。ソリューションは、Sive らで定義されています⁵³特に断りのない限り。

重要な注意：結像するために細胞にin situハイブリダイゼーションを行う際にフルオレセイン標識RNAプローブを使用しないでくださいカルシウム活性。抗フルオレセイン抗体は残留に結合する細胞内Fluo4-AMおよび文化内のすべてのセルにおける正の信号を発生することがあります。

1日目：透過化とハイブリダイゼーション

1. 補水洗浄をストレージに使う脱水溶媒に等級付けされるべきである。私たちの実験では、洗浄液を1X PBSでエタノールに等級付けされた。
2. 水分補給後、室温で5分間ずつ細胞を1X PBSでさらに3回洗浄する。
3. ファルコンチューブ内で無水酢酸の62.5μlの0.1 Mトリエタノールアミン液（pH8.0）25mlを混合し、すばやくとしてアンダーソンラボ⁵²プロトコルで議論を徹底的に分散するまで混ぜる。室温で10分間、この混合物中で培養する。無水酢酸処理後、室温で5分間1X生理食塩クエン酸ナトリウム（SSC）で細胞を洗浄する。
4. 最後のSSC洗浄を外し、細胞を透過するために10分間、0.2MのHCl（SDD H ₂ O中）と交換します</ LI>
5. 5分間1X PBSで2回洗浄してHClを洗い流す。
6. 60℃で6時間の最小振とう水浴中CでISHバッファにプレハイブリダイゼーションが、これは深刻な信号を減少させるように一晩プレハイブリダイゼーションしていません。
7. 希釈されたプローブ750μlの（精製プローブから1:250希釈）で8月14日時間60℃で一晩ハイブリダイズする。 1.0から1.5μg/μLのからプローブ濃度範囲を精製した。

2日目：バインドされていないプローブと抗体とのインキュベーションの除去

8. プローブを取り出し、60℃の0.2X SSCで5分間培養をすすぎ℃に60℃で1時間、新鮮0.2X SSCで洗う
9. 水浴から文化を取り外し、それらを5分間室温に調整することができます。
10. 室温で5分間0.2X SSCですすいでください。
11. 0.1％トリトンX-100（PBT）で1X PBSで15分間洗浄する。
12. 内因性ペルオキシダーゼを不活性化するために、PBTの2％H ₂ O ₂溶液で1時間洗浄してください。
13. 室温で1時間マレイン酸バッファー（MAB）の2％ブロッキング試薬でブロックします。我々は、このブロッキングメソッドがPBTで20％羊血清でブロッキングの従来の方法と比較して感度を増加させることを見出した。
14. 4℃で一晩、POD標識抗体の1:1000希釈を含むMABの2％ブロッキング試薬1mlの培養する

3日目：非結合抗体を除去し、蛍光発生

16. 抗体溶液を除去し、室温で5分間、TBSTで3回すすいでください。
17. 継続的に遅い速度で揺らしながら室温で15分間、TBSTで4回洗浄する。
18. 10分間室温でのPBTで2回洗浄する。
19. 1:200フルオレセインチラミドまたはPBT中に希釈したCy3 1時25チラミド750μlを適用します。室温で5分間インキュベートし、2.5μlの0.3％H _2を追加2。開発するための信号を可能にするために40分間ロック。
20. 振盪しながら室温でTBSTで15分間ずつ、少なくとも4回洗浄する。
21. 信号が完全に開発されたら、1X PBTで5分間洗浄します。
22. 4℃、室温で1時間と1X PBSでストア用の1X MEMFAに修正

6。画像FISH結果とカルシウムイメージングデータの共同登録

1. FISHの完了時に、細胞培養プレートは、細胞が特定のプローブのための肯定的な蛍光シグナルを表示するかを決定するために結像される。カルシウムイメージング中に研究ビューの正確なフィールドを見つけて、カルシウムの画像フレームの方向にプレートを揃えるCellatticeカバースリップを使用しています。
2. セルの中心面にフォーカスし、その最大1 mWのパワー（ 図3C）の15％がヘリウム、ネオンのHeNe 543 nmのレーザーを使用して、単一の高解像度の画像を撮影する。
3. カルシウムイメージングプロトコルから撮影した画像の元の900フレームセットで、画像処理プログラム（例えばImageJの⁵⁰など）を使用することにより、目的の領域（ROI）などの個々の細胞を識別します。時間蛍光ペア ​​値（ 図4）を表すデータ点の集合としてのROI蛍光データを抽出します。
4. カルシウム画像（ 図3D）から同定されたROIとFISH結果の画像を重ね合わせる。
5. 、プローブの正のプローブに負、または不明として、各ROIを登録 - ROIに対応するセルがもはや魚の画像の視野内で検出できなかった場合はインチ
6. 異なる解剖の段階（ 図5Aおよび5C）または異なるFISHプローブ（ 図5Bおよび図5D）陽性細胞間カルシウム活性レベルを比較する統計解析スクリプトを（MATLABまたは他のプログラミング言語を介して設計）を使用してプロセスのROI蛍光データ。私たちの研究室で使用されるすべてのスクリプトは、ご要望に応じて自由に利用可能です。

Representative Results

首尾よく解剖オプティック胞（ステージ25）、網膜（ステージ35）の例は2Eおよび2J図に示されている。このプロトコルは、開発のさまざまな段階で使用することができますが、それはさらなる実験のために正確さを保証する唯一の網膜組織を得ることが重要です。慎重にすべての段階で表皮を取り除き、あなたの鉗子は網膜組織を穿刺しないことを確認してください。ステージ35歳以上では、レンズ、網膜の上に透明なレイヤーとして見ることができると鉗子を用いて慎重に削って除去することができる。

首尾よくメッキ初代培養細胞は 、 図3Aに示されている。組織を解離するときに、リンス液に解離するから組織を防ぐために推奨される30秒のインキュベーション時間よりも長くすすぎ液中に網膜外植片を残さないことが重要です。さらに、組織は完全な時間のためにトリプシン溶液中で解離することが許可されていることを確認培養プレート中の細胞の均一な分布を可能にするために（古い胚および幼虫期はさらに長く必要になるかもしれない。）細胞がメッキされたら板を移動させ、プレートから細胞を洗浄避けるためにソリューションを変更する際には注意が必要です。

図3Bおよび3Cはそれぞれ、in situハイブリダイゼーション実験におけるカルシウム活性スキャンおよび蛍光（FISH）からの画像を示しています。カルシウムイメージに明るい緑色で表示された細胞は、内部カルシウム貯蔵の放出の結果として細胞内カルシウム濃度の一過性スパイクを受けている細胞である。次いで、細胞を、FISH法を用いた遺伝子発現についてアッセイすることができ、遺伝子発現パターンは、イメージ（ 図3D）を重ね合わせることでカルシウムスパイク活動のパターンに相関させることができる。 PythonとMATLABスクリプト（ご要望に応じて自由に利用できる）の組み合わせを使用して、データは各individuの蛍光活性を分析することによって得られるイメージングの過程を通じて興味のアル領域（ROI）。イメージングの1時間以上の個々の細胞回収率（ROI）のためのカルシウムの活動の一例を図4に示します。スパイクは、イメージングの約57分で表示されます。 表1において、種々のプローブのための陽性細胞の割合のための代表的なデータが示されており、文献で ​​報告され、この実験（我々の現在の実験のポイントは、これらのパーセンテージを決定することである）に特異的なデータはないものの、我々の調査結果はと一致している脊髄^17,55,56におけるカルシウム活性に関する実験同様のタイプのデータ。

分析のために利用されるパラメータは、数、頻度、およびスパイクの振幅が含まれています。 図5を xVglut1、Ptf1a、とxGAD67用プローブを用いた胚性網膜細胞内カルシウムイメージングとFISH実験の代表的な結果を提供します。 MATLABスクリプト、EACのためのスパイク数を使用してhのROIが決定され、スパイクの数は、実験のすべてのROIのために平均化されます。各実験からスパイクの平均数は、その後の実験群の平均で、その結果、他の実験でコンパイルすることができます。累積分布プロットは、グループ内のすべての実験のスパイク数の平均値の分布を表示するために作成することができます。 MATLABスクリプトは、データの統計的分析のために使用されます。

図5は、MATLAB解析、以下の代表的データを示しています。簡単に言えば、我々の結果はスパイクステージ35でピークに達して、カルシウム活性が発生的に調節されていることを示した（p <0.002）（ 図5Aおよび図5C）。統計学的に有意な差はなかったものの、特定のプローブのための陽性細胞でカルシウム活性の相関をとるという点では、しかしhigheを表示するxGAD67（分化GABA作動性細胞のマーカー）陽性の細胞のための傾向（P = 0.08）であったグルタミン酸作動性マーカー、またはPtf1a、GABAeric表現型を促進すると相関転写因子遺伝子をコードする遺伝子陽性細胞よりもカルシウムスパイク活動のrレベル。予備的には、これらのデータはPtf1aまたはその活性依存性神経伝達物質の仕様に依存しない方法で開発するGABA作動性細胞が存在する可能性があることを示唆しているがPtf1aのレベルで動作していません。

図1。手続きの概略図はいったん網膜組織を切開され、解離、初代培養細胞は、多種多様なアプリケーションに使用することができます。

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図2。解剖写真である。胚は増加コントラストナイルブルー硫酸で染色した。 AE：ステージ24。 FJ：ステージ35。略語：OV、眼胞、FB、前脳、SC、脊髄、私、中胚葉、そう、体節、LE、レンズ、CG、セメント腺、再度、網膜、EP、上皮。 拡大図はこちらをクリックしてください 。

図3。 ROIを持つ細胞培養の画像は丸。A.明視野。 ROIを持つのFluo-4（AM）の治療後のB.画像は丸。 CでのFISH画像（矢印は電位依存性カルシウムチャネルCaV2.1のαサブユニットの陽性細胞の例を示す）。明視野のD.オーバーレイ、Fluo-4を、魚の画像。

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図4。単一細胞率（ROI）のカルシウム活性の例。Fluo4カルシウム蛍光画像から蛍光（相対蛍光単位で、RFU）対時間（分単位）のプロット。

図5。結果は、ステージとプローブによってカルシウムスパイクが表示されます。A.平均30段階（n = 4）で、35℃でカ​​ルシウムスパイクの数（n = 8）、38（n = 13）であった。 Bの平均ステージ35 xVglut1（n = 3）の時に、in situハイブリダイゼーションに使用される様々なプローブ間の文化あたりのカルシウムスパイク数、xGAD67（n = 3）であり、Ptf1a（n = 4）であった。ステージ30、35、38の文化当たりスパイクの平均数のC.累積分布プロット。 D.累積distributi正のステージ35でin situハイブリダイゼーションプローブのための信号があると判断された細胞の培養当たりスパイクの平均数のプロット上; xVglut1、xGAD67、とPtf1aを拡大図はこちらをクリックしてください 。

プローブ	ステージ	N（プレート）	n個（セル）	正パーセント
xGAD67	35	4	1042	二パーセント
	38	4	690	二パーセント
Ptf1a	30	3	352	一パーセント
	35	6	1856	一パーセント
xVglut1	30	1	47	57パーセント
	35	3	692	二パーセント
	38	3	364	4パーセント

表1パーセント陽性細胞。

Discussion

すべての脊椎動物全体で保存されており、その十分に特徴付けられた細胞の種類によって、網膜は細胞型仕様と分化を支配する分子細胞過程を研究するための有用なモデルを提供します。初代培養細胞は、遺伝子発現、蛋白質のダイナミクス、およびカルシウム、単一細胞の解像度レベルでの電気的活動を含むプロセスの広い範囲を調査するための強力な方法を与える。ここでは、 アフリカツメガエルにおける解剖推定網膜組織からの初代細胞培養のための簡単な手法を提示し、推定網膜が発達し、その初代細胞培養のごく初期の段階から容易にアクセス可能であることを与えられたこのような研究のために特に適した生物がで発生する可能性があります単純な食塩水から成る定義されたメディア。

ほとんどの実験室の設定に容易に適応が、特に細心の注意を必要とするいくつかの手順があります。 Dissectiアドオンは新鮮尖っ鉗子を用いて実施されるべきである。若い段階（<聖30）細胞培養培地と混合コラゲナーゼBと治療の恩恵を受ける。別のメディアから組織や細胞の移転を伴うすべての手順は、空気 - 溶液界面の近傍に入ってくるから組織や細胞を防止するために特別な注意を払って行う必要があります。組織を含むピペットは完全流体の十分に浸漬し、細胞または組織は非常にゆっくりと追放されるべきである。細胞がメッキされた後、Fluo4-AM加えて、細胞培養培地、または固定の洗浄を含め、すべての流体転送は、慎重に細胞が外れやすくすることができることを考えると実行する必要があります。すべての細胞培養と同様に、無菌性が懸念されるので、注意がすべての材料を殺菌するために取られるべきである。最後に、解離網膜外植片は、解離培地中で指定された時間枠に座っせることは成功した細胞接着のために重要であり、ダマにならないようにするために。

間にこのプロトコールに記載切開および培養条件、壊死とアポトーシスの両方を非常に（セル未満の5〜10％）に制限されています。プレート上の細胞（アポトーシス）の損失は、めったに事前および事後の共焦点イメージングセッション中に気づいていません。慎重に培養細胞を処理すると、細胞の生存への鍵となります。ソリューションの変更は、細胞壊死およびアポトーシスを阻止するために、非常にゆっくりと着実に実行する必要があります。網膜の細胞型の正確な比率を線引きする実験が現在進行中であるが、我々は網膜の細胞型の様々な文化で表現されるように見えることと、ミュラーグリア細胞が（これは明確な形態​​を持っている）の文化で支配的ではないことに注意してやる。

in situハイブリダイゼーション実験で後にプレートを分析する潜在的な懸念は、細胞の一部が移動した可能性がありますが、これは細胞追跡プログラムを使用してアドレス指定されるかもしれないということです。また、初代細胞培養の技術に内在する、主要な制限は番目です無傷の組織に存在している空間的なパターニングのe明白損失。個々の細胞のアイデンティティは、組織内の位置によって分子アッセイを使用してではなく、確立されなければならない。ただし、この機能はまた、細胞は非常に正確に、そして継続的な細胞間相互作用の非存在下での仕様の状態を分析する機会を提供しています。また、治験責任医師は、選択的に成長因子または他の化合物と細胞を治療することを可能にし、正確に隣接セルからの信号の影響を受けずに効果を分析。我々は特定の神経伝達物質の表現型マーカーを用いてカルシウムイメージングを相関させるために、この網膜切開および初代細胞培養技術を用いているが、この技術は、電気生理学的記録及びRT-PCRを用いた単一細胞遺伝子発現アッセイを含む他の下流の幅広いアプリケーションに適応可能か "の横にある-genは"トランスクリプトーム解析（ 図1）。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
For Dissections and Culturing
BD Falcon Easy Grip Tissue Culture Dishes, 35 mm	Fisher	08-772A
Disposable Polystyrene Petri Dishes, 60 x 15 mm	Fisher	0875713A
35 mm Nunclon Surface Petri Dishes (with Airvent)	Fisher	12-565-91
Dumont Fine Forceps (Dumostar #55)	Fisher	NC9341917
Cellattice Micro-ruled plastic coverslip, 25 mm	Fisher	50-313-17
Ethyl-m-Aminobenzoate Methanesulfonate Salt (MS-222)	MP Biomedicals, LLC	103106
Gentamicin Sulfate	Enzo Life Sciences	380-003-G025
Gibco Trypsin (1:250) Powder	Life Technologies	27250-018
Collagenase B from Clostridium histolyticum	Roche	11088831001
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Nile Blue Sulfate (optional)	Pfaltz Bauer	N05550
500 ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 μm Pore 33.2 cm2 CN Membrane	Corning	430758
For Calcium Imaging
Fluo-4 AM 1 mM Solution in DMSO, Cell Permanent	Life Technologies	F-14217
Pluronic F-127 10% Solution in Water	Life Technologies	P-6866
LSM 510 Confocal Microscope System	Zeiss	Model Discontinued
Blocking Reagent	Roche	11096176001
For Fluorescent in situ hybridization (FISH)
Anti-Digoxigenin-POD, Fab Fragments	Roche	11207733910
Anti-DNP-HRP Antibody	Perkin-Elmer	NEL747A
Cy3 NHS ester	GE Healthcare	PA13101
NHS-Fluorescein	Thermo Scientific	46409
Formamide, Deionized	Amresco	0606-950ML
Torula RNA, Type IX	Sigma-Aldrich	R3629
Heparin Sodium Salt, from Porcine Intestinal Mucosa	Sigma-Aldrich	H3393-250KU
CHAPS	Sigma-Aldrich	C3023
Table 2. Specific reagents and equipment.
Solution Reference Contents Cell Culture Medium Chang and Spitzer , 200954 116 mM NaCl 0.67 mM KCl 2 mM CaCl2 1.31 mM MgSO4 4.6 mM Tris 1 % (v:v) Penicillin/Streptomycin Adjust pH to 7.8 with HCl. Filter sterilize by passing through a 0.22 μm CN filter. Store at 4 °C. Calcium-Magnesium Free Medium (CMF) Gu et al., 199442; Gu and Spitzer, 199555 116 mM NaCl 0.67 mM KCl 4.6 mM Tris 0.4 mM EDTA 1 % (v:v) Penicillin/Streptomycin Adjust pH to 7.8 with HCl. Filter sterilize by passing through a 0.22 μm CN filter. Store at 4 °C. Maleic Acid Buffer (MAB) Sive et al., 200053 100 mM maleic acid 150 mM NaCl (pH 7.5). Marc's Modified Ringers (MMR), 10X Sive et al., 200053 100 mM NaCl mM KCl 1 mM MgSO4 2 mM CaCl2 5 mM HEPES pH adjusted to 7.4 with NaOH 0.1X MMR also contains 50 mg/ml gentamicin sulfate and pH is adjusted to 7.4 with NaOH. MEMFA Solution, 10X Sive et al., 200053 0.1 M MOPS (Ph 7.4) 2 mM EGTA 1 mM MgSO4 3.7% formaldehyde A 10X solution, without formaldehyde, can be stored at 4 °C. Formaldehyde is added fresh (1/10 volume of a standard 37% stock). In situ Hybridization Buffer Sive et al., 200053 50% Formamide 5X SSC 1 mg/ml Torula RNA 100 mg/ml Heparin 1X Denhart's Solution 0.1% Tween 20 0.1% CHAPS 10 mM EDTA. Solutions. *Gentamicin, an antibiotic, is used in our MMR solutions while penicillin and streptomycin are used in our culture media.