Summary
Xenopus laevis er et ideelt modelsystem til at studere celle-skæbne specifikation og fysiologiske funktion af individuelle retinale celler i primær cellekultur. Her præsenteres en teknik til dissekering retinale væv og frembringelse af primære cellekulturer, der er afbildet for calcium-aktivitet og analyseret ved in situ hybridisering.
Abstract
Den proces, hvorved det forreste område af den neurale plade giver anledning til vertebrat retina fortsat et vigtigt fokus for både kliniske og grundforskning. Ud over den åbenlyse medicinsk betydning for forståelse og behandling af retinal sygdom, fortsætter udviklingen af hvirveldyr retina at tjene som et vigtigt og elegant modelsystem for forståelse neuronal celletype bestemmelse og differentiering 1-16. Den neurale nethinde består af seks adskilte celletyper (ganglion, amacrine, vandret, fotoreceptorer, bipolære celler, og Müller gliaceller) arrangeret i stereotype lag, et mønster, der i høj grad konserveret blandt alle hvirveldyr 12,14-18.
Mens de studerer nethinden i den intakte udviklingen af embryoet klart er nødvendig for at forstå, hvordan dette komplekse organ udvikler sig fra et fremspring af forhjernen ind i en lagdelt struktur, der er mange spørgsmål, som gavner from beskæftiger tilgange anvender primær cellekultur af formodede nethindeceller 7,19-23. For eksempel muliggør analyse af celler fra væv udtages og dissocieres på forskellige stadier til at skelne tilstanden af specifikationen af individuelle celler på forskellige udviklingsstadier, dvs skæbne af cellerne i fravær af interaktioner med tilstødende væv 8,19-22 ,24-33. Primær cellekultur tillader også investigator at behandle kulturen med specifikke reagenser og analysere resultaterne på en enkelt celle niveau 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, en klassisk model-system til undersøgelse af tidlige neural udvikling 19,27,29,31-32,40-42, tjener som en særlig egnet system til retinal primær cellekultur 10,38,43-45.
Antageligt retinavæv er tilgængelig fra de tidligste stadier af udvikling, umiddelbart efter neural induktion 25,38,43. I betragtning thved hver celle i embryoet indeholder en forsyning af æggeblomme, kan retinale celler dyrkes på en meget enkel definerede medier bestående af en pufret saltopløsning, som eliminerede de forstyrrende virkninger af inkubering eller andre sera-baserede produkter 10,24,44-45 .
Imidlertid er isolering af retinavæv fra omgivende væv og efterfølgende bearbejdning vanskelig. Her præsenteres en fremgangsmåde til dissektion og dissociering af retinale celler i Xenopus laevis, der anvendes til at fremstille primære cellekulturer, der på sin side skal analyseres for calcium-aktivitet og-genekspression ved opløsning af enkeltceller. Mens emnet i dette papir er analysen af spontane calcium transienter, teknikken er bredt anvendelig til en bred vifte af forsknings-spørgsmål og tilgange (figur 1).
Protocol
Alle forsøg udføres efter protokoller, som er godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på College of William and Mary. Udviklingsstadier omtalt i denne protokol er ifølge Nieuwkoop og Faber 46.
1. Dissection
- Tillade celledyrkningsmedium og Calcium Magnesium Free Medium (CMF) at ækvilibrere til stuetemperatur. Du skal også bruge 0,1 X Marc Modified Ringers (MFR) pH 7,4-7,6.
- Steriliser følgende elementer ved anvendelse af et UV-lys i 30 minutter i en cellekultur laminært stinkskab. (Spray hvert element med 70% ethanol før det kommes i hætten.)
- 35 mm plastik petriskåle.
- 60 mm plastik petriskåle.
- 35 mm Nunclon overflade retter.
- 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- P1000 mikropipette (1.000 pi mikropipette).
- Aerosol resistente P1000 tips (1.000 gl mikropipette aerosol resistente tips).
- Alkoholresistent pen.
- Fine dissekering pincet.
- * 15 ml koniske rør (kun til afbildning calcium aktivitet).
- * Kun til billeddannelse af calcium aktivitet.
- Når kalechen er UV steriliseret og løsninger har opnået stuetemperatur, tænde for laminar luftstrøm i hætten, sprøjte ned handsker og medier flasker med 70% ethanol og sted medier flasker i hætten.
- Inde i hætten forberede følgende med P1000 mikropipette for hver plade af celler, sikrer passende mærkning.
- En 60 mm plast petriskål indeholdende 10 ml cellekulturmedium - Dissection Plate.
- En 35 mm Nunclon overflade skål indeholdende 2 ml cellekulturmedium - Kultur Plate. (Nunclon plastskåle ikke yderligere behandles med selvklæbende.)
- En tom 1,5 ml mikrocentrifugerør-Eksplantation Dissociation Tube.
- * En 15 ml konisk falkrør indeholdende 15 ml celledyrkningsmedium. Til vask af overskydende Fluo4-AM når imaging calcium aktivitet.
- Inde i hætten, forberede følgende med en P1000 mikropipette for hver dissektion session (mere end én nethinden kan dissekeres i en session).
- En 35 mm plast petriskål indeholdende 2 ml CMF - Eksplantation Skyl Plate.
- En 35 mm plast petriskål indeholdende 2 ml CMF - Eksplantation Dissociation Plate.
- Uden hætten forberede følgende:
- En 60 mm plast petriskål per plade af celler indeholdende 10 ml 0,1 X MMR - Holding Plate.
- En 60 mm plast petriskål per plade af celler indeholdende 10 ml 0,1 x MMR - Søskende Plate.
- En 60 mm plastik petriskål per dissektion session indeholdende 10 ml 0,1 X MMR + 0,5 mg / ml MS-222 (tricaine) - bedøvelse Plate.
- Hvis dissekering et foster, der er yngre end stadie 30, tilsættes 10 mg Collagenase B til Dissektion Plate (hvilket resulterer i en 1 mg / ml Collagenase B-opløsning), hvirvel at opløse og der er afsat.
- Vælg et embryon af den ønskede scene, overførsel til holdepladen med et ikke-sterilt transfer pipette, og fjern vitellinmembranen (hvis fosteret endnu ikke har udklækket) ved hjælp af fine tænger.
- Overføre flere identisk iscenesat embryoner til Sibling Plate med en ikke-steril transfer pipette.
- Hvis fosteret er trin 25 eller tidligere, skal du fortsætte direkte med dissektion, ellers overføre embryonet til bedøvelse Plate med en ikke-steril overførselspipetten og lade foster til at sidde indtil bevægelse og respons på stimuli ophører. Dette kunne tageop til et minut.
- Fortsæt med dissektion (figur 2) under et dissektionsmikroskop (4X mål, 10X okular).
For embryoner trin 25 eller yngre:
- Overfør foster til Dissektion Plate med en ikke-steril transfer pipette.
- Ved hjælp af to par af fine tænger, gøre en midsagittal snit på den ventrale side af embryonet, begynder den bageste ende og videre gennem cementen kirtel i den forreste del af embryoet.
- Åbn forsigtigt foster ved at tage fat på en af kanterne af snittet og sprede venstre og højre. Dette resulterer i et foster med den dorsale side, der vender ind i Dissection Plate, og den ventrale ektoderm spredes åben for at vise endoderm og mesoderm inden.
- Begynde at fjerne den endoderm og mesoderm (fig. 2A og 2B). Det første og største lag af dette væv er meget "fnugagtigt" i udseende medstore celler og lidt indlysende organisation.
- Efter fjernelse dette lag vil somitter og notochord bliver synlige. For bedre kontrast, flyttes embryonet til et separat 60 mm plastik petriskål indeholdende 10 ml celledyrkningsmedium og 100 pi 1% opløsning af Nile Blue-sulfat (i vand) i 2-3 min før overførsel tilbage til Dissection Plate. Dette vil plette ectoderm, somitter, og notochord for lettere identifikation og orientering.
- Med fokus på den forreste del af embryonet, fjernes forsigtigt rygstrengen og eventuelt tilbageværende mesoderm udsætte hjernen og optiske vesikler (figur 2C).
- Når hjernen og optiske vesikler helt udsættes for, brug af tangen at adskille neuralrøret og underliggende ektoderm lige bagved hjernen.
- Drej denne del (hjernen og optiske vesikler) over så ectoderm er øverst.
- Pas på ikke at beskadige de underliggende optiske vesikler, re omhyggeligtflytte ektoderm (figur 2D).
- Endelig giver pincet, adskille de optiske vesikler fra hjernen (fig. 2D og 2E).
For embryoner ældre end trin 25:
- Mens fosteret er i bedøvelse Plate, fjerne den ventrale del af embryoet med pincet.
- For bedre kontrast, flyttes embryonet til en 60 mm plastik petriskål indeholdende 10 ml 0,1 X MFR og 100 pi 1% Nile Blue-sulfat i 2-3 min før overførsel til Dissection Plate. Dette vil plette ectoderm blå.
- Når i Dissection Plate, trække sig tilbage ectoderm overliggende nethinden (eller optiske vesikel for embryoner trin 26-30) (Figur 2F og 2G). Hvis Nile Blue-sulfat blev anvendt, vil ectoderm farves blå, men det underliggende retinavæv ikke.
- Fjern nethinden eller optiske vesikel forsigtigt med forceps (fig. 2h, 2i og 2j). Det er nyttigt at holde embryo på plads med en tang og fjern retina eller optiske vesikel med den anden.
2. Dissociation af væv og Plating af celler
Vigtig Note - Når du overfører væv, tillader ikke nethinden eller optiske vesikel at røre luft-væske grænser, hvis dette sker cellerne vil lysere.
- Når den optiske vesikel eller nethinden er blevet dissekeret, forsigtigt overført til eksplantatet Skyl Plade med en P100 mikropipette med aerosol resistente tips og lad det sidde i 30 sek.
- Overfør 80 ul 0,1% trypsin i CMF fra eksplantatet Dissociation Plate til Eksplantation Dissociation Tube.
- Ved hjælp af en P100 mikropipette og aerosol-resistente tips, overføre nethinden eller optiske vesikel fra eksplantatet Skyl pladen til Eksplantation Dissociatipå Tube, skylles undgå overførsel af eksplantaterne løsning.
- Tillade vævet at dissociere i Eksplantation Dissociation rør i 1 time ved stuetemperatur. En retina blev anvendt per plade, men vi bemærke, at det er muligt at anvende mere end en per plade, hvis det ønskes at forøge antallet af celler per plade.
- Til plade cellerne langsomt først fjerne 40 ul af opløsningen fra eksplantatet Dissociation Tube og kassér bruge en P100 mikropipette og aerosol-resistente tips. Ved hjælp af en P100 indstillet til 40 ul og aerosol-resistente tips, overføre cellerne (nu at vævet har dissocieret) til Kultur Plate. Når udsugning af cellerne på pladen, pipetteres langsomt og holde cellerne i et lille område i midten af pladen.
Bemærk: Hvis flere billeder af de celler der skal tages under forsøget, vedhæfte et gitter (Cellattice) til undersiden af dyrkningspladen
- Lad cellerne til at sidde uforstyrret i mindst 1 time til at klæbe til Nunclon plade. Efter dette tidspunkt skal de behandles meget forsigtigt, eller de kunne løsne sig.
- Kultur celler til den ønskede scene ved at observere søskende embryoner, der er opdrættet ved samme temperatur som cellerne. Hvis levende celler ikke anvendes til yderligere manipulation, kan de fastsættes i MEMFA opløsning på dette tidspunkt.
Vigtigt: De fleste af vores eksperimenter er fastsat inden for 6 timer af udpladning af cellerne. Levetiden for de celler i kultur er afhængig af det trin, hvor vævet blev dissekeret og mængden af æggeblomme stadig er til stede i cellerne, cellerne dissekeret fra yngre (neurula trin) forbliver sunde i kultur i 5-6 dage, mens celler erhvervet fra ældre embryoner (svømning haletudseetaper) vil forblive levedygtig i kultur i 2-3 dage.
3. Calcium Imaging 47-49
Denne protokol udnytter calcium-sensitive Fluo4-AM og konfokal mikroskopi at kvantificere calcium transienter i individuelle celler. Alle trin med Fluo4-AM bør udføres væk fra lys, som Fluo4-AM er lysfølsomt. Alle vaskninger skal tilføjes eller fjernes ved hjælp af en P1000 mikropipette og aerosol-resistente tips. Pipettering skal ske langsomt, og ud mod kanten af pladen for at undgå at forstyrre cellerne. Medie er ikke ændret, fordi kulturerne generelt fastsættes inden 6 timer for at blive dissekeret. For mere langsigtede kulturer, bør medierne ændres dagligt.
- Fluo4-AM opbevares ved -20 ° C, og vi foreslår lagring i 5 ul portioner. Før brug tø en 5 gl aliquot af Fluo4-AM væk fra lys og der tilsættes 2 pi af Pluronic F-127 direkte til denne alikvot.
- Efter dyrkning af cellerne for det ønskede tidsrum (mindst1 time), fjernes 1 ml af celledyrkningsmediet fra dyrkningspladen. Tilføje dette til Fluo4-AM og Pluronic, blandes ved forsigtig pipettering.
- Langsomt overføre hele denne opløsning tilbage til kanten af dyrkningspladen af cellerne, der skal afbildes og lade cellerne i denne opløsning uforstyrret i 1 time til at absorbere Fluo4-AM.
- At udvaske overskydende Fluo4-AM fra cellekulturmediet, udfyld den følgende vask serien:
- Fjern 1 ml medium fra pladen.
- Tilsæt 3 ml frisk celledyrkningsmedium (fra 15 ml konisk rør) til pladen.
- Udføre to yderligere vaskninger, hver gang langsomt fjerne 3 ml opløsning fra pladen og tilsætning af 3 ml frisk celledyrkningsmedium.
- Cellerne bør nu være i 4 ml celledyrkningsmedium og indeholder Fluo4-AM. Fluo4-AM er enzymatisk spaltet en gang inde i cellen og forhindrer det i at diffundere ud af cellen eller i en membranbundne rum. Før du lægger pladen ind på scenen af den konfokal mikroskop til billeddannelse, tegne en lodret rød linje med permanent markør på fad og samtidig holde låg på at forhindre markørpartikler i at forurene kulturen. Den lodrette linje trækkes langs siden af petriskålen (bunden af petriskålen ikke låget). Dens formål er at angive orienteringen af dyrkningspladen med hensyn til synsfeltet, således at præcis orientering og tilpasning af de individuelle celler kan genindføres på et senere tidspunkt.
- Pladen er nu klar til lastning på trin af konfokalt mikroskop til imagografi. Visualiser de celler ved hjælp af de lyse feltindstillingerne på en laserscanning konfokal mikroskop (mål 20X). Finde et område af tætte celler, der ikke indeholder klumper, fortrinsvis med et synsfelt, der indeholder de store grid tal på Cellatice dækglas at gøre finde det samme synsfelt lettere senere, når billeddannelse kulturen efter i situ-hybridisering. Forud for billeddannelse, koncentreres ned gennem kulturen og tage et lyst felt billede af gitteret under cellerne til at registrere placeringen og orienteringen af cellekulturen. Dette giver mulighed for justering af celler til efterfølgende analyse.
- Hæv brændplanet og indfange et lyst felt billede af cellerne før påbegyndelse af calcium imaging (figur 3A).
- Når midterplanet af cellerne er i fokus, er pladen klar til billeddannelse af calcium-aktivitet. Indstillinger vil variere afhængigt af mikroskopet og anvendelse. Vi billede cellerne under anvendelse af en argon 488 nm laser for 1, 2 eller 12 timer med de følgende parametre:
- 1 time billeder:
- Argon 488 nm laser scanner på 4% af sin maksimale 30 mW effekt.
- Scan én gang hver 4 sek (900 scanninger pr time).
- 2 hr billeder:
- Argon 488 nm laser scanner på 4% af sin maksimale 30 mW effekt.
- Scan gang8 sek (450 scanninger pr time).
- 12 timer billeder:
- Argon 488 nm laser scanner til 2% af sin maksimale 30 mW effekt.
- Scanne én gang hver 48 sekund (75 scanninger per time).
- 1 time billeder:
Disse parametre vil resultere i et sæt af 900 Standbillede billeder for hver tidsramme. Calcium-aktivitet kan derefter registreres ved at analysere niveauer af fluorescens over tidsforløbet billeder (figur 3B) under anvendelse af et billedbehandlingsprogram såsom ImageJ 50.
4. Fastsættelse Celler
- Efter billeddannelse kan celler fastsættes i 30 minutter ved at fjerne 3 ml opløsning fra pladen og tilsætning af 1 ml 2X MEMFA til den resterende 1 ml kulturmedier.
- Efter fiksering fjernes MEMFA og dehydrere cellerne med en serie af 5 minutters vaske, hver et volumen på 1 ml:
- 25% ethanol i 1X phosphatpufret saltvand (PBS).
- 50% ethanol i 1X PBS. <li> 75% ethanol i SDD H2O (sterilt deioniseret destilleret vand).
- Erstatte den sidste vask med 1 ml 100% ethanol og opbevares plade ved -20 ° C.
Bemærk: Methanol kan også anvendes til disse vaske og oplagring.
5. Fluorescerende in situ-hybridisering (FISH)
Kulturer kan analyseres under anvendelse af standard-FISH protokollen for Xenopus som beskrevet 51 med modifikationer for cellekultur som beskrevet af Anderson Lab 52. Ændringer til Anderson Lab-protokollen, er angivet nedenfor. Alle vaske foregår på 35 mm Nunclon plader i mængder på cirka 1 ml, medmindre andet er angivet. Opløsninger er som defineret i Sive et al. 53 medmindre andet er angivet.
Vigtigt: Brug ikke fluoresceinmærkede RNA-prober, når du udfører in situ hybridisering på celler afbildet forcalciumaktivitet. Anti-fluorescein-antistoffer vil binde til resterende Fluo4-AM i cellerne og kan forårsage positivt signal i alle celler i kulturen.
Dag 1: permeabilisering og hybridisering
- Rehydrering vasker bør gradueres til dehydrering opløsningsmiddel, der anvendes til opbevaring. For vores eksperimenter blev vaske gradueret til ethanol i 1X PBS.
- Efter rehydrering, cellerne vaskes yderligere tre gange i 1X PBS i 5 minutter hver ved stuetemperatur.
- Bland 25 ml 0,1 M triethanolamin (pH 8,0) med 62,5 ul eddikesyreanhydrid i et Falcon-rør og hurtigt blandes indtil det er helt dispergeret som beskrevet i Anderson Lab 52-protokollen. Inkuber kulturer i denne blanding i 10 minutter ved stuetemperatur. Efter eddikesyreanhydrid behandling celler vaskes i 1X saltvand natriumcitrat (SSC) i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern den sidste SSC vask og erstat med 0,2 M HCl (i SDD H2O) i 10 minutter for at permeabilisere cellerne. </ Li>
- Skyl HCI med to vaske i 1X PBS for 5 min.
- Prehybridize i ISH puffer ved 60 ° C i et rystevandbad i mindst 6 timer, men ikke prehybridize natten over som det stærkt formindsker signal.
- Hybridiseres natten over ved 60 ° C i 8-14 timer i 750 pi af fortyndet probe (1:250 fortynding fra en oprenset probe). Den oprensede probe koncentrationsområder fra 1,0 til 1,5 pg / pl.
Dag 2: Fjernelse af Ubundet Probe og antistof Inkubation
- Fjern sonden og skylles kulturer i 5 min i 0,2 X SSC ved 60 ° C. Vask med fersk 0,2 X SSC i 1 time ved 60 ° C.
- Fjern kulturer fra vandbadet og tillade dem at tilpasse sig stuetemperatur i 5 min.
- Skylning i 0,2 X SSC ved stuetemperatur i 5 min.
- Vask i 15 minutter i 1 X PBS med 0,1% Triton-X-100 (PBT).
- For at inaktivere endogene peroxidaser, vask i 1 time i en 2% H2O 2-opløsning i PBT.
- Blok i 2% blokeringsreagens i maleinsyre Buffer (MAB) i 1 time ved stuetemperatur. Vi har konstateret, at denne blokering fremgangsmåde øger følsomheden i forhold til tidligere fremgangsmåder til blokering i 20% fåreserum i PBT.
- Inkuber kulturer i 1 ml 2% blokeringsreagens i MAB indeholdende en 1:1000 fortynding af et POD-konjugerede antistof natten over ved 4 ° C.
Dag 3: Fjernelse af ubundet antistof og Fluorescence Development
- Fjern antistofopløsning og skylles 3 gange i TBST i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Vask 4 gange med TBST i 15 minutter ved stuetemperatur, medens kontinuerligt rocking ved lav hastighed.
- Vaskes to gange i PBT ved stuetemperatur i 10 min.
- Anvende 750 ul 1:200 fluorescein-tyramid eller 1:25 Cy3 tyramid fortyndet i PBT. Inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur, og der tilsættes 2,5 pi 0,3% H2O 2. Rock i 40 min for at tillade signal at udvikle.
- Vask mindst 4 gange i 15 minutter hver i TBST ved stuetemperatur med omrystning.
- Når signalet er fuldt udviklet, vaskes i 5 min i 1X PBT.
- Fix i 1X MEMFA i 1 time ved stuetemperatur og opbevares i 1 X PBS ved 4 ° C.
6. Billede FISH Resultater og Co-register med Calcium billeddata
- Efter afslutning af FISH, er cellekulturplader afbildes at bestemme, hvilke celler udviser et positivt fluorescerende signal for en given probe. Brug Cellattice dækglas at finde den nøjagtige synsfelt undersøgt under calcium billeddannelse og bringe pladen til orienteringen af calcium billedrammer.
- Fokus på midterplanet af cellerne og tage en enkelt billede i høj opløsning ved hjælp af Helium-Neon HeNe 543 nm laser til 15% af sin maksimale 1 mW effekt (figur 3C).
- I den oprindelige 900 rammen sæt af billeder taget fra Calcium Imaging-protokol,identificere individuelle celler som områder af interesse (ROI'er) ved anvendelse af et billedbehandlingsprogram (f.eks ImageJ 50). Udtrække ROI fluorescensdata som et sæt af datapunkter, der repræsenterer tid-fluorescens pair-værdier (fig. 4).
- Overlejre FISH resultater billedet med den identificerede ROIs fra calcium billeder (figur 3D).
- Registrere hver ROI som positive for sonden, negative for proben, eller ukendt - i tilfælde af at cellen, der svarer til ROI ikke længere kan findes inden for synsfeltet af FISH billedet.
- Proces ROI fluorescens data ved hjælp af statistisk analyse scripts (som designet gennem MATLAB eller andet programmeringssprog) at sammenligne calcium aktivitetsniveau blandt forskellige dissekerede stadier (fig. 5A og 5C) eller celler positive for forskellige fisk sonder (figur 5B og 5D). Alle scripts, der anvendes i vores laboratorium er frit tilgængelige efter anmodning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eksempler på vellykket dissekeret optiske vesikler (trin 25) og retinae (trin 35) er vist i figur 2E og 2J. Mens denne protokol kan bruges på forskellige udviklingsstadier, er det vigtigt at opnå kun retinavæv for at sikre nøjagtighed til yderligere forsøg. Fjern forsigtigt epidermis i alle faser og sikre, at dine pincet ikke punktere retinavæv. I trin 35 eller ældre, kan linsen ses som et klart lag på toppen af nethinden og kan fjernes ved forsigtig skrabning ved hjælp af pincet.
En vellykket udpladet primær cellekultur er vist i figur 3A. Når dissociere væv, er det vigtigt ikke at lade den retinale eksplantat i skylleopløsningen længere end den anbefalede 30 sek inkubationstid for at forhindre, at vævet adskilles i skylleopløsningen. Derudover sikre, at vævet er tilladt at dissociere i trypsinopløsning for en hel time(Ældre embryonisk og larvestadier kan kræve endnu længere) for at muliggøre en jævn fordeling af celler i kulturen pladen. Når cellerne udplades, udvise forsigtighed, når bevæge pladen og ændre løsninger for at undgå vask af cellerne fra pladen.
3B og 3C viser billeder fra calciumaktivitet scanning og fluorescerende in situ hybridiseringsforsøg (FISH), hhv. Celler, der vises lysegrønne i calcium billedet er celler, der undergår en forbigående stigning i intracellulære calciumniveauer som et resultat af frigivelsen af interne calcium butikker. Celler kan derefter undersøges for genekspression ved hjælp af FISH, og genekspressionsmønstre kan korreleres til mønstre af calcium spiking aktivitet ved at overlejre billeder (figur 3D). Ved hjælp af en kombination af Python og MATLAB scripts (frit tilgængelige efter anmodning), er data opnået ved at analysere den fluorescens aktivitet af hver indivial-regionen af interesse (ROI) gennem løbet af billeddannelse. Et eksempel på calcium-aktivitet for en individuel celle (ROI) i løbet af 1 time til afbildning er vist i figur 4, en pig er synlig på omkring 57 minutter for billeddannelse. I tabel 1 er repræsentative data for den procentdel af celler positive for forskellige prober er vist, medens der ikke er nogen data vedrørende dette eksperiment er rapporteret i litteraturen (punktet af vores nuværende forsøg er at bestemme disse procentsatser), vores resultater stemmer overens med data fra lignende typer af dyreforsøg i forbindelse med calcium-aktivitet i rygmarven 17,55,56.
Parametre anvendt til analyse omfatter antallet, frekvensen og amplituden af pigge. Figur 5 viser repræsentative resultater af calcium billeddannelse og FISH eksperimenter i embryonale retinaceller under anvendelse af prober for xVglut1, Ptf1a, og xGAD67. Ved hjælp af MATLAB scripts, antallet af spikes for ØKh ROI bestemmes, og antallet af spidser er gennemsnit for alle ROI'er i eksperimentet. Det gennemsnitlige antal pigge fra hvert eksperiment kan derefter kompileres med andre eksperimenter, resulterede i gennemsnittet for en gruppe af eksperimenter. Kumulative fordeling plots kan oprettes for at vise fordelingen af det gennemsnitlige antal pigge til alle forsøg i en gruppe. MATLAB scripts anvendes derefter til statistisk analyse af data.
Figur 5 viser repræsentative data efter MATLAB-analyse. Kort beskrevet vores resultater viser, at calcium-aktivitet udviklingsmæssigt reguleret, med spiking toppede ved trin 35 (p <0,002) (figur 5A og 5C). Med hensyn til at korrelere calcium-aktivitet med celler positive for en specifik probe, mens der ikke var nogen statistisk signifikant forskel, der var imidlertid en tendens (p = 0,08) for celler, positive for xGAD67 (en markør for differentierede GABAerge celler) for at vise highe r niveauer af calcium spiking aktivitet end celler positive for et glutamat markør eller for Ptf1a, et gen, der koder en transkriptionsfaktor gen korreleret med fremme GABAeric fænotype. Selv om foreløbig, antyder disse data, at der kan være GABAerge celler, der udvikler sig på en måde, uafhængig af Ptf1a, eller at aktiviteten-afhængig neurotransmitter specifikation ikke handler på niveau med Ptf1a.
Figur 1. Proceduremæssig skematisk. Når retinalt væv dissekeres og dissocieres, primær cellekultur kan anvendes til en lang række formål.
s.jpg "/>
Figur 2. Dissektionsværktøj fotografier. Embryoner blev farvet i Nile Blue Sulfate for øget kontrast. AE: Stage 24. FJ: Stage 35. Forkortelser:. Ov, optiske vesikel, fb, forhjerne, sc, rygmarv, mig, mesoderm, og så, somitter, le, linse, cg, cement kirtel, re, nethinden, EP, epitel Klik her for større figur .
Figur 3. Billeder af cellekultur med ROI'er cirkel. A. Lyse felt. B. Billede efter Fluo-4 (AM) behandling med ROI'er cirkel. C. FISH billede (pilene angiver eksempler på celler, positive for alfa-subunit'en af den spændingsfølsomme calciumkanal CaV2.1). D. Overlay af lyse felt, Fluo-4, og fisk billeder.
7/4377fig4.jpg "alt =" Figur 4 "fo: indhold-bredde =" 3.5in "fo: src =" / files/ftp_upload/4377/4377fig4highres.jpg "/>
Figur 4. Eksempel calcium aktivitet for en enkelt celle (ROI). Plot af fluorescensen (i relative fluorescensenheder, RFU) mod tiden (i minutter) fra en Fluo4 calcium fluorescensbillede.
Figur 5. Resultater viser calcium spiking ved scenen og sonde. A. Gennemsnitlige antal calcium pigge på trin 30 (n = 4), 35 (n = 8), og 38 (n = 13). B. Gennemsnitligt antal calcium spidser pr kultur blandt forskellige prober, der anvendes til in situ hybridisering ved trin 35 xVglut1 (n = 3), xGAD67 (n = 3), og Ptf1a (n = 4). C. kumulativ fordeling afbildning af det gennemsnitlige antal pigge pr kultur i trin 30, 35, 38. D. Kumulativ DISTRIBUTIpå grund af det gennemsnitlige antal af pigge pr kultur for celler, er identificeret som havende positivt signal for den in situ hybridiseringsprober på scenen 35. xVglut1, xGAD67, og Ptf1a Klik her for større figur .
| Probe | Stage | n (plader) | n (celler) | Procent Positiv |
| xGAD67 | 35 | 4 | 1042 | 2% |
| 38 | 4 | 690 | 2% | |
| Ptf1a | 30 | 3 | 352 | 1% |
| 35 | 6 | 1856 | 1% | |
| xVglut1 | 30 | 1 | 47 | 57% |
| 35 | 3 | 692 | 2% | |
| 38 | 3 | 364 | 4% | |
Tabel 1. Procent positive celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med sine velkarakteriserede celletyper, som er konserveret i alle hvirveldyr, giver nethinden en nyttig model til at studere de molekylære-cellulære processer, der styrer celletype specifikation og differentiering. Primær cellekultur giver en effektiv metode til at undersøge en lang række processer, herunder genekspression, protein-dynamik, og calcium og elektriske aktivitet på niveau med enkeltcelle-opløsning. Her præsenterer vi en enkel teknik til primær cellekultur fra dissekeret formodede retinavæv i Xenopus laevis, en særdeles medgørlige organisme til sådanne undersøgelser, da den formodede nethinden er let tilgængeligt fra de allertidligste faser af udvikling, og at primær cellekultur kan forekomme i en definerede medier bestående af en enkel saltopløsning.
Selv let at tilpasse til de fleste laboratoriet indstillinger, er der flere trin, der kræver en særlig opmærksomhed. Dissections bør udføres med frisk skærpet pincet. Yngre faser (<st. 30) gavn af behandling med Collagenase B blandet med cellekulturmediet. Alle trin, der involverer overførslen af væv eller celler fra et medie til en anden skal udføres med særlig omhu for at forhindre væv eller celler kommer i nærheden af det luft-opløsning-grænsefladen. Pipetten indeholdende vævet skal være fuldt nedsænket i masser af væske og cellerne eller vævet udvist meget langsomt. Efter at cellerne er blevet udpladet, alle væske overførsler herunder, Fluo4-AM tilsætning og celledyrkningsmedium eller fiksering vaskninger, omhyggeligt udføres da celler kan let fjernes. Som med alle cellekultur, er sterilitet bekymring, så der skal sørges for at sterilisere alle materialer. Endelig lader de dissocierede retinale eksplantater sidde for udpegede tidsperspektiv i dissociation medium er kritisk for en vellykket cellebinding og undgå klumpning.
Underdissektion og dyrkningsbetingelser beskrevet i denne protokol, både nekrose og apoptose er meget begrænset (mindre end 5-10% af cellerne). Tab af celler på pladen (apoptose) er sjældent bemærket i løbet af før og efter konfokal afbildning sessioner. Håndtering cellekulturer omhyggeligt er nøglen til cellelevedygtighed. Løsning ændringer skal udføres meget langsomt og støt at udelukke celle nekrose og apoptose. Mens forsøg at afgrænse den præcise forhold af retinale celletyper er igangværende, vi gøre opmærksom på, at en række forskellige retinale celletyper synes at være repræsenteret i kulturerne, og at Muller glia-celler (som har en udpræget morfologi) ikke er dominerende i kulturerne .
Et potentielt problem, når man analyserer plader efter in situ hybridiseringsforsøg er, at nogle af cellerne kan have flyttet, men dette kan ske ved anvendelse af celle sporingsprogrammer. Også forbundet med teknikken med primær cellekultur, en væsentlig begrænsning er the indlysende tab af fysisk mønster, som er til stede i intakt væv. Identiteten af individuelle celler skal etableres ved hjælp af molekylære assays stedet for position i vævet. Men denne funktion giver også mulighed for at undersøge situationen med angivelse af celler meget præcist og i mangel af fortsatte celle-celle interaktioner. Det giver også investigator til selektivt at behandle cellerne med vækstfaktorer eller andre forbindelser og præcist analysere effekten uden påvirkning af signaler fra naboceller. Mens vi har anvendt denne retinal dissektion og primær cellekultur teknik til korrelering af calcium billeddannelse med særlige neurotransmitter fænotype markører, denne teknik kan tilpasses til en lang række andre downstream anvendelser, herunder elektrofysiologiske optagelser og enkeltcelle-genekspression assays under anvendelse af RT-PCR eller "næste -gen "transkriptom-analyse (figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi allernådigst takker Dr. John Hayes for scripts, Drs. Eric Bradley og Christopher Del Negro for at få hjælp med konfokal mikroskopi, Drew Hughes, Laura Odorizzi, Alex Garafalo, Rebecca Lowden, og Liz MacMurray for deres arbejde med at udvikle projektet og levere foreløbige data, Dr. Greg Smith for nyttige forslag om statistisk analyse. Dette arbejde blev støttet af en NIH tilskud (NINDS IR15N5067566-01) til MSS og en Howard Hughes Medical Institute Science Education Grant til College of William and Mary.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||||||||||||||||||||
| For Dissections and Culturing | ||||||||||||||||||||||||
| BD Falcon Easy Grip Tissue Culture Dishes, 35 mm | Fisher | 08-772A | ||||||||||||||||||||||
| Disposable Polystyrene Petri Dishes, 60 x 15 mm | Fisher | 0875713A | ||||||||||||||||||||||
| 35 mm Nunclon Surface Petri Dishes (with Airvent) | Fisher | 12-565-91 | ||||||||||||||||||||||
| Dumont Fine Forceps (Dumostar #55) | Fisher | NC9341917 | ||||||||||||||||||||||
| Cellattice Micro-ruled plastic coverslip, 25 mm | Fisher | 50-313-17 | ||||||||||||||||||||||
| Ethyl-m-Aminobenzoate Methanesulfonate Salt (MS-222) | MP Biomedicals, LLC | 103106 | ||||||||||||||||||||||
| Gentamicin Sulfate | Enzo Life Sciences | 380-003-G025 | ||||||||||||||||||||||
| Gibco Trypsin (1:250) Powder | Life Technologies | 27250-018 | ||||||||||||||||||||||
| Collagenase B from Clostridium histolyticum | Roche | 11088831001 | ||||||||||||||||||||||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | ||||||||||||||||||||||
| Nile Blue Sulfate (optional) | Pfaltz Bauer | N05550 | ||||||||||||||||||||||
| 500 ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 μm Pore 33.2 cm2 CN Membrane | Corning | 430758 | ||||||||||||||||||||||
| For Calcium Imaging | ||||||||||||||||||||||||
| Fluo-4 AM 1 mM Solution in DMSO, Cell Permanent | Life Technologies | F-14217 | ||||||||||||||||||||||
| Pluronic F-127 10% Solution in Water | Life Technologies | P-6866 | ||||||||||||||||||||||
| LSM 510 Confocal Microscope System | Zeiss | Model Discontinued | ||||||||||||||||||||||
| Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | ||||||||||||||||||||||
| For Fluorescent in situ hybridization (FISH) | ||||||||||||||||||||||||
| Anti-Digoxigenin-POD, Fab Fragments | Roche | 11207733910 | ||||||||||||||||||||||
| Anti-DNP-HRP Antibody | Perkin-Elmer | NEL747A | ||||||||||||||||||||||
| Cy3 NHS ester | GE Healthcare | PA13101 | ||||||||||||||||||||||
| NHS-Fluorescein | Thermo Scientific | 46409 | ||||||||||||||||||||||
| Formamide, Deionized | Amresco | 0606-950ML | ||||||||||||||||||||||
| Torula RNA, Type IX | Sigma-Aldrich | R3629 | ||||||||||||||||||||||
| Heparin Sodium Salt, from Porcine Intestinal Mucosa | Sigma-Aldrich | H3393-250KU | ||||||||||||||||||||||
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023 | ||||||||||||||||||||||
Table 2. Specific reagents and equipment. |
||||||||||||||||||||||||
Solutions. *Gentamicin, an antibiotic, is used in our MMR solutions while penicillin and streptomycin are used in our culture media. |
||||||||||||||||||||||||
References
- Horder, T. J., Spitzer, J. L. Absence of cell mobility across the retina in Xenopus laevis embryos. J. Physiol. 233, 33p-34p (1973).
- Hollyfield, J. G., Rayborn, M. E., Sarthy, P. V., Lam, D. M. The emergence, localization and maturation of neurotransmitter systems during development of the retina in Xenopus laevis. I. Gamma aminobutyric acid. J. Comp. Neurol. 188, 587-598 (1979).
- Hamm, H. E., Menaker, M. Retinal rhythms in chicks: circadian variation in melantonin and serotonin N-acetyltransferase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 77, 4998-5002 (1980).
- Szaro, B., Ide, C., Kaye, C., Tompkins, R. Regulation in the neural plate of Xenopus laevis demonstrated by genetic markers. J. Exp. Zool. 234, 117-129 (1985).
- Holliday, J., Spitzer, N. C. Spontaneous calcium influx and its roles in differentiation of spinal neurons in culture. Dev. Biol. 141, 13-23 (1990).
- Marsh-Armstrong, N., McCaffery, P., Gilbert, W., Dowling, J. E., Drager, U. C. Retinoic acid is necessary for development of the ventral retina in zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 7286-7290 (1994).
- Feller, M. B. The role of nAChR-mediated spontaneous retinal activity in visual system development. J. Neurobiol. 53, 556-567 (2002).
- Wang, S. W., Mu, X., Bowers, W. J., Klein, W. H. Retinal ganglion cell differentiation in cultured mouse retinal explants. Methods. 28, 448-456 (2002).
- Perkins, B. D., Nicholas, C. S., Baye, L. M., Link, B. A., Dowling, J. E. dazed gene is necessary for late cell type development and retinal cell maintenance in the zebrafish retina. Dev. Dyn. 233, 680-694 (2005).
- Zaghloul, N. A., Moody, S. A. Changes in Rx1 and Pax6 activity at eye field stages differentially alter the production of amacrine neurotransmitter subtypes in Xenopus. Mol. Vis. 13, 86-95 (2007).
- Wang, C. T., et al. GABA(A) receptor-mediated signaling alters the structure of spontaneous activity in the developing retina. J. Neurosci. 27, 9130-9140 (2007).
- Dullin, J. P., et al. Ptf1a triggers GABAergic neuronal cell fates in the retina. BMC Dev. Biol. 7, 110 (2007).
- Martins, R. A., Pearson, R. A. Control of cell proliferation by neurotransmitters in the developing vertebrate retina. Brain Res. 1192, 37-60 (2008).
- Sanes, J. R., Zipursky, S. L. Design principles of insect and vertebrate visual systems. Neuron. 66, 15-36 (2010).
- Graw, J. Eye development. Curr. Top Dev. Biol. 90, 343-386 (2010).
- Feller, M. B., Sun, Y. H. Introduction to special issue on retinal development. Dev. Neurobiol. 71, 1131-1132 (2011).
- Borodinsky, L. N., et al. Activity-dependent homeostatic specification of transmitter expression in embryonic neurons. Nature. 429, 523-530 (2004).
- Blankenship, A. G., Feller, M. B. Mechanisms underlying spontaneous patterned activity in developing neural circuits. Nat. Rev. Neurosci. 11, 18-29 (2010).
- Evers, J., et al. Studies of nerve-muscle interactions in Xenopus cell culture: analysis of early synaptic currents. J. Neurosci. 9, 1523-1539 (1989).
- Spitzer, N. C., Gu, X. Purposeful patterns of spontaneous calcium transients in embryonic spinal neurons. Semin. Cell Dev. Biol. 8, 13-19 (1997).
- Dyer, M. A., Cepko, C. L. p57(Kip2) regulates progenitor cell proliferation and amacrine interneuron development in the mouse retina. Development. 127, 3593-3605 (2000).
- Harris, R. E., Coulombe, M. G., Feller, M. B. Dissociated retinal neurons form periodically active synaptic circuits. J. Neurophysiol. 88, 188-195 (2002).
- Feller, M. B. Retinal waves drive calcium transients in undifferentiated retinal cells. Focus on "spontaneous waves in the ventricular zone of developing mammalian retina". J Neurophysiol. 91, 1940 (2004).
- Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 73, 1641-1645 (1976).
- Grant, P., Rubin, E., Cima, C. Ontogeny of the retina and optic nerve in Xenopus laevis. I. Stages in the early development of the retina. J. Comp. Neurol. 189, 593-613 (1980).
- Harris, W. A., Holt, C. E., Smith, T. A., Gallenson, N. Growth cones of developing retinal cells in vivo, on culture surfaces, and in collagen matrices. J. Neurosci. Res. 13, 101-122 (1985).
- Tabti, N., Poo, M. M. Study on the induction of spontaneous transmitter release at early nerve-muscle contacts in Xenopus cultures. Neurosci. Lett. 173, 21-26 (1994).
- Lin, W., Szaro, B. G. Neurofilaments help maintain normal morphologies and support elongation of neurites in Xenopus laevis cultured embryonic spinal cord neurons. J. Neurosci. 15, 8331-8344 (1995).
- Rettig, J., et al. Alteration of Ca2+ dependence of neurotransmitter release by disruption of Ca2+ channel/syntaxin interaction. J. Neurosci. 17, 6647-6656 (1997).
- Firth, S. I., Feller, M. B. Dissociated GABAergic retinal interneurons exhibit spontaneous increases in intracellular calcium. Vis. Neurosci. 23, 807-814 (2006).
- Root, C. M., Velazquez-Ulloa, N. A., Monsalve, G. C., Minakova, E., Spitzer, N. C. Embryonically expressed GABA and glutamate drive electrical activity regulating neurotransmitter specification. J. Neurosci. 28, 4777-4784 (2008).
- Xiao, Q., Xu, L., Spitzer, N. C. Target-dependent regulation of neurotransmitter specification and embryonic neuronal calcium spike activity. J. Neurosci. 30, 5792-5801 (2010).
- Nicol, X., Hong, K. P., Spitzer, N. C. Spatial and temporal second messenger codes for growth cone turning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13776-13781 (2011).
- Bixby, J. L., Spitzer, N. C. The appearance and development of neurotransmitter sensitivity in Xenopus embryonic spinal neurones in vitro. J. Physiol. 353, 143-155 (1984).
- Hightower, L. E., Renfro, J. L. Recent applications of fish cell culture to biomedical research. J. Exp. Zool. 248, 290-302 (1988).
- Meyer-Franke, A., Kaplan, M. R., Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Characterization of the signaling interactions that promote the survival and growth of developing retinal ganglion cells in culture. Neuron. 15, 805-819 (1995).
- Feller, M. B., Delaney, K. R., Tank, D. W. Presynaptic calcium dynamics at the frog retinotectal synapse. J. Neurophysiol. 76, 381-400 (1996).
- Green, C. B., Liang, M. Y., Steenhard, B. M., Besharse, J. C. Ontogeny of circadian and light regulation of melatonin release in Xenopus laevis embryos. Brain Res. Dev. Brain Res. 117, 109-116 (1999).
- Jadhav, A. P., Mason, H. A., Cepko, C. L. Notch 1 inhibits photoreceptor production in the developing mammalian retina. Development. 133, 913-923 (2006).
- Sakaguchi, D. S., Murphey, R. K., Hunt, R. K., Tompkins, R. The development of retinal ganglion cells in a tetraploid strain of Xenopus laevis: a morphological study utilizing intracellular dye injection. J. Comp. Neurol. 224, 231-251 (1984).
- Hartenstein, V. Early neurogenesis in Xenopus: the spatio-temporal pattern of proliferation and cell lineages in the embryonic spinal cord. Neuron. 3, 399-411 (1989).
- Gu, X., Olson, E. C., Spitzer, N. C. Spontaneous neuronal calcium spikes and waves during early differentiation. J. Neurosci. 14, 6325-6335 (1994).
- Charnas, L. R., Szaro, B. G., Gainer, H. Identification and developmental expression of a novel low molecular weight neuronal intermediate filament protein expressed in Xenopus laevis. J. Neurosci. 12, 3010-3024 (1992).
- Gomez, T. M., Harrigan, D., Henley, J., Robles, E. Working with Xenopus spinal neurons in live cell culture. Methods Cell Biol. 71, 129-156 (2003).
- Lewis, B. B., et al. Cloning and characterization of voltage-gated calcium channel alpha1 subunits in Xenopus laevis during development. Dev. Dyn. 238, 2891-2902 (2009).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. The stages of Xenopus embryonic development. Normal Table of Xenopus laevis. , North Holland Publishing Company. (1994).
- Foldes-Papp, Z., Demel, U., Tilz, G. P. Laser scanning confocal fluorescence microscopy: an overview. Int. Immunopharmacol. 3, 1715-1729 (2003).
- Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy. J. Microsc. 228, 390-405 (2007).
- Smith, C. L. Basic confocal microscopy. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 14, Unit 14 11 (2008).
- Abaramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Davidson, L. A., Keller, R. E. Neural tube closure in Xenopus laevis involves medial migration, directed protrusive activity, cell intercalation and convergent extension. Development. 126, 4547-4556 (1999).
- In Situ Hybridization Protocols [Internet]. , Available from: http://wmc.rodentia.com/docs/Big_In_Situ.html (1995).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Chang, L. W., Spitzer, N. C. Spontaneous calcium spike activity in embryonic spinal neurons is regulated by developmental expression of the Na+, K+-ATPase beta3 subunit. J. Neurosci. 29, 7877-7885 (2009).
- Gu, X., Spitzer, N. C. Distinct aspects of neuronal differentiation encoded by frequency of spontaneous Ca2+ transients. Nature. 375, 784-787 (1995).
- Rosenberg, S. S., Spitzer, N. C. Calcium signaling in neuronal development. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 3, a004259 (2011).
